专利名称：一种聋病易感基因slc26a4 ivs7-2a>g荧光检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A > G及Amelogenin 基因座的荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术：
SLC26A4基因与弧立的大前庭水管综合征及Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)的关系密切，临床上表现为先天性或后天性耳聋，耳聋发生或加重与外伤、感冒有关。通过颞骨CT扫描可以得出结论，但目前由于设备和专业人员的限制，中国大部分地区的医院不能进行高分辨率的颞骨CT扫描，导致许多地区无法诊断大前庭水管综合征。通过对SLC26A4基因的检测，则可以在全国范围内实现对80 %以上大前庭水管综合征的准确诊断，并先于CT检查发现和确诊大前庭水管综合征，这一方法可以避免放射线检查的辐射问题，更易为患者家属接受，并且由于基因诊断操作能够批量进行，可以在大标本范围内进行筛查。大量研究表明，存在于中国人群突变热点区域为SLU6A4基因外显子 8的侧翼序列的IVS7-2A > G0目前常用的基因检测方法有直接测序(direct sequencing, DS)、连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)、限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、变个生高效液才目色 i普分析(denaturing high performance liquid chromotography，DHPLC)、定量PCR、基因芯片。这些方法都存在不同的缺陷，例如操作繁琐、结果不易判读、重复性差、假阴性假阳性多等问题。采用荧光标记技术、毛细管电泳技术，通过带荧光标记物的引物对SLC26A4基因的IVS7-2A > G位点特异性的扩增，并在此引物中掺入核酸类似物提高引物的Tm值，进一步增强引物的特异性，而后经毛细管电泳后分析PCR产物出峰情况，即可实现对耳聋基因位点的检测。该方法灵敏度高、判读清晰准确，仅需采取少量血样或口腔拭子样本，即可进行检测，采样方便尤其适合新生婴幼儿样本的采集。
发明内容
本发明目的是提供一种聋病易感基因SLU6A4突变热点IVS7-2A > G荧光检测试剂盒。为了实现上述目的，采取的技术方案一种聋病易感基因SL(^6A4突变热点 IVS7-2A > G荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2, dNTPs的混合物，Taq酶，2对引物混合物以及超纯水；所述扩增后试剂包括用于基因分型的对应于SLC26A4基因突变热点IVS7-2A > G检测和Amelogenin性别鉴定基因座的等位基因标准物的混合物和内标R0X-300 ；
使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件PCR扩增体系的PH值为 8. 0-9. 0，镁离子浓度为1.5-3. 5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μΜ，Taq酶的用量为 0. 1-0. 4U/ μ L，2对引物混合物中的单对引物终浓度为0. 2-0. 4 μ M0使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增SLC26A4基因的IVS7-2A > G和Amelogenin基因座。用于SLC26A4基因IVS7(-2)位点A>G突变检测的引物为SEQ NO. 01和SEQ NO. 02. X。SEQ NO. 02. X为下列掺入了 LNA核苷的引物中的任意一条(LNA核苷以黑体字表示)SEQ NO. 02. 1 :5，-G T TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3‘SEQ NO. 02. 2 :5，-GTTTTTAACATCT T TTGTTTTATTTAG-3，SEQ N0. 02. 3 :5，-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTT J G-3，。用于Amelogenin基因座检测的弓| 物为SEQ N0. 03 5，-CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，、SEQ NO. 04 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。所述的2对引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，所用的荧光染料可以为相同或不同的荧光素。所述复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA ；所述的来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/ 口腔拭子样本、FTA卡血斑/ 口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、羊水。使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行， 扩增程序:94-980C l-5min J6-32 个循环的 94_98°C 15_60s，55_65°C 15_60s，72°C 15-60 ； 60 °C 30-60min。对于IVS7-2位点突变的检出，使用的带荧光标记并经LNA核苷单体掺入修饰的引物，提高了引物的Tm值，缩短了引物长度，从而增加了引物的灵敏度和特异性，防止假阳性和假阴性的出现。对于Amelogenin的检出，一方面是内参的作用指示模板DNA是否有效或浓度范围；另一方面能有效指示是否存在PCR产物污染，防止因污染产生的假阳性。
图1是本发明的试剂盒(采用不同荧光染料标记)对突变个体血斑来源DNA扩增后的分型结果；图2是本发明的试剂盒(采用不同荧光染料标记)对正常个体血斑来源DNA扩增后的分型结果；图3是本发明的试剂盒(采用相同荧光染料标记)对突变及正常个体血斑来源 DNA扩增后的分型结果。图4是经修饰和未修饰的引物对同一男性确证病例不同浓度DNA的分型结果。图5是经修饰和未修饰的引物对同一男性正常个体不同浓度DNA的分型结果。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。实施例1聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A > G荧光检测试剂盒检测突变及正常个体的DNA样本，用于聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A > G检测的引物采用蓝色荧光染料6-FAM标记，用于Amelogenin基因座扩增的引物采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA ；内标采用红色荧光染料标记，荧光标记物为R0X。1、待测样本100份，都已经使用“DNA提取-PCR扩增-测序”的技术方法对SLC26A4 突变热点IVS7-2位点进行过测序检测，其中突变样本5份。2、检材的基因组DNA提取Chelex提取法剪下1 3mm血斑置于1. 5mL离心管中，加入SdH2O lmL，振荡离心，弃上清液，重复步骤两次，弃上清液，将5 % Chelex-IOO震荡悬浮后快速用剪掉的枪头吸取200 μ L加入离心管中，振荡数秒，。于56°C水浴保温30min后，振荡数秒。95°C沸水浴 IOmin,轻微振荡数秒。2000rpm离心5min，上清中为提取的DNA。3、扩增和扩增产物的检测分析3. IPCR 扩增体系
权利要求
1.一种聋病易感基因SLC26A4 IVS7-2A > G荧光检测试剂盒，其特征在于包括DNA 聚合酶及其缓冲溶液、扩增IVS7-2A > G&Amel0genin基因座的引物、及基因突变位点 IVS7-2A > G和Amelogenin基因座的基因分型标准物和内标。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于突变热点IVS7-2A> G检测的引物为 SEQ ID NO. 01 和 SEQ ID NO. 02. X ；SEQ NO. 01 :5’ -CCAGCATTGTAATTTTTTTCCAGG-3’SEQ NO. 02. 1 :5，-G T TTTTAACATCTTTTGTTTTATTTAG-3‘SEQ NO. 02. 2 5' -GTTTTTAACATCT T TTGTTTTATTTAG-3’SEQ N0. 02. 3 :5，-GTTTTTAACATCTTTTGTTTTATTT A G"3'其中LNA核苷以黑体字表示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述Amelogenin基因座检测的引物为SEQ N0. 03 :5’ -CCCTGGGCTCTGTAAAGAAT-3，SEQ N0. 04 :5’ -GCAGAGCTTAAACTGGGAAGC-3，。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的用于IVS7-2A> G和 Amelogenin扩增的引物，每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述突变热点IVS7-2A> 6检测的引物和用于Amelogenin基因座扩增的引物可以采用相同或不同的荧光染料标记；内标选用不同于上述的荧光染料标记。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述IVS7-2A> 6和Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
7.一种快速检测聋病易感基因SLU6A4突变热点IVS7-2A > G的方法，其特征在于通过荧光引物PCR及毛细管电泳特异性检测聋病易感基因SLU6A4突变热点IVS7-2A > G及 Amelogenin基因座；用于SLC26A4基因IVS7-2位点A > G突变检测的引物为SEQ NO. 01 和SEQ NO. 02. X所示；用于Amelogenin基因座检测的引物如SEQ N0. 03、SEQ NO. 04所示； 所述IVS7-2A > 6和Amelogenin基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种检测聋病易感基因SLC26A4突变热点IVS7-2A＞G的荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括PCR缓冲液、MgCl2和dNTPs的反应混合物，Taq酶，超纯水，高特异性扩增IVS7-2A＞G及Amelogenin基因座的引物混合物；所述扩增后试剂包括基因分型标准物和内标。本发明以IVS7-2A＞G、Amelogenin基因座为检测对象，通过上述耳聋易感基因位点的扩增，毛细管电泳检测，与基因分型标准物的对比，即可筛选出含有上述位点突变的个体。对聋病易感基因的检测，尤其是对新生儿耳聋基因的筛查具有重要意义；在耳聋基因筛查领域中首次复合采用了荧光标记技术、LNA核苷单体掺入-引物修饰技术、毛细管电泳技术实现对耳聋基因位点IVS7-2A＞G的高灵敏度特异性检测。
文档编号C12Q1/68GK102559910SQ20121003312
公开日2012年7月11日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者万戈江, 夏子芳, 步讯, 魏宏泉 申请人:北京科聆金仪生物技术有限公司