1:100、1:500和1:3000稀释，第I组用I %BSA PBST，第2组用5%，第3组用5 %马血清I3BST，37°C下反应2小时后，经洗涤，加底物显色15分钟终止反应，酶标仪测定0D450值，以确定最佳抗体稀释液。
[0032]七、检测极限确定
用5pg/ml的抗体包被好的酶标板，将临床血清进行1:10、1:50、1:100、1:500、1:1000、1:2000、1:5000、1:10000的8个稀释度进行ELISA测定，同时设立阴阳性对照。
[0033]八、重复性试验鉴定
板内重复性验证:用抗体包被板置于37°C lh，然后4°C过夜，洗涤后封闭，在同一块板内检测6份不同的样品:3份阳性对照品和3份阴性样品，每份样本重复3孔，按照优化的最佳条件进行ELISA检测，计算同一份样本0D450值的变异系数CV%，用来评价板内检测样品的重复性。
[0034]板间重复性验证:用6块包被好的酶标板在相同条件下，不同时间点重复检测6份样品:3份阳性对照品和3份阴性样品，每份样本重复3孔，按照优化的最佳条件进行ELISA检测，计算同一份样本0D450值的变异系数CV%，用来评价板内检测样品的重复性。以CV%低于10%，且无显著性差异为临界判断标准。
[0035]本发明中还涉及通过双抗体夹心ELISA试剂盒在人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8蛋白体外检测中的使用，其步骤为:
I)加入待检样品:取出包被抗体的酶标板，加入10yL /孔的待检样品(如血清)，同时设立阳性对照和阴性对照孔，于37°C孵育lh-2h，然后洗涤液洗涤3-4次；
2)添加检测抗体:取出试剂盒中的检测抗体，以样品稀释液按照1:100的体积比例稀释并混匀，按10yL /孔加入，于37°C孵育0.5h，然后洗涤液洗涤3-4次；
3)添加酶标抗体:取出试剂盒中的酶标抗体，用洗涤液按照1:500的比例进行稀释并混匀，10yL /孔加入，于37°C孵育lh，然后洗涤液洗涤3-4次；
4)显色:加入显色液，按10yL/孔加入，于室温下显色10-15min，按10yL /孔加入终止液终止显色。
[0036]5)测定光密度值:用酶标仪进行检测。
[0037]本发明中洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液属于现有技术，使用该试剂盒的技术人员可根据需要自行配制，本发明优选以下条件:
洗涤液= NaCl 8g、KH2P04 0.27g、Na2HP04 1.42g、KCl 0.2g，800mL双蒸水溶解后加入
0.5mL Tween-20，充分混匀，调整PH至7.2，定容至100mL。
[0038]样品稀释液:NaCl8g、KH2P04 0.27g、Na2HP04 1.42g、KCl 0.2g，800mL双蒸水溶解后加入1g标准牛血清蛋白BSA，充分溶解混匀，调整PH至7.2，定容至1000mL。
[0039]底物液A:3，3’，5’，5_四甲基联苯二胺0.2g，无水乙醇10mL，加双蒸水定容至100mL0
[0040]底物液B: Na2HP04 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75%过氧化氢尿素溶液6.4mL，加双蒸水800mL,调节PH至5.2，补充双蒸水定容至1000111匕
[0041 ] 终止液:2M H2S04溶液。
[0042]本发明利用抗人f33GnT8单克隆抗体和抗人f33GnT8多克隆抗体，制备抗人f33GnT8双抗体夹心ELISA试剂盒;采用双抗体夹心酶联免疫吸附ELISA法，用该试剂盒定量检测患者血清中i33GnT8蛋白水平的含量，尤其是结肠癌患者。通过结肠癌患者血清i?GnT8蛋白水平的高低，并与正常人血清水平对比，借助这些表达差异为结肠癌的早期诊断提供一个重要的参考依据。
[0043]上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1.一种人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:包括:洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液、包被抗体的酶标板、检测抗体、酶标抗体、标准对照蛋白。2.根据权利要求1所述的人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述包被抗体的酶标板是以鼠抗人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8单克隆抗体为包被抗体，用包被液将包被抗体稀释，每孔加入稀释后的包被抗体，并在过夜包被后用洗涤液洗涤;再向酶标板中加入封闭液，等待反应，最后洗涤液洗涤。3.根据权利要求2所述的人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述检测抗体是兔抗人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8多克隆抗体。4.根据权利要求3所述的人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述酶标抗体是辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体。5.根据权利要求4所述的人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述标准对照蛋白:包括阳性对照KGnTS蛋白和阴性对照大肠杆菌菌体蛋白。6.根据权利要求2至4任意一项所述的人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述包被抗体被包被液稀释后的浓度是5yg/mL，稀释后的包被抗体每孔加入量为10yL，过夜包被的温度为4°C;过夜包被后洗涤液洗涤次数为3?4次;酶标板中加入封闭液的量为每孔lOOyL，酶标板中加入封闭液的反应温度是37°C，反应时间为I?2小时，反应结束后洗涤液洗涤次数为3~4次。7.根据权利要求6任意一项所述的人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述的包被抗体的制备方法为: 第一，将β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8蛋白与弗氏完全佐剂混合，用BALB/c小鼠进行皮下免疫； 第二，分别于BALB/c小鼠初次后，更换为弗氏不完全佐剂对BALB/c小鼠进行第二次和第三次免疫； 第三，在BALB/c小鼠第三次免疫对BALB/c小鼠进行腹腔注射加强免疫； 第四，按照常规杂交瘤制备方法制备脾脏B淋巴细胞与SP2/0细胞的融合杂交瘤细胞株，进行单克隆细胞分选培养，经包被β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8蛋白的ELISA筛选鉴定获得阳性杂交瘤细胞株； 第五，借助BALB/c小鼠腹水瘤制备鼠抗人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8单克隆抗体，腹水经分离纯化后获得用于双抗体夹心ELISA试剂盒的包被抗体。8.根据权利要求7任意一项所述的人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于:所述第一步中β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8蛋白与弗氏完全佐剂的混合比例为1:1;每只BALB/c小鼠免疫总量0.2mL进行皮下免疫;所述第二步中对BALB/c小鼠进行第二次和第三次免疫的具体时间是在BALB/c小鼠初次免疫3周后和5周后；第三步中对BALB/c小鼠进行腹腔注射加强免疫的具体时间是在BALB/c小鼠第三次免疫2周后且细胞融合前I天。
【专利摘要】本发明公开了人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，包括：洗涤液、样品稀释液、显色液、终止液、包被抗体的酶标板、检测抗体、酶标抗体、标准对照蛋白。通过上述方式，本发明人β3乙酰氨基葡萄糖基转移酶8双抗体夹心ELISA试剂盒，制备抗人β3GnT8双抗体夹心ELISA试剂盒；采用双抗体夹心酶联免疫吸附ELISA法，用该试剂盒定量检测患者血清中β3GnT8蛋白水平的含量，尤其是结肠癌患者。通过结肠癌患者血清β3GnT8蛋白水平的高低，并与正常人血清水平对比，借助这些表达差异为结肠癌的早期诊断提供一个重要的参考依据。
【IPC分类】G01N33/574, G01N33/569
【公开号】CN105510585
【申请号】CN201510858726
【发明人】刘春亮, 吴梦旦, 许颖, 吴士良
【申请人】苏州市博力生物科技有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月1日