专利名称：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒的rt-pcr检测及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒的 RT-PCR检测及其专用引物。
背景技术：
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的RT-PCR检测方法是目前快速检测这2种病原的常用方法，被广泛应用于实验室病原诊断。与病毒分离的方法相比较，RT-PCR方法诊断更快速简便，病毒分离相对来说耗时长，在临床上不利于快速诊断，目前病毒病的实验室诊断主要应用PCR/RT-PCR方法，一些PRRSV、CSFV的RT-PCR试剂盒已经商品化并投入临床应用。当前猪病多病毒混合感染相当严重。临床上猪繁殖与呼吸障碍综合征常呈现 PRRSV和HP-PRRSV共存现象，不易区分，而由两种毒株引起的发病防控策略有所不同，因此鉴别诊断非常必要。商品化的PRRSV、CSFV检测RT-PCR试剂盒都是单项RT-PCR，I个试剂盒I次试验仅能检测一种病毒，对于可能混合感染了 PRRSV、HP-PRRSV、CSFV的同份猪病料要确诊病原就需要3种试剂盒并且要做3次RT-PCR实验，不仅费时费力，检测成本也较高, 既不经济也不快捷。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测病毒的专用引物。本发明提供的检测病毒的专用引物，包括引物对A和引物对B。所述弓丨物对A包括弓丨物I和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物I的核苷酸序列为序列表中的序列I所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列2所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列3所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列4。上述专用引物中的引物对A可以同时扩增出猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株CH-Ia和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株HuN4。上述专用弓丨物由所述弓I物对A和所述弓I物对B组成，所述引物对A由所述引物I和所述引物2组成，所述引物对B由所述引物3和所述引物4组成。上述弓I物对A和上述弓I物对B可独立包装。上述专用引物中，所述病毒为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒中的至少一种；所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。2/7页本发明的第二个目的是提供一种检测病毒的RT-PCR试剂。本发明提供的RT-PCR试剂，由所述的专用引物中的所述引物对A、所述引物对B、 dNTP、RNA酶抑制剂(Rnasin)、聚合酶和缓冲液组成所述引物对A中的所述弓I物I和所述弓I物2在所述RT-PCR试剂中的终浓度均具体为O. 5 μ M，所述弓I物对B中的所述弓I物3和所述弓I物4在所述RT-PCR试剂中的终浓度均具体为I μ M ; 所述RNA酶抑制剂在所述RT-PCR试剂中的终浓度为O. 4U/ μ L ；每种所述dNTP在所述RT-PCR试剂中的终浓度均为O. 4mM ；所述聚合酶在所述RT-PCR试剂中的终浓度均为O. IU/ μ L ；所述缓冲液由10 X RT-PCR Buffer、5 X RT-PCR enhancer 和 Quant Rtase 组成，购自天根生化科技有限公司，产品目录号KRl 13。所述病毒为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒中的至少一种；所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。本发明的第三个目的是提供一种检测病毒的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述RT-PCR试剂。在上述试剂盒中，所述病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒中的至少一种；所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒进一步具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。上述专用引物或上述RT-PCR试剂或上述试剂盒在检测病毒或制备检测病毒产品中的应用；所述病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒中的至少一种；所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒进一步具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。本发明的第四个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否含有病毒的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用上述专用引物或上述RT-PCR试剂或上述试剂盒中的所述引物对A和所述引物对B共同对待测样本进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物；检测RT-PCR扩增产物，若所述RT-PCR扩增产物的大小仅为525bp和435bp中的至少一种，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小仅为707bp，则样本中含有或候选含有猪瘟病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小为525bp和435bp中的至少一种与707bp，则样本
中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒。在上述方法中，若所述RT-PCR扩增产物的大小仅为525bp，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株；若所述RT-PCR扩增产物的大小仅为435bp，则样本中含有或候选含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小为525bp和435bp，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株；若所述RT-PCR扩增产物的大小为525bp和707bp，则样本中含有或候选含有猪繁
5殖与呼吸障碍综合征病毒经典株和猪瘟病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小435bp和707bp，则样本中含有或候选含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和猪瘟病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小为435bp、525bp和707bp，则样本中含有或候选含
有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和猪瘟病毒三种病毒；所述525bp的RT-PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列5 ；所述435bp的RT-PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列6 ；所述707bp的RT-PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列7。所述RT-PCR扩增中，以待测样本的RNA为模板；所述RT-PCR扩增的退火温度为55°C -58°C，所述RT-PCR扩增的退火温度具体为 53 0C ；所述检测RT-PCR扩增产物的方法为琼脂糖凝胶电泳或测序。本发明的第五个目的是提供一种检测病毒的引物对。本发明提供的一种检测病毒的引物对A由所述引物I和所述引物2组成；所述病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒；本发明还提供的一种检测病毒的引物对B由所述引物3和所述引物4组成；所述
病毒具体为猪痕病毒。上述引物对A在制备检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒株系产品中的应用也是本发明保护的范围，上述应用中，所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒株系具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株；或上述弓I物对B在制备检测猪瘟病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。在上述内容中，所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒CH-Ia株，所述高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株为HuN4。本发明的实验证明，本发明提供的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒CH-Ia株、高致病性变异株HuM和猪瘟病毒的多重RT-PCR检测方法，一次反应能同时检测出猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒CH-Ia株、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuM和猪瘟病毒3种病毒，所用2对引物特异性较好，引物相互之间有较低的同源性及互补性；所述引物敏感性较好最低能检测到RNA含量为O. 8ng/ul ;所述的多重RT-PCR方法特异性高，敏感性强，简便、 快速、经济、高效。经过与商品试剂盒比对，以及在临床上试用，检测结果准确，可以在临床大量样品的检测中广泛应用，从而提高PRRSV，HP-PRRSV和CSFV三种病毒的快速诊断水平， 在临床诊断上具有很好的应用前景。
图I为PRRSV、HP-PRRSV, CSFV多重RT-PCR以及单项RT-PCR电泳图结果图2 为 PRRSV、HP-PRRSV, CSFV RT-PCR 特异性电泳图结果图3为PRRSV、HP-PRRSV, CSFV多重RT-PCR及单项RT-PCR敏感性电泳图结果
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中PRRSV代表猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株，HP-PRRSV代表高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。实施例I、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的多重RT-PCR检测方法构建和专用引物的设计I、引物设计在GenBank中检索出HP_PRRSV(高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，Genbank号 EFl 12445)、PRRSV (猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株，Genbank号AY032626)、CSFV (猪瘟病毒，Genbank号AF092448)的部分已知序列。对病毒各基因区进行同源性分析,分别选取PRRSV的NSP2基因以及CSFV的E2基因中的一段基因作为PCR扩增的靶序列。利用 DNAMAN对靶序列进行引物设计，对设计出来的2种病毒引物(其中引物对A可以同时扩增出猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株)利用 DNAstar进行引物二聚体分析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体。选出扩增序列为 PRRSV(525bp)、HP-PRRSV(435bp)、CSFV(707bp)的如下2对引物，并对每对引物扩增序列的同源性或互补性进行分析。避免它们之间有较高的同源性或互补性，从而确定3种病毒的多重RT-PCR引物如下弓丨物对A由引物I和引物2组成，具体如下引物I :5’ GGGCGACAATGTCCCTAACG 3’(序列 I)；引物2 :5’ GAGTCGATGATGGCTTGAGC 3’(序列 2)；弓丨物对B由引物3和引物4组成，具体如下引物3 :5’ AGGGAAAGTACAATACAACC 3’ (序列 3)；引物4 :5’ CACCACCAAGACAACAAA 3’(序列 4)；2、RT-PCR反应条件优化 分别提取PRRSV和CSFV的病毒的RNA。PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒，Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) CH-Ia (经典株)记载在猪繁殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV) CH-Ia株基因型鉴定，童光志，仇华吉，彭金美，《中国兽医学报》1998年第2期，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；HP-PRRSV (高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒，High pathetic porcine reproductive and respiratory syndrome virus) HuN4记载在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及其分子流行病学分析，童光志，周艳君，郝晓芳，田志军，仇华吉，彭金美，安同庆，中国预防兽医学报，2007年05期，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得;CSFV(猪瘟病毒，Hog cholera virus)记载在猪瘟病毒GSLZ株的分离与鉴定，何小兵，贾怀杰，陈国华，房永祥，李玩生，曾爽，景志忠，《中国兽医科学》2011年，第2期，中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得。
分别提取PRRSV (经典株 CH-la)、HP-PRRSV (HuM)、CSFV 的 RNA，再分别以 PRRSV (经典株 CH-Ia)的 RNA、HP-PRRSV (HuN4)的 RNA、CSFV 的 RNA、PRRSV (经典株 CH-1 a) +HP-PRRSV (HuM) +CSFV混合RNA (体积比I I I)为模板，均以引物对A和引物对B共同作为引物，按照如下体系和程序进行RT-PCR扩增通过对RT-PCR反应条件优化，确定最佳的反应条件=RT-PCR扩增体系25 μ L， 上下游混合引物引物对A (各25 μ Μ) O. 5 μ L (各条引物的终浓度O. 5 μ Μ)、引物对B (各 50 μ Μ)0· 5 μ L(各条引物的终浓度 ΙμΜ)，RNA 模板 2 μ L，10XRT-PCR Buffer2. 5 μ L(购自天根生化科技有限公司，产品目录号KRl 13)，5 X RT-PCR enhancer5 μ L (购自天根生化科技有限公司，产品目录号KR113)，dNTP mixturedOmM each) I μ L(终浓度O. 4mM)， RNasin(40U/μ L)O. 25 μ L(终浓度0.4U/μ L), Hotmaster Taq polymerase (2. 5U/ μ L) I. 25 μ L (终浓度 O. IU/ μ L)，Quant Rtase，最后用水补充至 25 μ L。优化后的程序为50°C翻转录30min ;94°C预变性3min ;94°C变性30s，53°C退火 30s，65。。延伸 30s, 30 个循环；65°C延伸 10min，4°C保存。结果如图I所示，其中I为阴性对照，2为PRRSV+HP-PRRSV+CSFV目标基因片断，3 为CSFV目标基因片断，4为PRRSV目标基因片断，5为HP-PRRSV目标基因片断。可以看出， 2 得到 525bp，435bp 和 707bp 产物，3 得到 707bp，4 得到 525bp，5 得到 435bp。分别将上述RT-PCR产物送去测序，结果为525bp的RT-PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列5 (PRRSV的Genbank号 AY032626 的第 2748-3272 位核苷酸)； 435bp的RT-PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列6 (HP-PRRSV的Genbank号 EFl 12445 的第 2747-3181 位核苷酸)；707bp的RT-PCR产物的核苷酸序列为序列表中的序列7 (CSFV的Genbank号 AF092448 的第 2774-3480 位核苷酸);因此扩增产物通过测序，其序列与GenBank中查出CSFV和PRRSV的已知序列比较，证实是目的基因。说明，该引物组可以用来鉴定PRRSV病毒、HP-PRRSV病毒和CSFV病毒。3、特异性检测分别检测上述涉及的RT-PCR反应的引物对A、B特异性，方法如下I)引物对A特异性分别提取PEDV (猪流行性腹泻病毒)、TGEV (猪传染性胃肠炎病毒)、BVDV (牛病毒性腹泻病毒)的RNA ；PEDV (猪流行性腹湾病毒，Porcine Epidemic Diarrhea Virus)记载在猪流行性腹泻病毒的分离和鉴定，赖月辉，李嘉爱，邹永新，罗映霞，巫月生，吴文福，《广东畜牧兽医科技》2003年3期，广东省生物药厂粤生生物制品研究所，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；TGEV (猪传染性胃肠炎病毒，Transmissible Gastroenteritis Coronavirus),请提供拉丁名)记载在猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及全基因组序列分析，宋振辉，郭万柱，《病毒学报》2008年24卷05期，四川农业大学，动物生物技术中心，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；
BVDV(牛病毒性腹 写病毒，Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus),请提供拉丁名)记载在牛病毒性腹泻病毒BVDV-JL株的分离与鉴定，张淑琴，郭利，冷雪，张亭亭，吴永旺，武华，《中国预防兽医学报》，2011年03期，公众可从山东省动物疫病预防与控制中心获得；分别以CSFV、PEDV, TGEV, BVDV, PRRSV, HP-PRRSV 的 RNA 为模板，以弓 I物对 B 为引物，按照上述步骤2中的RT-PCR体系和程序进行扩增，结果如图2的1-6所示，其中I为 CSFV, 2 为 PRRSV，3 为 HP-PRRSV，4 为 PEDV，5 为 TGEV，6 为 BVDV，可以看出，只有 CSFV 有 707bp目的条带，未见其他非特异性带，说明引物对B特异性高。分别以CSFV、PEDV, TGEV, BVDV, PRRSV的RNA为模板，以引物对A为引物，按照上述步骤2中的RT-PCR体系和程序进行扩增，结果如图2的7-12所示，其中，7为PRRSV，8为 HP-PRRSV，9 为 CSFV，10 为 PEDV，11 为 TGEV，12 为 BVDV，可以看出，只有 PRRSV，HP-PRRSV 分别有525bp目的条带和435bp目的条带，未见其他非特异性带，说明引物对A特异性高。4、敏感性检测通过分光光度计测OD值，测得由步骤2得到的PRRSV的RNA的浓度为24000 μ g/ μ I，由步骤2得到的HP-PRRSV的RNA的浓度为24000 μ g/μ I,由步骤2得到的CSFV的RNA 的浓度为8000 μ g/μ I。分别将PRRSV的RNA、CSFV的RNA和HP-PRRSV的RNA进行10倍系列稀释后作为模板，以引物对A和引物对B共同为引物，按照步骤2的体系和程序进行扩增。结果见图3 (A)和图3 (B)所示，图3 (A)中1-7分别为PRRSV+HP-PRRSV+CSFV (混合体积比I : I : I)的RNA的IO1-IO7倍稀释，图3 (B)中1_7为CSFV的RNA的IO1-IO7倍稀释，8-14 为 PRRSV 的 RNA 的 IO1-IO7 倍稀释，15-21 为 HP-PRRSV 的 RNA 的 IO1-IO7 倍稀释； 可以看出，任何RNA，IO5倍稀释的模板有比较清晰地目的条带，IO6倍稀释的模板有比较弱的目的条带，稀释IO7倍及以上的模板已完全看不到目的条带。实验证明本发明的多重RT-PCR可以检测到PRRSV、HP-PRRSV的RNA的最小浓度均为24ng/ μ I，CSFV的RNA的最小浓度为8ng/ μ I。多重RT-PCV的敏感性与单项RT-PCR的敏感性无明显差别。5、重复性对PRRSV，HP-PRRSV, CSFV多重RT-PCR方法进行多次重复试验实验，结果稳定。实施例2、专用引物的应用对315份临床疑似病料(来源于山东省动物疫病预防与控制中心附设兽医院门诊送检的病死猪的肝、肾、肺组织混合样品(质量比为I : I : I)进行检测，具体如下提取315份临床疑似病料的RNA(编号为1_315)，用引物对A和B作为引物，按照步骤2的体系和程序进行RT-PCR扩增，若得到525bp的RT-PCR产物(序列表中的序列5)，则样本为PRRSV阳性；若得到435bp的RT-PCR产物(序列表中的序列6)，则样本为HP-PRRSV阳性；若得到707bp的RT-PCR产物(序列表中的序列7)，则样本为CSFV阳性；若得到525bp和435bp的RT-PCR产物，则样本为PRRSV阳性和HP-PRRSV阳性；若得到525bp和707bp的RT-PCR产物，则样本为PRRSV阳性和CSFV阳性；若得到707bp和435bp的RT-PCR产物，则样本为CSFV阳性和HP-PRRSV阳性；
若得到707bp，525bp和435bp的RT-PCR产物，则样本为CSFV阳性、PRRSV阳性和 HP-PRRSV 阳性；若均没有707bp，525bp 和 435bp 的 RT-PCR产物，则样本为 CSFV、PRRSV和 HP-PRRSV 均为阴性；结果如下编号为1-28的得到525bp的RT-PCR产物(序列表中的序列5)，则编号为1_28的样本为PRRSV阳性(共28份)，含有PRRSV ；编号为29-124的得到435bp的RT-PCR产物(序列表中的序列6)，则编号为 29-124的样本为HP-PRRSV阳性(共96份)，含有HP-PRRSV ；编号为125-230的得到707bp的RT-PCR产物(序列表中的序列7)，则编号为 125-230的样本为CSFV阳性(共106份)，含有CSFV ；编号为231-239的得到707bp和525bp的RT-PCR产物，则编号为231-239的样本为CSFV阳性和PRRSV阳性(共9份)，含有CSFV和PRRSV ；编号为240-261的得到707bp和435bp的RT-PCR产物，则编号为240-261的样本为CSFV阳性和HP-PRRSV阳性(共22份)，含有CSFV和HP-PRRSV ；编号为262-271的得到525bp和435bp的RT-PCR产物，则编号为262-271的样本为PRRSV阳性和HP-PRRSV阳性(共10份)，含有PRRSV和HP-PRRSV ；编号为272-277 的得到 525bp，435bp 和 707bp 的 RT-PCR 产物，则编号为 272-277 的样本为PRRSV阳性，HP-PRRSV阳性和CSFV阳性(共6份)，含有HP-PRRSV和CSFV ；编号为278-315的均没有525bp，435bp和707bp的扩增，，则编号为278-315的样本中没有感染PRRSV、HP-PRRSV和CSFV中的任一种。采用商品PRRSV检测试剂盒(购自北京世纪元亨)、CSVF检测试剂盒(北京世纪元亨)分别对上述315份样品进行单项RT-PCR，结果与本发明上述的结果一致，比对结果符合率为100%。以上实验说明，本发明的引物A和引物B组合的弓丨物组可以进行检测PRRSV、 HP-PRRSV和CSFV，而且方法快，准确率高。
权利要求
1.一种检测病毒的专用引物，包括弓I物对A和引物对B，所述引物对A包括引物I和引物2，所述弓I物对B包括引物3和引物4，所述引物I的核苷酸序列为序列表中的序列I ;所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；所述引物3的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述引物4的核苷酸序列为序列表中的序列4。
2.根据权利要求I所述专用引物，其特征在于所述专用引物由所述引物对A和所述引物对B组成，所述病毒为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒中的至少一种；所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。
3.—种检测病毒的RT-PCR试剂，由权利要求I或2所述的专用引物中的所述引物对 A、所述引物对B、dNTP、RNA酶抑制剂、聚合酶和缓冲液组成。
4.根据权利要求3所述RT-PCR试剂，其特征在于所述引物对A中的所述引物I和所述引物2在所述RT-PCR试剂中的终浓度均为O.5μΜ,所述引物对B中的所述引物3和所述引物4在所述RT-PCR试剂中的终浓度均为 ΙμΜ ；所述病毒为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒中的至少一种；所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。
5.一种检测病毒的试剂盒，包括权利要求3或4所述RT-PCR试剂；所述病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒中的至少一种；所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒进一步具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。
6.权利要求I或2所述专用引物或权利要求3或4所述RT-PCR试剂或权利要求5所述试剂盒在检测病毒或制备检测病毒产品中的应用；所述病毒具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒中的至少一种；所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒进一步具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株。
7.—种检测或辅助检测待测样本是否含有病毒的方法，包括如下步骤用权利要求I或2所述专用引物或权利要求3或4所述RT-PCR试剂或权利要求5所述试剂盒中的所述弓I物对A和所述弓I物对B共同对待测样本进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR 扩增产物；检测RT-PCR扩增产物，若所述RT-PCR扩增产物的大小仅为525bp和435bp中的至少一种，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小仅为707bp，则样本中含有或候选含有猪瘟病毒； 若所述RT-PCR扩增产物的大小为525bp和435bp中的至少一种与707bp，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于若所述RT-PCR扩增产物的大小仅为525bp，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株；若所述RT-PCR扩增产物的大小仅为435bp，则样本中含有或候选含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小为525bp和435bp，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株；若所述RT-PCR扩增产物的大小为525bp和707bp，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株和猪瘟病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小435bp和707bp，则样本中含有或候选含有高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和猪瘟病毒；若所述RT-PCR扩增产物的大小为435bp、525bp和707bp，则样本中含有或候选含有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和猪瘟病毒三种病毒;所述525bp的RT-PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列5 ；所述435bp的RT-PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列6 ；所述707bp的RT-PCR产物的核苷酸序列具体为序列表中的序列7。
9.一种检测病毒的引物对，为引物对A或引物对B，所述引物对A由所述引物I和所述引物2组成；所述引物对B由所述引物3和所述引物4组成。
10.权利要求I或2所述专用引物中的所述引物对A在制备检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒株系产品中的应用，所述猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒株系具体为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株或高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株；或权利要求I或2所述专用引物中的所述引物对B在制备检测猪瘟病毒产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒的RT-PCR检测及其专用引物。本发明提供了检测病毒的专用引物，包括引物对A和引物对B，所述引物对A包括引物1和引物2，所述引物对B包括引物3和引物4，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本发明提供的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪瘟病毒的多重RT-PCR检测方法，一次反应能同时检测出猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒经典株、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒株和猪瘟病毒3种病毒，在临床诊断上具有很好的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK102586477SQ20121003415
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者兰邹然, 孙圣福, 张栋, 李云岗, 杜兰荣 申请人:山东省动物疫病预防与控制中心