加入2ml DMEM培养液(含10% FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1_X ImmX Imm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到10mm培养皿中，于5% CO2培养箱中在37°C条件下培养。2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5% FBS、I % ECGS)，培养液以每隔48h更换I次培养基继续培养，72h后移除组织块，更换培养基，继续培养；一般培养3-5天后，细胞可以汇合成单层，可用于培养P3代细胞；原代细胞培养4天后，细胞汇合成单层，进行传代培养；弃去培养瓶中的培养液，用PBS溶液洗涤I遍，加入1.5mL 0.125%的胰酶消化，显微镜下见细胞开始皱缩变圆时，吹打培养瓶瓶底使细胞完全脱壁，加入适量含血清培养基终止消化；将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min ;弃上清，用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔2换液I次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2 X 106个细胞，一管加APC标记抗人⑶31抗体，另一管加同型阴性对照，4°C避光孵育30min ；PBS洗涤，1000转/min，离心1min ;弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；流式细胞仪检测细胞纯度，培养的PMVECs纯度高达99.22%。
[0020]实施例3
[0021]取四周龄的SD大鼠，雌雄皆可，按照50mg/kg比例腹腔注射2%戊巴比妥钠，麻醉后，胸腹部剃毛后在超净台内用75%酒精进行胸腹部的擦拭消毒，打开腹腔，腹主静脉放血并换打开胸腔，剪去左心耳，放出肺循环中的血液；取出心肺，放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中洗涤三次，每次Imin ;除去心脏，将肺组织移入新的DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中进行清洗2次，清洗后，将肺组织移入干燥培养皿中，加DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，以刚没过肺脏为宜，用细弯镊撕去肺表面的胸膜，剪下2-3_宽的肺外边缘组织块；将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10% FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1_X ImmX Imm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到10mm培养皿中，于5% CO2培养箱中在37°C条件下培养。2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5% FBS、I % ECGS)，培养液以每隔48h更换I次培养基继续培养，72h后移除组织块，更换培养基，继续培养；一般培养3-5天后，细胞可以汇合成单层，可用于培养P3代细胞；原代细胞培养5天后，细胞汇合成单层，进行传代培养；弃去培养瓶中的培养液，用PBS溶液洗涤I遍，加入1.5mL 0.125%的胰酶消化，显微镜下见细胞开始皱缩变圆时，吹打培养瓶瓶底使细胞完全脱壁，加入适量含血清培养基终止消化；将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min ;弃上清，用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔2换液I次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2 X 106个细胞，一管加APC标记抗人⑶31抗体，另一管加同型阴性对照，4°C避光孵育30min ；PBS洗涤，1000转/min，离心1min ;弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；流式细胞仪检测细胞纯度，培养的PMVECs纯度高达99.11 %。
[0022]本发明采用ECM内皮细胞专用培养基培养大鼠肺微血管内皮细胞，其它类型细胞混杂少，如采用传统的10%或20% FCS/DMEM培养基培养时，同样适合成纤维等细胞生长，故内皮细胞容易混杂细胞，纯度较低，而内皮细胞专用培养基ECM培养的PMVECs纯度如图3所示，99.28%的细胞表面抗原⑶31表达阳性，即培养的PMVECs纯度高达99.28%。
[0023]内皮细胞生长速度快平均2-3天可传一代，可以更好的满足后续实验研宄，本发明建立了一种取材方便、操作简单、繁殖速度快、纯度高的一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离、培养与鉴定方法。
[0024]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)取四周龄的SD大鼠，雌雄皆可，按照50mg/kg比例腹腔注射2%戊巴比妥钠，麻醉后，胸腹部剃毛后在超净台内用75%酒精进行胸腹部的擦拭消毒，打开腹腔，腹主静脉放血并换打开胸腔，剪去左心耳，放出肺循环中的血液； (2)取出心肺，放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中洗涤三次，每次Imin ； (3)除去心脏，将肺组织移入新的DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)中进行清洗2次，清洗后，将肺组织移入干燥培养皿中，加DMEM培养液(含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，以刚没过肺脏为宜，用细弯镊撕去肺表面的胸膜，剪下2-3mm宽的肺外边缘组织块； (4)将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10% FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1_X1_X Imm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到10mm培养皿中，于5% CO2培养箱中在37°C条件下培养。 (5)2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5% FBS、I % ECGS)，培养液以每隔48h更换I次培养基继续培养，72h后移除组织块，更换培养基，继续培养； (6)培养3-5天后，细胞可以汇合成单层，可用于培养P3代细胞； (7)原代细胞培养3-5天后，细胞汇合成单层，进行传代培养； (8)弃去培养瓶中的培养液，用PBS溶液洗涤I遍，加入1.5mL 0.125%的胰酶消化，显微镜下见细胞开始皱缩变圆时，吹打培养瓶瓶底使细胞完全脱壁，加入适量含血清培养基终止消化； (9)将消化的细胞转移到无菌离心管中，1000转/分，离心5min； (10)弃上清，用含5%胎牛血清的内皮细胞专用培养基重悬细胞，移入75cm2培养瓶中传代培养，24h后第一次换液，之后间隔2-3d换液I次并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。2.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于:所用的大鼠为四周龄的SD大鼠。3.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于:将剪下的边缘组织块移入干燥的培养皿中，用PBS液清洗2次，清洗后，将组织块移入无菌的抗生素瓶中，并加入2ml DMEM培养液(含10% FCS)以刚没过组织块为宜，用眼科剪将其剪成约1_X ImmX Imm大小的组织块，然后用弯头滴管吸取组织块接种到10mm培养皿中，于5% CO2培养箱中在37°C条件下培养。4.根据权利要求1所述的一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，其特征在于:2h后，加入5-6ml ECM培养液(含5% FBS、I % ECGS)，ECM培养液为血管内皮细胞专用培养液，以每隔48h更换I次培养基继续培养，72-90h后移除组织块，更换培养基，继续培养。5.一种采用如权利要求1获得的大鼠肺微血管内皮细胞纯度鉴定方法，其特征在于:包括以下步骤: (I)用无菌试管收集P3代的PMVECs两管，每管约2X106个细胞，一管加APC标记抗人⑶31抗体，另一管加同型阴性对照，4°C避光孵育30min ；(2)PBS 洗涤，1000 转 /min，离心 1min ；(3)弃上清液后再加入0.5mL PBS重悬细胞，200目细胞筛过滤去除细胞团块；(4)流式细胞仪检测细胞纯度。
【专利摘要】本发明公开一种大鼠肺微血管内皮细胞分离培养方法，采用ECM内皮细胞专用培养基培养大鼠肺微血管内皮细胞，其它类型细胞混杂少，内皮细胞专用培养基ECM培养的PMVECs纯度则高达99.28％，内皮细胞生长速度快平均2-3天可传一代，可以更好的满足后续实验研究，建立了一种取材方便、操作简单、繁殖速度快、纯度高的一种大鼠肺微血管内皮细胞的分离培养与鉴定方法。
【IPC分类】C12N5/071, C12Q1/04
【公开号】CN104946580
【申请号】CN201510391095
【发明人】蔡维霞, 胡大海, 朱雄翔, 韩军涛, 官浩, 郑朝, 王洪涛, 陶克, 石继红, 王耘川, 杨薛康, 计鹏, 韩士超
【申请人】中国人民解放军第四军医大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月6日