一株抑制植物病原真菌的枯草芽孢杆菌Baisha2C的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生防菌株挖掘和利用的领域，具体涉及一株抑制植物病原真菌的枯草 芽孢杆菌Baisha2C的鉴定和应用。
【背景技术】
[0002] 英国植物真菌病害专家Garratt，S. D. (1965)指出"生物防治是在任何条件下或 借助于任何措施，通过其它生物（人除外）的作用来减少病原物的生存和活动，从而减少病 原物所致病害的发生"；"生物防治指引进一种或几种用于防治的生物，通过增加该生物的 数目或者通过改变环境使其利于这些生物的活动，通常两种措施综合作用"。
[0003] 植物病害生物防治是利用一种或多种拮抗体，通过对环境、寄主或拮抗体的控制， 减少处于活跃状态或休眠状态的病原菌或寄生物的密度或致病活动。
[0004] 植物病害生物防治的目的：1、减少病原菌的接种体，要通过减少作物之间的幸存 者，减少产生或释放活的繁殖体，或者减少菌丝体生长所造成的传播。2、减少病原菌对寄主 的感染。3、减少病原菌为害的程度。
[0005] 生防细菌在植物病害的防治中占有十分重要的地位，其主要优势有：（1)生防细 菌复杂多样的生防机制使病原菌不易产生抗药性。生防细菌的抑菌机理有多种，并且通常 是两种以上的抑菌机制协同作用起到防治病害的效果。在植物病害防治实践中，普遍采用 的方法是同时使用活菌体和其拮抗性代谢产物，这有利于各种抑菌机制互促互补，从而使 生防细菌的生防潜力得到最大限度的发挥。此外，细菌产生的抑菌活性物质（如细菌素） 能同时影响敏感菌的多种代谢途径，如此以来，因病原菌发生突变而对细菌素产生抗性的 可能性就不像抗生素那样容易。（2)生防细菌的活体应用使得其防效较之其它微生物更为 持久的原因是生防细菌大多由农田生态系统中分离出来，一般情况下具有与病原菌相同或 相近的生态适应及对寄主植物的亲和性，定殖相对容易，再加上其繁殖迅速，使应用细菌活 体防治病害成为可能。而用于生防的其他微生物类群，多数是利用它们的代谢产物防治病 害。相比之下，生防细菌定殖后能大量繁殖并建立产生抑菌物质的"活工厂"防效会更持久。 (3)代谢旺盛、产生拮抗物质周期短，与生防真菌或放线菌相比生防细菌繁殖速度快得惊 人，在适宜的条件下，几十分钟就分裂繁殖一次，一天以后便产生数千万个后代。液体培养 条件下，44小时即可达产拮抗物质的高峰期。这有利于节约时间，缩短生产周期，降低生产 成本。（4)有利于维持有益微生物的生态平衡，由于生防细菌所产生的抑菌物质通常直接针 对相应的病原菌起作用，特异性强，故此不会对农业生态系统其它有益微生物产生不利影 响，有助于维持有益微生物的生态平衡。
[0006] 诱导植物抗性是生防菌发挥生防作用的一个重要方面。病原物诱导的植物抗性与 非病原物诱导植物抗性具有相同的表型特征。关于生防菌的诱导抗性的可能机制包括：① 产生抗微生物的低分子量化学物质，如植物保卫素、木质素、富含轻脯氨酸的糖蛋白等。② 诱导一些水解酶和氧化酶类，如几丁质酶、过氧化物酶。③诱导病程相关蛋白的产生等。利 用植物内生菌防治植物病原菌已成为研宄热点.杨海莲等从水稻中分离得到内生阴沟肠 杆菌MR12,发现它既有固氮活性，又可防治水稻稻瘟病和纹枯病。唐明娟等发现，在野外盆 栽条件下，内生真菌能提高台湾金线莲的成活率，使其成活率达100%，同时还发现使用内 生真菌的金线莲生长快，叶大且绿，根系发达。马冠华等的研宄结果表明，烟草内生菌不仅 能在烟草中定殖，还能有效抑制病原菌的入侵及扩繁。生防微生物诱导植物抗性在细菌 如假单胞菌和真菌己有很多研宄。但是芽孢杆菌诱导植物抗性作用的报道相对较少，已有 研宄证明诱导植物抗性也是其生防作用的重要机制之一。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的针对现有技术的空白提供一株生防菌Baisha2C及其在防治多种植 物真菌病害中的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
[0009] 本发明采用的细菌是枯草芽孢杆菌，分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2015年06月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心（CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄所，邮编 100101 ;保藏编号为 CGMCC NO. 10963。
[0010] 本发明的生防菌Baisha2C分离自海南省白沙县胡椒感病叶片，经菌落和形态的 显微观察、染色反应、常规生理生化特性试验以及16s rDNA序列分析，该菌株鉴定为枯草 芽孢杆菌的一个新菌株，具有以下特征：（1)菌株呈杆状，有成链趋，具圆端或方端；芽孢椭 圆、卵圆、柱状、圆形，无荚膜；革兰氏染色阳性；（2)通过对生防菌进行分子鉴定、吲哚实 验、甲基红实验、酪氨酸分解实验、柠檬酸盐生长实验、生长温度、碳源利用以及其他生理生 化指标，并结合《伯杰细菌鉴定手册》，鉴定结果Baisha2C属于枯草芽孢杆菌属，结果与分 子鉴定一致。
[0011] 生防菌Bai sha2C的基本培养基为LB培养基或YEP培养基。
[0012] 生防菌Baisha2C的可利用碳源有：山梨醇、鼠李糖、维生素 C、苏氨酸、半乳糖、脯 氨酸、甘露醇、麦芽糖、胱氨酸、可溶性淀粉、葡萄糖、酪氨酸、果糖。
[0013] 生防菌Baisha2C对环境的适应能力比较强，可以在4°C _80°C的温度范围内生长， 在盐浓度为0-10%均能生长。
[0014] 本发明还研宄了生防菌Baisha2C对不同的抗生素的敏感性，为化学防治提供基 础。
[0015] 本发明的菌株Baisha2C对镰孢炭疽菌、胶孢炭疽菌和镰刀菌具有抑制作用。
[0016] 本发明的菌株Baisha2C或其发酵液可以作为生物防治剂使用，用于防治植物真 菌病害枯萎病等。
[0017] 本发明还提供一种生防菌Baisha2C的应用，该菌株可以用于防治甘蔗赤腐病、胡 椒枯萎病和橡胶炭疽病。
[0018] 本发明还提供一种植物真菌病害的生物防治方法，向具有真菌病害的植物施用生 防菌Baisha2C或其发酵液，或者施用含有上述菌株或其发酵液的生物防治剂，也可以与其 他生物防治制剂联合施用。
[0019] 本发明的菌株Baisha2C具有广谱抗菌性，培养简单，适应性强，抗菌能力稳定，可 以广泛应用于多种植物真菌病害的防治。
【附图说明】
[0020] 图1为Bai sha2C和其他生防菌的16S rDNA PCR产物电泳图，泳道M为DNA marker，6 为 Kgl，7 为 Baisha2C，8 为 Kgl3,9 为 Kg4。
[0021] 图2为生防菌Baisha2C的革兰氏染色结果。
[0022] 图3为生防菌Bai sha2C对镰孢炭疽菌的拮抗效果图。
[0023] 图4为生防菌Bai sha2C对胶孢炭疽菌的拮抗效果图。
[0024] 图5为生防菌Bai sha2C对镰刀菌的拮抗效果图。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1
[0026] 生防菌Baisha2C的分离培养和筛选纯化。
[0027] I. 1 采样
[0028] 样品为海南省白沙县胡椒感病叶片，将采集好的叶片放入塑料袋中并记录。
[0029] 1. 2材料表面消毒与拮抗细菌分离
[0030] I. 2. 1清水冲洗与剪取病叶
[0031] 用清水洗去叶片上的灰尘砂砾，晾干。用剪刀在病健交界处剪取大小为5 X 5mm的 小叶片备用。
[0032] L 2. 2样品消毒
[0033] 将剪取的小病叶放入烧杯，用升汞浸泡30秒，在浸泡的过程中应注意不断轻轻搅 动小病叶，然后用无菌水冲洗三次，晾干，备用。
[0034] L 2. 3细菌分离培养
[0035] 用灭过菌的镊子将剪取的小叶片贴放到PDA固体培养基上，每皿均匀摆放4 ±夬，再 将培养皿用保鲜膜密封。倒置放入恒温培养箱中，28°C培养。每隔12h进行观察48h后将 长出的菌体转接至相同的培养基上，28°C培养48h后进行纯化；同时，将纯化后所得的细菌 采用梯度稀释涂布LB平板培养基中，28°C培养48h后挑取单菌落接至相应培养基斜面上。
[0036] 1. 3拮抗细菌的筛选
[0037] 1.3.1细菌的纯化
[0038] 无限稀释法：将放置于8~KTC培养箱中的斜面试管取出，在无菌操作台中，将 液体LB培养基分装到锥形瓶中，然后用接种针挑去少量的细菌于锥形瓶中，封口。放置于 28°C摇床上震荡培养约12小时，取出。然后用移液器吸取200 yL于LB固体培养基上，涂 抹棒涂抹均匀，于28°C培养箱培养。然后再通过无限稀释法处理获得单一菌株。
[0039] 或者采用划线纯化法：
[0040] 如果要挑的菌落很小，而且又长得慢，菌落全部粘到接种环上，划线时可适当增加 第二梯度线的宽度和划线数，因为当菌少时，拉不开4个梯度，而第二梯度可较好的分离出 单菌落。如果要挑的菌落很大，而且又长得快，可挑菌少些，第一梯度线要多划几下，且占地 要小。第二梯度线划得少且密一些，第三和第四梯度线则划得多且疏，因为这些菌主要靠第 三和第四梯度线分离单菌落。第二梯度2~3条线与第一梯度线连接，第三与第二梯度线 也是2~3条线连接。在第二与第三梯度划线前将接种环灼烧冷却，这样可烧死粘在接种 环上的细菌。
[0041] 实施例2
[0042] 生防菌Baisha2C的鉴定
[0043] 1、微生物学特性：
[0044] 对在37°C培养箱中划线培育的生防菌株进行形态特征观察，发现生防菌株 Baisha2C呈杆状，有成链趋，具圆端或方端；芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，无荚膜，为芽孢杆 菌属。经革兰氏染色后菌体均呈现出蓝紫色，为革兰氏阳性菌。
[0045] 2、分子生物学鉴定：
[0046] (I)DNA提取：采用本领域通用的试剂盒进行基因组DNA的提取；
[0047] (2)PCR反应：细菌通用引物8F和1492R，由英潍捷基（上海）贸易公司合成，结构 如下：8F 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
[0048] 生防菌株Baisha2C的16S rDNA基因扩增结果如图1所示，扩增条带长度约 1500bp，与预期大小一致；
[0049] (3)将PCR鉴定正确的重组菌送英潍捷基（上海）贸易公司基因测序。
[0050] 通过在NCBI网上进行比对分析，结果显示与枯草芽孢杆菌属的同源性为99%，因 此推断Baisha2C菌株属于枯草芽孢杆菌属。
[0051] 3、生防菌的生理生化鉴定
[0052] (1)叼丨噪试验
[0053] ①培养基配制：取1%胰蛋白胨水溶液，调pH 7.2_7.6,分装于试管中，高度为试 管的 1/3-1/4,121°C灭菌 21min ;
[0054] ②待培养基冷却后，取10 μ L供试菌株新鲜种子液接种于胰蛋白胨液体培养基；
[0055] ③28°C培养，分别于2d、4d后观察结果；
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