甲型流感病毒、h1n1及h3n2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒的制作方法

专利名称：：甲型流感病毒、h1n1及h3n2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种甲型流感病毒、HlNl及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂品.ο
背景技术：
：流行性感冒(influenza)简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，此病传染性强，传播迅速，抗原易变异，尤其是甲型流感病毒，其进化频率高于乙型和丙型流感病毒，曾经三次导致世界性流感病毒大流行，如1918年的Hmi(猪型)，1957年的H2N2型(亚洲型)和1968年的H3N2型(香港型)。目前，墨西哥、美国爆发的甲型流感病例属于Hmi亚型，引起这次疫情的Hmi亚型流感病毒为流感病毒新变异型一2009年北美变异株，可同时感染人和猪。在自然界中，甲型流感病毒的宿主范围相当广，猪、马、水貂、海豹、鲸、禽类以及人类中都已经分离出甲型流感病毒。但是甲型流感病毒在不同宿主中的亚型分布不同，所有的HA、NA亚型均能从禽类中找到，水禽是其天然储存库；而在哺乳动物中仅发现了有限的亚型，已知的只有三种HA亚型(H1、H2和H3)和两种NA亚型(附和N2)，其中Hmi和H3N2型是感染人类并能够引起一定范围流行的甲型流感病毒。研究发现猪在流感传播过程中承担了流感病毒基因重组发生混合器的角色，同时猪也能感染禽流感和人流感。禽Hmi和人H3N2可传播给猪，猪Hmi可传播给人，人流感病毒可传播给鸭，并在鸭体内储存。1918年引起世界性流行的猪型流感病毒Hmi就可能来自禽流感病毒；实验感染也发现，禽、人流感病毒在猪体内都可有效繁殖，种系及流行病学分析也表明，禽、人流感病毒可通过自然途径传播给猪，并在猪体内重组后传播给人。最早报导的从猪体内分离出类似甲/HongKong/68的流感病毒是在1969年，而后在世界各地连续不断地从猪群中分离到H3N2病毒株。一些间接的血清学证据也表明，人类H3N2型流感病毒的变异株可以感染猪。1976年1月，在美国新泽西州发生了甲1型(猪型)流感。从1名死于肺炎的士兵体内分离到此型病毒。通过流行病学调查，多数患者与猪有密切的接触史。综上所述，甲型流感病毒Hmi亚型2009年北美变异株、类人型Hmi和古典型猪HlNl、H3N2均应是我国口岸检验检疫关注的重点检疫目标，在高度重视Hmi亚型2009年北美变异株的同时，也要注重类人型Hmi和古典型猪H1N1、H3N2的防控工作。为更好、更彻底地从根本上防控甲型流感疫情，严格出入境检验检疫，防范甲型流感跨境传播，确保人民群众身体健康和生命安全，很有必要迅速建立起特异性强、敏感性高、适合国境口岸快速验放的甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒的快速检测方法。实时荧光定量RT-PCR(Real-TimeRT-PCR)将普通RT-PCR技术与荧光检测相结合，不仅具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点，而且通过分析软件对数据进行分析整理，结果更为准确直观，整个检测过程只打开一次试管，有效地减少了假阳性发生的机会，已成为病原体检测的重要方法。文献检索表明，目前国内外诊断甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒的方法仍然是病毒分离、血清学诊断反应和普通RT-PCR、荧光RT-PCR等，一次试验完成甲型流感病毒初筛及HlNl、H3N2亚型流感初步确认的荧光RT-PCR检测技术尚属空白。经典的病毒分离、血清学诊断方法费时费力，不适于临床检测，不符合生物安全条例的要求，无法满足国境口岸快速验放的要求。普通PCR不仅无法对病料样本中的病毒进行定量检测扩增反应后需要电泳检测，这不仅不适于大批量样本的筛选，而且容易因操作污染造成假阳性。单重荧光RT-PCR，仅能对流感进行通用型检测，不能确诊定型。
发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种甲型流感病毒、HlNl及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒。本发明采用的荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点，一次试验即可完成甲型流感病毒初筛和HlNUH3N2亚型流感病毒初步确认。本发明所采用的技术方案是本发明中甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒检测方法，包括以下步骤(1)选取适当的M基因、HA基因相关序列，设计特异性检测A型流感病毒、HlNl和H3N2亚型流感病毒的特异性引物及Tagman荧光探针，具体的核苷酸序列如下A型流感病毒Pl5，-CCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGAT-3，P25’-GCTGCAGTCCTCGCTCACT-3’ProbeFam_5，-TGTGTTCACGCTCACCGTGCC-3，-EclipseA型流感病毒Hmi亚型Pl5’-CCCCATTGCATTTGGGTAAA-3‘P25’-TGGAGAGTGATTCACACTCTGGAT-3‘ProbeHex_5，-TAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGA-3，-EclipseA型流感病毒H3N2亚型Pl5，-CTGGATCCTGTGGATTTCCTTT-3，P25，-TGATGAACCCCAGCAAAACA-3，ProbeRox_5，-CATATCATGCTTTTTGCTTTGTG-3，-Eclipse；(2)取被检样品提取病毒RNA；(3)建立荧光RT-PCR反应体系，将上述引物、探针以及各反应组份置于荧光PCR仪中，加入被检样品提取的RNA模板，进行反转录和扩增，反转录和扩增在荧光PCR仪内一次完成；(4)结果分析，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。在上述RT-PCR反应体系设立有阳性对照和阴性对照进行反转录和扩增。所述阳性对照是采用甲型流感病毒及Hmi和H3N2亚型流感病毒基因重组克隆质粒，所述阴性对照是采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF胚的尿囊液。上述步骤⑵中荧光RT-PCR反应参数如下_反应温度反应时间循环次数荧光收集150°C30min1不收集294°C3min1不收集94°C10s不收集3450C30s3不收集72"C60s不收集9410s不收集44555°C35s收集本发明还提供一种用于甲型流感病毒、HlNl及H3N2亚型流感病毒检测方法的试剂盒，荧光RT-PCR反应液组份及浓度为终浓度1xRT-PCR缓冲液10mmol/LTris-Cl，50mmol/LKCl,pH8.3~dNTP0.10.8mmol/LMgCl2卜8mmol/LDTT2mmol/L甘油5%Taq酶0.53.5UAMV反转录酶50300U各引物Pl0.11μιηοΙ/L各引物P20.1—1μπιοΙ/L各探针Probe0.1-1μιηοΙ/L上述荧光RT-PCR反应液的优选浓度如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。本发明的有益效果是本发明针对甲型流感病毒Hmi亚型2009年北美变异株，建立可检测Hmi亚型2009年北美变异株、类人型Hmi和古典型猪H1N1、H3N2荧光RT-PCR方法，一次实验即可对甲型流感进行初筛，又可对Him亚型和H3N2亚型的进行初步确认定型，具有快速、敏感性高、特异性强、重复性好等优点，是甲型流感病毒初筛、Hmi及H3N2亚型流感病毒快速检测定型的重要方法，可填补质检系统，乃至国内在这方面的技术空白，既是应对当前生猪和猪肉产品开检Hmi亚型流感病毒的紧急需要，也为可能发生的人感染甲型流感疫情大爆发做好技术储备。本发明建立的实时荧光RT-PCR方法可特异性的检测InfluenzaAViruse(HlNl)(人源、猪源)、InfluenzaAViruse(H3N2)(猪源)、AIVH5、AIVH9等甲型流感病毒，且与NDV、EDSV等其它病毒的核酸不发生交叉反应；可检测到每个反应相当于7.7copies/yL的甲型流感病毒RNA和最低稀释度为10_5的甲型流感病毒、7.75copies/μL的Him亚型流感病毒RNA和最低稀释度为10_5的Hmi亚型流感病毒、38.5copies/μL的Η3Ν2亚型流感病毒RNA和最低稀释度为10_4的Η3Ν2亚型的流感病毒；重复性较好，批间CV值小于5%；与常规的荧光RT-PCR相比较，一次试验同时特异性检测甲型流感病毒、HlNl亚型流感病毒和Η3Ν2亚型流感病毒，耗时仅为3h，而且费用低廉(约15元/头份)。图1是甲型流感通用探针A67荧光RT-PCR检测结果；图2是Hmi亚型特异性探针H172C荧光RT-PCR检测结果；图3是H3N2亚型特异性探针H368荧光RT-PCR检测结果；图4是探针A67特异性试验曲线；其中A:H1N1(猪源)；B:H1N1(人源)；C:H3N2(猪源)；D:pMD_A；E=AIVH9；F=AIVH5；G=NDV-Lasota；H=NDIV系；I=EDSV；K阴性对照；图5是引物A67特异性试验RT-PCR电泳图；M=DNAMarkerDL-2000；1阴性对照；2=HlNl(猪源)；3=HlNl(猪源)；4HlNl(人源)；5:H3N2(猪源)；6:AIVH9(美国)；7:AIVH9；8:AIVH5；9=NDV-Lasota；10EDSV；图6是探针H172C特异性试验曲线；图7是引物H172C特异性试验RT-PCR电泳图；M=DNAMarkerDL-2000；1=HlNl(猪源)；2=HlNl(猪源)；3=HlNl(人源)；4H3N2(猪源)；5:H3N2(猪源)；6=AIVH9(美国)；7=AIVH9；8=AIVH5(美国)；9=AIVH5；10=AIVH5；11=NDV-Lasota；12=EDSV；13阴性对照；图8是探针H368特异性试验曲线；图9是引物H368特异性试验RT-PCR电泳图；M=DNAMarkerDL-2000；1:H1N1(猪源)；2:H1N1(猪源)；3:H1N1(人源)；4H3N2(猪源)；5=AIVH9(美国)；6:AIVH9；7:AIVH5(美国)；8:AIVH5；9:AIVH5；10NDV-Lasota；11=EDSV；12阴性对照；图10是探针A67质粒稀释敏感性试验结果；图11是探针H172C质粒稀释敏感性试验结果；图12是探针H368质粒稀释敏感性试验结果；图13是探针A67的敏感性试验结果；其中，-1灭活病毒10—1稀释；-2灭活病毒10_2稀释；-3灭活病毒10_3稀释；_4灭活病毒10_4稀释；-5灭活病毒10_5稀释；图14是探针H172C的敏感性试验结果；其中，-1灭活病毒10—1稀释；-2灭活病毒10_2稀释；-3灭活病毒10_3稀释；_4灭活病毒10_4稀释；-5灭活病毒10_5稀释；图15是探针H368的敏感性试验结果；其中，-1灭活病毒ΙΟ—1稀释；-2灭活病毒10_2稀释；-3灭活病毒10_3稀释；_4灭活病毒10_4稀释；图16是Hmi亚型病毒荧光RT-PCR标准曲线图。具体实施例方式下面就具体实施步骤和实验来对本发明的检测方法及检测试剂盒作进一步说明1、引物和荧光探针的设计合成根据GeneBank中公布的InfluenzaAViruse(HlNl)virus2009年北美变异株M基因、HA基因序列和InfluenzaAViruse(H3N2)流行株HA基因，通过与AIVH5、AIVH9、AIVH6、AIVH7等禽流感毒株的序列比对，用DNASTAR5.07软件比对寻找高度保守的区域，选取适当的M基因、HA基因相关序列，导入探针设计软件PrimerExpress2.O设计特异性检测InfluenzaAVirusevirus及InfluenzaAViruse(HlNl)virus禾口InfluenzaAViruse(H3N2)virus的引物及Tagman荧光探针，用DEPC处理水溶解，-80°C避光保存。引物、探针见下表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2、病毒RNA提取(1)取η个灭菌的1.5mLEppendorf管，其中η为被检样品、阳性对照与阴性对照的和(阳性对照、阴性对照在试剂盒中已标出)，编号。(2)每管加入600μL裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μL，再加入200μL氯仿，混勻器上振荡混勻5s(不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混勻)。于4°C、12000r/min离心15min。(3)取与(1)相同数量灭菌的1.5mLEppendorf管，加入400μL异丙醇(_20°C预冷)，做标记。吸取本标准(2)各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μL，不能吸出中间层，颠倒混勻。(4)于4°C、12000r/min离心15min(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600μL75%乙醇，颠倒洗涤。(5)于4°C、12000r/min离心IOmin(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，小心倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。(6)4000r/min离心IOs(Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置)，将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥5IOmin。(7)加入IlyLDEPC水，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70°C冰箱。3、荧光RT-PCR反应体系的建立与优化(1)引物和探针浓度的优化将PCR反应中的引物和探针浓度从0.Ιμπιο/L至1μmol/L以0.05ymol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，对比试验的其它条件完全一致。实验结果显示引物浓度在0.8μmol/L、0.9μmol/L和1μmol/L都较为合适，探针的浓度在0.15μmol/L、0.25μmol/L和0·3μmol/L,都较合适，考虑到经济的原因，选择0.9μmol/L的引物和0.25μmol/L的探针作为荧光RT-PCR检测方法的引物和探针浓度。(2)MgCl2浓度的优化MgCl2会影响PCR反应的特异性和扩增效率，在固定其它反应成分不变的情况下，采用MgCl2浓度梯度，对MgCl2浓度进行了优化，MgCl2浓度从1.0mmol/L开始，以0.5mmol/L递加，直到8mmol/L。荧光RT-PCR检测结果表明MgCl2浓度越低PCR产物的荧光信号强度越低，而随着MgCl2浓度的增高，扩增效率有所提高，但随着浓度的不断升高，PCR的扩增受到抑制。经比较结果后最终选定PCR反应体系中的MgCl2浓度为2.5mmol/L。(3)dNTPs浓度的优化dNTPs浓度的高低会影响PCR产物的含量，在固定其它反应成分不变的情况下，采用dNTPs浓度梯度，对dNTPs浓度进行了优化，dNTPs浓度从0.lmmol/L开始，以0.05mmol/L递加，直到0.8mmol/L。荧光RT-PCR检测结果表明采用MgCl2浓度为2.5mmol/L时，采用0.2mmol/L的dNTP为最适。(4)TaqDNA聚合酶(Taq酶)的选择和优化Taq酶(以单位Unit计，简写U)优化实验酶的用量分别采用0.5U到3.5U进行实验检测。荧光RT-PCR检测结果表明Taq酶用量在1U、1.25U、1.5U和2.5U都较合适，根据经济和效果双重考虑，最终选择IU作为RT-PCR反应体系的最适酶量。(5)逆转录酶的选择和优化逆转录酶(以单位Unit计，简写U)优化实验酶的用量分别采用50U到300U进行实验检测。逆转录酶的用量在100U、150U、200U和250U都较合适，根据经济和效果双重考虑，最终选择100U作为RT-PCR反应体系的最适酶量。(6)最佳退火温度和PCR循环数的确定为了提高荧光RT-PCR反应的灵敏度和特异性，根据设计的引物退火温度，以55°C为基础，以0.5°C递加，直到62°C。将细菌DNA模板采用极限梯度稀释法进行PCR实验，采用循环次数为35、40和45。实验结果显示55°C作为退火温度较为合适，扩增循环数45个循环即可达到检测的极限，反应参数如下表1步骤反应温度反应时间循环次数荧光收集150°C30min1不收集2940C3min1不收集94IOs不收集345°C30s3不收集72°C60s不收集94"C10s不收集44555°C35s收集荧光素设定R印ortDye设定分别为A67FAM,H172CHex,H368RoxQuenchDye都设定为Eclipse；Referencedye设定为None。经优化，确定了同时适合于InfluenzaA、InfluenzaAViruse(HlNl)和InfluenzaAViruse(H3N2)荧光RT-PCR检测的总体积为20μ1的最佳反应体系及反应参数，各组分及浓度见下表终浓度1IxRT-PCR缓冲液10mmol/LTris-Cl,50mmol/LKCl,ρΗ8.3~dNTP0.2mmol/LMgCl22.5mmol/LDTT2mmol/L甘油5%Taq酶IU逆转录酶(AMV)100U引物Pl0·9μιηο1/引物Ρ20.9pinol/L探针Probe0.25μιηοΙ/L据此可在一次试验中完成InfluenzaA.InfluenzaAViruse(HlNl)和InfluenzaAViruse(H3N2)荧光RT-PCR检测，即一次试验即可完成InfIuenzaA初筛和InfluenzaAViruse(Hmi)、InfluenzaAViruse(H3N2)的初步定型确认，检测加样示例如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>而采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF胚的尿囊液作为阴性对照。5、荧光RT-PCR反应、结果分析与判定按步骤3中优化后的反应体系配制反应混合物放入ABI荧光PCR仪，并按照步骤3中优化后的参数设置RT-PCR反应条件，进行一步法RT-PCR，120min后反应结束，保存文件，打开分析软件，仪器自动分析试验结果，给出Ct值及循环图像。当阴性对照的检测结果无数值或Ct值>30，阳性对照的Ct值≤28.0时，Ct值<30.0的样本判为阳性，Ct值无数值或以值>30的样品判为阴性。用component功能框观察结果，本发明设计的探针具有较强的荧光信号，探针A67检测InfluenzaAViruse荧光值≥8.000e+005(图1)，探针H172C检测InfluenzaAViruse(HlNl)荧光值≥3.000e+005(图2)，探针H368检测InfluenzaAViruse(H3N2)荧光值≥5.000e+005(图3)。6、荧光RT-PCR检测方法的特异性实验编号为A67的引物、探针检测InfluenzaAViruse(HlNl)(人源、猪源)、InfluenzaAViruse(H3N2)(猪源)、AIVH5、AIVH9和阳性对照(重组质粒pMD-A)均有荧光增加信号曲线，而NDV、EDSV和阴性对照均未观察到荧光信号增加曲线，RT-PCR结果与荧光RT-PCR结果一致，试验结果见图4、图5和下面的特异性实验表。编号为H172C的引物、探针检测InfluenzaAViruse(HlNl)(人源、猪源)和阳性对照(重组质粒pMD-HlNl)均有荧光增加信号曲线，而InfluenzaAViruse(H3N2)(猪源)、AIVH5、AIVH9而NDV、EDSV和阴性对照均未观察到荧光信号增加曲线，RT-PCR结果与荧光RT-PCR结果一致，试验结果见图6、图7和下面的特异性实验表。编号为H368的引物、探针检测InfluenzaAViruse(H3N2)(猪源)和阳性对照(重组质粒PMD-H3N2)均有荧光增加信号曲线，而InfluenzaAViruse(HlNl)(人源、猪源)、AIVH5、AIVH9而NDV、EDSV和阴性对照均未观察到荧光信号增加曲线，RT-PCR电泳结果与荧光RT-PCR结果一致，试验结果见图8、图9和下面的特异性实验表。荧光探针经去羟基化处理，不会在Taq酶作用下发生延伸。它只有与待测模板完全匹配的结合，才会发生荧光报告基团的切割，产生荧光的信号，因而由于引物的非特异性扩增而导致的假阳性问题能够得以解决。一般情况下，Tagman探针与模板之间的碱基错配超过4个以上就无法与模板结合，而正式PCR循环(收集荧光步骤)较高的退火温度(5560°C)，排除了模板的非特异性扩增，使得本方法具有较好的特异性，可准确检测InfluenzaAViruse、InfluenzaAViruse(HlNl)和InfluenzaAViruse(H3N2)。试验结果表明，本发明建立的甲型、Hmi及H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR方法具有良好的特异性，可准确地检测InfluenzaAViruse(HlNl)、InfluenzaAViruse(H3N2)、AIVH5、AIVH9，而NDV及EDSV检测为阴性。特异性实验表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>7、荧光RT-PCR检测方法敏感性实验荧光检测的灵敏度显著高于肉眼观察电泳条带的灵敏度，因此用荧光信号的指示剂显示扩增产物的量，能获得较高的检测精度，另外由于本方法在正式PCR循环(收集荧光)之前设置了3个低温(退火温度为45°C)PCR循环(反应参数为92°C10s,45°C30s,72°C60s)，使得模板在较低的退火温度下得到了大量的扩增，因此大大提高了本方法的敏感性。(1)实验结果表明甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法可以分别检测到提取的质粒的lirnuo.uir9稀释倍数，经换算成拷贝数分别为7.7copies/μL、7.75copies/μL、38.75copies/μL。结果见图10、图11、图12。(2)探针A67检测InfluenzaAViruse(HlNl)和InfluenzaAViruse(H3N2)的最低稀释度为10_5，探针H72C检测InfluenzaAViruse(HlNl)的最低稀释度为10_5，探针H368检测InfluenzaAViruse(H3N2))的最低稀释度为10_4，具有良好的敏感性。试验结果见图13、图14、图15。8、重复性和稳定性对IO7拷贝的模板在三个不同时间进行检测，每次做10个重复。根据下表结果可见甲型Hmi及H3N2亚型流感病毒荧光RT-PCR检测方法对三份样本的重复性检测，三次检测结果之间的变异系数(CV)值都小于5%，该方法具有很好的重复性。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>9、TaqManPCR标准曲线的制作将检测定在产物大量生成初期，即刚进入指数增长期的起始点位置一循环阈值(CT)，经对数拟合做图，得到定量标准曲线(见图16)，显示不同浓度标准品的Ct值与该标准品浓度的对数存在线性关系(X轴为模板量的对数值，CT值为Y轴作回归曲线，从标准曲线图中可得标准曲线的统计学分析相关系数R2为0.932142，线性关系较好，斜率为-3.820081，符合实时定量PCR的要求，根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的DNA拷贝数。本发明的检测所需时间短，核酸提取需要60min左右，一步法实时荧光RT-PCR需要120min左右，因此从收到样品到得到检验结果的时间仅为3h，目前的荧光RT-PCR方法需先进行InfluenzaAViruse初筛，再进行InfIuenzaAViruse(HlNl)和InfluenzaAViruse(H3N2)定型复核，而本发明建立的方法一次试验可同时特异性检测InfluenzaAViruse、InfluenzaAViruse(HlNl)和InfluenzaAViruse(H3N2)，检测时间从初筛到复核的6h缩短到3h左右，大大节省了初筛和定型复核的时间。由于本发明所用的PrimeScriptlstepEnzymeMix和2XlSt印Buffer包含了dNTP、Mg2+、反转录酶(AMV)、Tag酶，反应混合物的配制中加入了足够进行反转录和扩增的探针和引物，因此本方法采用一步法反转录闭管检测荧光技术，避免了普通PCR方法因交叉污染而产生假阳性的缺陷，并可防止病毒扩散污染环境，减少了溴化乙锭对操作人员的危害。商品化A型流感实时荧光RT-PCR试剂盒InfluenzaAViruse初筛和InfluenzaAViruse(HlNl)、InfluenzaAViruse(H3N2)确诊需要分步进行，操作繁琐，而且价格较高。除荧光PCR仪的成本外，每份样品检测的试剂成本就高达100元人民币左右，难以适应中国国情在全国普及和推广。本发明建立的试剂盒所使用的大连宝生物公司产品PrimeScriptlstepEnzymeMix和2XlSt印Buffer目前的价格是11元/头份，合成50D探针和引物仅需1400元，每份样品探针、引物的费用为1元，因此本试剂盒每份样品检测的试剂成本仅为15元人民币左右，初略估算本方法的试剂成本仅为商品化的荧光RT-PCR试剂盒的七分之一，检测成本低廉，可大幅度节省检测费用，非常适合在全国推广和普及。SEQUENCELISTING<110>中华人民共和国珠海出入境检验检疫局<120>甲型流感病毒、HlNl及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒<130><160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>A67上游引物<400>1cctctgactaagggaattttaggat25<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>A67下游引物<400>2gctgcagtcctcgctcact19<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>A67探针<400>3tgtgttcacgctcaccgtgcc21<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>H172C上游引物<400>4ccccattgcatttgggtaaa20<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(24)<223>H172C下游引物<400>5tggagagtgattcacactctggat24<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>H172C探针<400>6taacattgctggctggatcctggga25<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(22)<223>H368上游引物<400>7ctggatcctgtggatttccttt22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>H368下游引物<400>8tgatgaaccccagcaaaaca20<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>H368探针<400>9catatcatgctttttgctttgtg23<210>10<211>67<212>DNA<213>甲型流感病毒重组质粒<400>10cctctgactaagggaattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgagga60ctgcagc67<210>11<211>72<212>DNA<213>甲型流感病毒Hmi亚型重组质粒<400>11ccccattgcatttgggtaaatgtaacattgctggctggatcctgggaaatccagagtgtg60aatcactctcca72<210>12<211>68<212>DNA<213>甲型流感病毒H3N2亚型重组质粒<400>12ctggatcctgtggatttcctttgccatatcatgctttttgctttgtgttgttttgctggg60gttcatca68权利要求一种甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)选取适当的M基因、HA基因相关序列，设计特异性检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的特异性引物及Tagman荧光探针，具体的核苷酸序列如下A型流感病毒P15’-CCTCTGACTAAGGGAATTTTAGGAT-3’P25’-GCTGCAGTCCTCGCTCACT-3’ProbeFam-5’-TCTGTTCACGCTCACCGTGCC-3’-EclipseA型流感病毒H1N1亚型P15’-CCCCATTGCATTTGGGTAAA-3’P25’-TGGAGAGTGATTCACACTCTGGAT-3’ProbeHex-5’-TAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGA-3’-EclipseA型流感病毒H3N2亚型P15’-CTGGATCCTGTGGATTTCCTTT-3’P25’-TGATGAACCCCAGCAAAACA-3’ProbeRox-5’-CATATCATGCTTTTTGCTTTGTG-3’-Eclipse；(2)取被检样品提取病毒RNA；(3)建立荧光RT-PCR反应体系，将上述引物、探针以及各反应组份置于荧光PCR仪中，加入被检样品提取的RNA模板，进行反转录和扩增，反转录和扩增在荧光PCR仪内一次完成；(4)结果分析，根据信噪情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和CT值判定结果。2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒检测方法，其特征在于，所述RT-PCR反应体系设立有阳性对照和阴性对照。3.根据权利要求2所述的甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒检测方法，其特征在于，所述阳性对照是采用甲型流感病毒及Hmi和H3N2亚型流感病毒基因重组克隆质粒，所述阴性对照是采用无菌抽取未接种任何病原体的正常SPF胚的尿囊液。4.根据权利要求1所述的甲型流感病毒、Hmi及H3N2亚型流感病毒检测方法，其特征在于，荧光RT-PCR反应参数如下<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>5.一种用于权利要求书1至4任一项所述的甲型流感病毒、HlNl及H3N2亚型流感病毒检测方法的试剂盒，其特征在于，荧光RT-PCR反应液组份及浓度为<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，荧光RT-PCR反应液组份及浓度为<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。全文摘要本发明公开了一种特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉的甲型流感病毒、H1N1及H3N2亚型流感病毒检测方法及检测试剂盒。本发明根据GeneBank中公布的InfluenzaAViruse(H1N1)virus2009年北美变异株M基因、HA基因序列和InfluenzaAViruse(H3N2)流行株的HA基因序列，通过序列比对寻找高度保守的区域，设计特异性引物和TaqMan探针，研制检测方法中的关键试剂——探针、引物和阳性对照(构建甲型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组克隆质粒)，经各反应条件的优化和特异性、敏感性和重复性试验，建立了甲型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法，一次试验即可同时特异性地检测甲型流感病毒、H1N1亚型流感病毒和H3N2亚型流感病毒。文档编号C12R1/93GK101818207SQ20091019328公开日2010年9月1日申请日期2009年10月26日优先权日2009年10月26日发明者廖明,廖秀云,徐海聂,杨素,沙才华,陈博文申请人:中华人民共和国珠海出入境检验检疫局