专利名称：基因群检测结构的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种基因群检测结构，尤指涉及ー种改进原尼龙膜片操作平台的缺点，特别是指建立全新低成本的WEnCA (Weighted Enzymatic Chip Array)操作平台，可辅以自动化操作使检测时间大幅降低，并减少人为操作误差，以达突破芯片检测技术在商品化过程所面临的瓶颈。
背景技术：
对基因过渡表现(Overexpression)的分析已经导致疾病诊断的基本进步与临床进展。而研究基因过渡表现的技术包含有北方墨点法(Northern Blot)、反转录聚合酶链锁反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及实时定量聚合酶链锁反应(Real-Time PCR)。其中Northern Blot由于操作步骤十分敏琐,所需检体量又过多，因此仅限于研究操作上，无法实际应用于临床诊断。至于RT-PCR及Real-Time PCR由于操作步骤简便，因此在单一基因检测的应用上，使用相当广泛，例如肝炎病毒的检测及感染症病原菌的鉴定。然而，虽然PCR序列的发明作为整体最伟大的实验，但多数PCR技术仍保有特定的共同问题，其主要问题包含有其一是污染，过渡灵敏侦察的伪阳性，例如雾式的DNA或先前的样品残余；其ニ是RT-PCR仅被认为半定量，因为当比较不同的样品时，难以控制序列放大的效率；以及其三是由于所需引子(Primer)间黏合(Annearling)的干扰，无论RT-PCR或Real-Time PCR都仅广泛应用于单一基因标的的检测，当检测标的为基因群时，则PCR相关的技术则有操作耗时、费事及高成本等缺点。随着近几年来生物科技的快速发展，生物芯片于临床医学诊断或药效评估上的应用逐渐被重视，本发明的先前研究已开发并且评估ー尼龙膜芯片(Membrane Array)方法，能使用于癌症诊断，在血液检体(Peripheral Blood)中同时查出一多种mRNA标记引物的表达水平。其分子标志的表达水平由RT-PCR与尼龙膜芯片评估，数据从RT-PCR与尼龙膜芯片取得，且受制于线性回归分析，显示在这两个方法结果之间的高度相互关系(r=0.979，P〈0.0001)。另外，以相关衍生技术的加权化学冷光型基因芯片(WeightedChemiluminescent Membrane Array, WCHMA)用于肺癌(Lung Cancer)患者的血液检体分析标的治疗药物(Target Therapeutic Drug)的作用标的K_ras的异常情形，也已被接受刊登于肺癌期刊中。虽然尼龙膜芯片于分子诊断及药效评估上的应用已有许多报告提出，然而，由于原始尼龙膜芯片所使用判读方法上，对于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下，造成检测特异性在达到一定程度之后便不易提升。另外，由于呈色型芯片(ColorimetricBiochip)操作平台所需使用的洋地黄毒(Digoxigenin)系统成本十分昂贵,导致检测成本过高，再加上芯片操作的高技术门坎，使得即使目前已经发展及评估成熟的诊断芯片仍不易普及于临床医学应用。故，一般无法符合使用者于实际使用时所需
发明内容
本发明的主要目的是针对现有技术所遭遇的上述问题，提供ー种基因群检测结构，ー种快速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于结合自动化的WEnCA-Chipball操作平台。本发明的次要目的在于，提供一种不需大型离心机而易于在各个实验自动化操作的结构。本发明的另一目的在于，提供一种采用包含Poly-T引子的磁珠以利萃取的mRNA纯度更高，使反应后的芯片背景值降低而准确度高的结构。本发明的再一目的在于，提供ー种以生物素-抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)取代Digoxigenin,不仅使用的酵素成本低，且以ニ氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)作为呈色剂的稳定度亦高，使顔色容易保存的结构。本发明的又一目的在于，提供ー种以基因加权计算值的决定方式，配合ROC Curve 决定阳性判读标准，并经临床测试结果显示的准确度能更准确地辅助疾病诊断的结构。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是ー种基因群检测结构，该结构包括
基因检测芯片，选定与癌症相关的标的基因群，将包含多种目标基因的标的基因群与内部对照组及空白对照组三重复点阵于ー尼龙膜片上，形成在该基因检测芯片上被覆有标定特定序列；
检体前处理单元，以包含Poly-T弓丨子的磁珠纯化得检体中的mRNA，将此mRNA经由反转录为cDNA后,再以酵素标定成探针；
杂合反应区，用以将该探针与该基因检测芯片进行杂合反应；
芯片呈色単元，用以将该基因检测芯片上杂合后的探针加上ニ氨基联苯胺呈色剂进行呈色反应；以及
分析判读单元，内建有分析软件与影像撷取模式及数据传输模式，用以撷取该基因检测芯片呈色反应后的影像，并对呈色反应后的影像结果进行自动化分析，将分析后所得的侦测值以基因加权计算方式，依据每个基因对于疾病形成或抗药性发生的重要性给予个别加权分数，再经由阳性反应基因点乘上基因点的加权值而得到芯片的总分。上述标的基因群给予的个别加权分数分为四个等级，当基因点在80个以上的癌组织中呈现过渡表现的，加权值为4 ;当基因点在70 80个癌组织中呈现过渡表现的，カロ权值为3 ;当基因点在60 70个癌组织中呈现过渡表现的，加权值为2 ;以及当基因点在50 60个癌组织中呈现过渡表现的，加权值为I。且该分析判读单元以接受者操作特性曲线方式算出该基因检测芯片的阳性判读标准值，该阳性判读标准值为20±20%。如此，该结构提供了ー种快速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于结合自动化的WEnCA-Chipball操作平台，易于在各个实验操作，并易于自动化，可进行快速生物检体检测分析，完成传统生医检测上所无法达成的目标。可于临床上提高诊断灵敏性、特异性及准确性的同时，结合自动化操作系统更可使检测时间大幅降低，并减少人为操作误差，以达突破芯片检测技术在商品化过程所面临的瓶颈。
图I是本发明的基因群检测结构示意图。
图2是本发明基因检测芯片的基因位置排列示意图。图3A是本发明的标的基因群在癌组织中过渡表现的比例示意图。图3B是本发明的接受者操作特性曲线示意图。图4是本发明癌症组织反应后的芯片影像示意图。图5是本发明的检测极限值的判读结果示意图。图6是本发明的线性回归统计分析示意图。标号说明
基因群检测结构100 基因检测芯片10 检体前处理单元20杂合反应区30
芯片呈色単元40分析判读单元50
接受者操作特性曲线6
具体实施例方式 请參阅图I及图2所示，分别为本发明的基因群检测结构示意图及本发明基因检测芯片的基因位置排列示意图。如图所示本发明为ー种基因群检测结构(WEnCA-Chipball)100，至少包括基因检测芯片10、检体前处理单元20、杂合反应区30、芯片呈色単元40及分析判读单元50所构成。上述所提的基因检测芯片10上被覆有标定特定序列，为具有建构完整疾病诊断、药效评估或遗传性致病基因的筛检芯片。该检体前处理单元20将检体加入裂解缓冲液打破细胞，萃取得mRNA，经由加入包含Poly-T引子的磁珠(Magnetic Particles)与细胞内的RNA结合,将磁珠上的核酸与裂解缓冲液冲洗分离，继而洗提(Elute)出磁珠上的mRNA，并将此纯化而得的mRNA经由反转录为cDNA后，再以酵素标定成探针(Probe)，其中，该检体可为血液、体液、细胞培养及组织细胞等。该杂合反应区30用以将该探针与该基因检测芯片10进行杂合(Hybridization)反应，并将未反应的探针由芯片上洗浄。该芯片呈色単元40用以将该基因检测芯片10上杂合后的探针加上ニ氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)呈色剂进行呈色反应(Color Development)。该分析判读单元50内建有分析软件与影像撷取模式及数据传输模式，用以影像撷取模式撷取该基因检测芯片10呈色反应后的影像，并对呈色反应后的影像结果以分析软件进行自动化分析，将分析后所得的侦测值以基因加权计算方式，依据每个基因对于疾病形成或抗药性发生的重要性给予个别加权分数，经由阳性反应基因点乘上基因点的加权值而得到芯片的总分(Total Score).以上所述，构成全新的基因群检测结构100。本发明主要是针对原尼龙膜片操作平台的缺点，设计改进策略，例如在判读时，针对芯片上每ー标的基因不同的重要性给予不同程度的加权(Lung Cancer Ref )，另以生物素-抗生物素蛋白(Biotin-Avidin)呈色系统取代原洋地黄毒(Digoxigenin)系统,建立全新的WEnCA (Weighted Enzymatic Chip Array)操作平台，另由于此结构易于结合流体控制平台，以自动化操作系统进行，使得检测时间大幅度降低，并减少人为操作差异所产生的误差，进而突破芯片检测技术在商品化过程所面临的瓶颈。为进一歩了解基因群检测结构于临床医学检测上的实用性，本发明于一较佳实施例中，取得100个临床病理科确认为大肠直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)患者的血液检体，以先前建构的活化K-ras致癌基因检测芯片(Activated K_ras Detection Chip)10分别利用尼龙膜片及本结构100 (即WEnCA-Chipball)检测检体中K_ras路径相关基因(K_ras Pathway Related Genes)过渡表现(Overexpression)的情形，并比较灵敏度(Sensitivity)、特异性(Specificity)及准确性(Accuracy)的差异，且分析本结构100与原尼龙膜片操作的检测平台于临床应用时，操作时间与所需成本的不同，以更确立本结构100于临床应用的发展潜力。上述建构的活化K-ras致癌基因检测芯片10，如图2所示，系选定与大肠直肠癌相关的标的基因群，将包含22种目标基因的标的基因群与一内部对照组(InternalControl)及一空白对照组(Blank Control)三重复点阵于ー尼龙膜片上,其中，该标的基因群为 ATP2A2、ATP6V0B、CXCR4、CYR61、RAP1B、RPL30、BMPR2、CALM2、DVL3、E2F4、SLC25A5、SPPI、CEBPB、CLSTNl、ETSI、H2AFZ、TAF12、TBX19、C0L4AI、CXCL11、LICAM 及 LRPI，且该内部对照组为P -肌动蛋白(P -actin)。
请參阅图3A及图3B所示，分别为本发明的标的基因群在癌组织中过渡表现的比例示意图、及本发明的接受者操作特性曲线示意图。如图所示在加权冷光芯片反应的分析上，本发明首先整理芯片上22个基因点分别在100个具活化型K-ras突变的癌症组织(cancer tissue)中过渡表现的比例，并将之分为四个等级,如图3A所示,基因点在80个以上的癌组织中呈现过渡表现的，加权值为4 ;在70 80个癌组织中呈现过渡表现的，カロ权值为3 ;过渡表现仅在60 70个癌组织中存在的基因点，加权值为2 ;若仅能50 60个癌组织中测得过渡表现的基因点，加权值为I。经由两组各100个反应后芯片上阳性反应的基因数，乘上加权值之后，先计算出每一反应后的芯片的总分，而后同样以组织是否实际具有可测得的突变点作为标准參考值。经由生物统计学分析画出接受者操作特性曲线(Receiver Operating Characteristic Curve, ROC Curve)6,如图 3B所不，可看出当判断此芯片阳性反应的基准值(Cutoff Value)定为20时，此芯片在组织中的检测结果，其灵敏度可达96%，特异性亦可达97%。请參阅图4所示，为本发明癌症组织反应后的芯片影像示意图。如图所示为上述癌症组织反应后的芯片影像图，依带有K-ras基因突变的癌症组织(cancer tissue withK-ras mutation),以CAKM称之；以及依带有原生型K-ras基因的癌症组织(cancer tissuewith wild type K_ras)以CAKWT称之。其中CAKM-I及CAKM-2反应后的总分分别为36及32，皆大于20，因此芯片反应结果为阳性(Positive) ；CAKffT-1及CAKWT-2反应后的总分分别为8及6，皆小于20，因此芯片反应结果为阴性(Negative)。请參阅图5所示，为本发明的检测极限值的判读结果示意图。如图所示在本发明基因群检测结构的检测极限值(Detection Limitation)的实验结果判读上，由图中可见当5C. C全血分别加入100、50、25及12个具活化突变K_ras基因(activated mutant K-ras)的癌细胞所得的总分都大于20，仅在加入的细胞数为6吋，总分等于8，小于20，因此检测极限值约2. 4cell/C. C Blood，远较呈色型芯片所测得的5cell/C. C Blood更为灵敏。请參阅图6所示，为本发明的线性回归统计分析示意图。如图所示系本发明进一步分析上述两种方法(即本发明与已知技木)所得结果的一致性，经线性回归统计分析后可见，r值为0. 86，有统计学上显著的一致性呈现，可见本发明相较已知技术明显具有较高的灵敏度及较佳的准确度。据此，本发明揭露可提供一快速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于结合自动化的WEnCA-Chipball操作平台，可进行快速生物检体检测分析，完成传统生医检测上所无法达成的目标。由于本发明不需大型离心机，因此易于在各个实验操作，并易于自动化，且采用包含Poly-T引子的磁珠以利萃取的mRNA纯度更高，使反应后的芯片背景值降低，准确度高。此外，本发明以Biotin-Avidin取代Digoxigenin,不仅使用的酵素成本低，且以DAB作为呈色剂的稳定度亦高，顔色容易保存；再者，本发明亦在最后的结果判读上以基因加权计算值的决定方式，配合ROC Curve决定阳性判读标准，经上述临床测试结果显示本结构的准确度能更准确地辅助疾病的诊断。因此本发明可于临床上提高诊断灵敏性、特异性及准确性的同时，结合自动化操作系统更可使检测时间大幅降低，并减少人为操作误 差，以达突破芯片检测技术在商品化过程所面临的瓶颈。综上所述，本发明的基因群检测结构，可有效改善现有技术的种种缺点，可提供一1决速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于自动化的WEnCA-Chipball操作平台，可进行快速生物检体检测分析，完成传统生医检测上所无法达成的目标，进而能产生更进步、更实用、更符合使用者的所须，确已符合发明专利申请的要件，依法提出专利申请。惟以上所述者，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施之范围；故，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作之简单的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖之范围内。
权利要求
1.一种基因群检测结构，其特征在于该结构包括 基因检测芯片，选定与癌症相关的标的基因群，将包含多种目标基因的标的基因群与内部对照组及空白对照组三重复点阵于一尼龙膜片上，形成在该基因检测芯片上被覆有标定特定序列； 检体前处理单元，以包含Poly-T弓丨子的磁珠纯化得检体中的mRNA，将此mRNA经由反转录为cDNA后,再以酵素标定成探针； 杂合反应区，用以将该探针与该基因检测芯片进行杂合反应； 芯片呈色单元，用以将该基因检测芯片上杂合后的探针加上二氨基联苯胺呈色剂进行呈色反应；以及 分析判读单元，内建有分析软件与影像撷取模式及数据传输模式，用以撷取该基因检测芯片呈色反应后的影像，并对呈色反应后的影像结果进行自动化分析，将分析后所得的侦测值以基因加权计算方式，依据每个基因对于疾病形成或抗药性发生的重要性给予个别加权分数，再经由阳性反应基因点乘上基因点的加权值而得到芯片的总分。
2.如权利要求I所述的基因群检测结构，其特征在于所述基因检测芯片为具有建构完整疾病诊断、药效评估或遗传性致病基因的筛检芯片。
3.如权利要求I所述的基因群检测结构，其特征在于所述标的基因群给予的个别加权分数分为四个等级，当基因点在80个以上的癌组织中呈现过渡表现的，加权值为4;当基因点在70 80个癌组织中呈现过渡表现的，加权值为3 ;当基因点在60 70个癌组织中呈现过渡表现的，加权值为2 ;以及当基因点在50 60个癌组织中呈现过渡表现的，加权值为I。
4.如权利要求I所述的基因群检测结构，其特征在于所述分析判读单元以接受者操作特性曲线方式算出该基因检测芯片的阳性判读标准值。
5.如权利要求4所述的基因群检测结构，其特征在于所述阳性判读标准值为20 ±20%。
6.如权利要求I所述的基因群检测结构，其特征在于所述基因群检测结构的检测极限值为 2. 4cell/C. C Blood±20%。
7.如权利要求I所述的基因群检测结构，其特征在于所述标的基因群为ATP2A2、ATP6V0B、CXCR4、CYR61、RAPIB、RPL30、BMPR2、CALM2、DVL3、E2F4、SLC25A5、SPPI、CEBPB、CLSTNI、ETSI、H2AFZ、TAF12、TBX19、C0L4AI、CXCL11、LICAM 及 LRPI。
8.如权利要求I所述的基因群检测结构，其特征在于所述内部对照组为￠-肌动蛋白。
9.如权利要求I所述的基因群检测结构，其特征在于所述检体为血液、体液、细胞培养或组织细胞。
全文摘要
一种基因群检测结构，至少包括基因检测芯片、检体前处理单元、杂合反应区、芯片呈色单元及分析判读单元所构成。藉此，可提供一快速、精确、灵敏、低成本、大量分析且易于结合自动化的WEnCA-Chipball操作平台，可进行快速生物检体检测分析，完成传统生医检测上所无法达成的目标。
文档编号C12M1/34GK102766573SQ20121003320
公开日2012年11月7日 申请日期2012年2月15日 优先权日2011年5月5日
发明者张惠人, 曹德安, 林绣茹 申请人:辅英科技大学附设医院