专利名称：一种人结直肠癌肿瘤细胞系及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞系，尤其涉及一种人结直肠癌肿瘤细胞系，该细胞系表达正常干细胞自我更新相关因子，具有高克隆形成能力和体内成瘤能力，具有肿瘤干细胞特征，及其可应用于肿瘤干细胞的研究、药物开发和相关领域。
背景技术：
癌症是严重威胁人类生存和健康的疾病。近几十年来，随着科学的发展，人们对于癌症的认识有了显著的深入。但是传统的治疗方式并不能彻底治愈癌症，复发和转移往往是导致癌症病人死亡的原因。研究发现肿瘤组织无论是原发肿瘤还是转移癌中都包含有不同特征和功能的癌细胞:高度分化的癌细胞增殖能力较弱；而具有低分化表型的癌细胞却具有很强的增殖能力，移植到免疫缺陷小鼠体内能够产生和原发肿瘤表型类似的肿瘤，有此功能的这部分细胞被称为肿瘤干细胞(Al-Hajj and Clarke，2004)。
近年来，支持肿瘤干细胞学说的研究不断涌现，目前从脑瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌等癌组织中分离和鉴定出肿瘤干细胞，研究发现肿瘤干细胞具有与正常干细胞相似的生物学特性(Spillane and Henderson, 2007 ；Sagar et al., 2007),包括自我更新、分化、死亡耐受、膜转运活跃、侵袭和转移等。目前通过对肿瘤干细胞的研究认识到，癌症的发生和生长是由一小部分肿瘤干细胞群决定的，肿瘤干细胞有着不同于普通癌细胞和正常细胞的生物学特征，目前已经发现肿瘤干细胞的特征包括I)在肿瘤中存在比例很低，仅有数很少的一群癌细胞具有无限增殖能力；2)具有肿瘤形成能力，通过流式细胞技术或其他免疫分选技术根据表面特异分子分离出来的细胞接种到动物体内能够形成新的肿瘤。
肿瘤干细胞一般在肿瘤中所占比例低，它们通常处于细胞周期的GO期，具有较高的耐药性，对射线不敏感性。常规的化疗或放疗只能杀死快速分裂的普通癌细胞，而对这一小群肿瘤干细胞作用甚微。逃脱药物和射线杀伤作用的肿瘤干细胞成为癌症复发和转移的根源。肿瘤干细胞能够启动肿瘤发生,并且这一小群细胞能够维持肿瘤生长,肿瘤干细胞的特征为开发新型高效的诊断和治疗手段提供了新思路。按照肿瘤干细胞的理论模型，常规的治疗方式不能有效地清除肿瘤干细胞，杀死普通癌细胞只能暂时缓解癌症，癌症的转移和复发在所难免。尽管目前临床上有多种非常成功的治疗肿瘤的药物，可以有效缓解肿瘤，但是这种药物并没有治愈疾病，相当大比例的患者会发生癌症复发。原因是传统抗肿瘤药物的筛选是根据短期临床治疗效果评估的，因此那些能迅速杀死大量普通癌细胞的药物往往被筛选出来，能够杀伤肿瘤干细胞的药物反而因为作用时间长、短期疗效不明显而被剔除。而针对肿瘤干细胞的药物虽然`在短期内效果不太明显，但是由于遏制癌症发展的源头，长期效果更加显著。肿瘤干细胞模型为设计高效彻底治愈癌症的治疗方法提供了思路:通过传统治疗杀死普通癌细胞，针对肿瘤干细胞特异性靶点来抑制肿瘤干细胞功能或清除肿瘤干细胞，可能会达到既疗效显著又能彻底治愈的效果。更精确地靶向肿瘤干细胞的药物疗效将会更加持久，副作用更小，可能达到完全治愈的目的。
肿瘤干细胞的概念为癌症的发生、发展、转移和复发提供了新的思路，这方面的深入研究有可能为肿瘤的治疗和早期诊断带来新的契机。寻找肿瘤干细胞特异标志及信号通路，找到能有效杀伤肿瘤干细胞的方法和手段，将为癌症的治疗提供新的思路。然而制约肿瘤干细胞研究的主要困难在于肿瘤干细胞数目稀少，且在体外培养容易分化为普通癌细胞。
目前国内外尚无肿瘤干细胞系的报道，肿瘤干细胞主要来源于运用流式细胞分选技术从临床样本中获得特定表面蛋白(如⑶44，⑶133，⑶24等)标记的原代癌细胞，这就导致了肿瘤干细胞活力低和样本之间差异大的问题。由于原代肿瘤干细胞在普通体外培养条件下极易分化程普通癌细胞，极大制约了肿瘤干细胞的深入研究。发明内容
因此，本发明的目的是针对现有条件的不足，提供一种具有肿瘤干细胞特征的细胞系，从而能够更为有效地进行杀伤肿瘤干细胞的药物开发，从根本上治疗肿瘤。
本发明的另一目的是提供一种肿瘤干细胞的建系方法，其用于分离、鉴定肿瘤干细胞特征，还提供一种长期培养肿瘤干细胞系的技术，用于在标准培养体系内获得稳定和充足的肿瘤干细胞来源。
针对上述目的，本发明的技术方案如下:
一方面，本发明提供一种表达CD44膜蛋白的人结直肠癌肿瘤干细胞系，所述细胞系为保藏号为CGMCC N0.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C (该细胞系的分类命名为人结肠癌干细胞，并于2011年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编:100101)。
另一方面，本发明提供一种人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C的指示细胞系，所述细胞系通过将0tc3/4启动子连接EGFP基因的质粒转染于本发明所述的细胞系而得。
优选地，所述细胞系能够形成肿瘤。
优选地，所述细胞系形成的肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤。
优选地，所述形成的肿瘤能够发生转移。
更优选地，所述形 成的肿瘤能够转移到肝脏。
再一方面，本发明提供一种高表达CD44膜蛋白的人结直肠癌肿瘤干细胞系的制备方法，包括以下步骤:
I)分离原代结肠癌干细胞:取结肠癌组织剪碎后，消化获得单细胞悬液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647单抗和小鼠抗人⑶44FITC单抗孵育；再用无菌流式细胞分选技术分离出原代结肠癌细胞；
2)原代结肠癌干细胞的体外培养:稀释步骤I)获得的原代细胞，接种于96孔板中进行培养；
3)结肠癌干细胞的培养及鉴定:当原代细胞形成的悬浮球状克隆直径达到0.5毫米左右时，离心去上清，再将其消化后，以1: 5的比例重新接种到新鲜细胞培养液中，筛选体内成瘤能力和体外克隆形成能力的P6C细胞；
4)将步骤3)获得的结肠癌干细胞再次按与步骤I)、2)和3)相同的方法分离、培养筛选表达⑶44膜蛋白的肿瘤干细胞系P6C，即得。
优选地，还包括将0tc3/4启动子连接于EGFP基因的质粒转染于步骤4)获得的肿瘤干细胞系。
又一方面，本发明提供一种上述所述的细胞系或所述的方法制得的细胞系在制备用于诱导肿瘤形成的药物中的应用。
另一方面，本发明提供一种上述所述的细胞系或所述的方法制得的细胞系在制备用于转移肿瘤的药物中的应用。
再一方面，本发明提供一种上述所述的细胞系或所述的方法制得的细胞系在制备筛选抗肿瘤药物中的应用。
本发明的肿瘤干细胞系表达肿瘤干细胞表面标志蛋白，具有极高的克隆形成你能力和体内成瘤能力，并对多种临床抗肿瘤药物具有极强的耐药性，能够在体外稳定培养，从而细胞系材料应用于肿瘤和肿瘤干细胞的药物开发。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
图1表明流式细胞仪分选EpCAM+CD44+的原代结肠癌细胞的试验结果图，其中，图1A为流式细胞仪分选EpCAM+原代结肠癌细胞的点样分布图，图中I为不表达EpCAM的细胞，2为表达EpCAM的细胞；图1B为流式细胞仪分选EpCAM+CD44+原代结肠癌细胞的试验结果图2表明EpCAM+⑶44+原代结肠癌干细胞的克隆形成能力；
图3表明EGFP指示本发明所述肿瘤干细胞系P6C的指示细胞系的0ct3/4启动子的激活状态；
图4表明流式细胞技术分析本发明所述的肿瘤干细胞系P6C膜蛋白表达的试验结果，其中，图4A为本发明所述肿瘤干细胞系P6C的膜蛋白表达的流式细胞分析图，其中Ml表示不表达该膜蛋白，即阴性；M2表示表达该膜蛋白，即阳性；图48为本发明所述的肿瘤干细胞系P6C膜蛋白相对表达量柱状图5表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C表达干细胞因子0ct3/4，其中，图5A为细胞系P6C表达的内源性0ct3/4免疫荧光结果，图5B为细胞系P6C的DAPI染核结果，图5C为A与B荧光叠加结果；
图6表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C具有很高的克隆形成能力，其中，图6A为发明所述的肿瘤干细胞系P6 C、HCTl 16和SW480的克隆结果图，图6B为本发明所述的肿瘤干细胞系P6C、HCT116和SW480克隆数量统计图7表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C的皮下成瘤能力；
图8表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C能够在原位形成肿瘤，并能够转移到肝脏。
图9表明本发明所述的肿瘤干细胞系P6C对喜树碱(camptothecin)具有很高的耐药性，其中，图9A为喜树碱处理本发明所述的肿瘤干细胞系P6C、HCT116和SW480的细胞形态图，其中的对照为未经药物处理的细胞形态，图9B为喜树碱处理本发明所述的肿瘤干细胞系P6C、HCTl 16和SW480存活细胞统计本发明的生物材料的保藏信息:
保藏号为CGMCC N0.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C，该细胞系的分类命名为人结肠癌干细胞，并于2011年12月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编:100101ο具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用的裸鼠品种均为BALB/c nude，购自中国医学科学院动物所；结肠癌组织，取自北京肿瘤医院；结肠癌细胞系HCT116和SW480均购自ATCC。
除非特别指明，以下实施例中所用的细胞培养液均为:2%胎牛血清(购自Hyclone公司)，8%血清替代物(购自Gibco), IX非必须氨基酸(购自Gibco), 100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的DMEM培养液(购自Gibco)。
除非特别指明，以下实施例所用的DAPI染核方法参见:Karen G.Porter andYvette S.Feig,The Use of DAPI for Identifying and Counting Aquatic Microflora,Limnology and oceanography，1980 年，25 (5)期(卷)，943-948 页。
实施例1分离、鉴定原代结肠癌干细胞
a)分离原代结肠癌干细胞:取结肠癌病人新鲜结肠癌组织(取自北京肿瘤医院)，在含有300单位/毫升(U/mL)青霉素和300U/mL链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗3次；用无菌眼科剪将其剪碎；加入I毫克/毫升(mg/mL)胶原酶(购自Sigma公司)和lmg/mL透明质酸酶(购自Sigma公司)消化液,于37°C消化30分钟(min);离心去上清,PBS重悬后用40微米细胞筛过滤获得单细胞悬液。将细胞与小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647单抗(I: 50，购自Cell Signaling公司)，小鼠抗人CD44FITC单抗(I: 50，购自BD公司)一起4°C孵育15分钟；然后用无菌流式细胞分选技术(FACS)分离出EpCAM+CD44+的原代结肠癌细胞。图1A中红色点即2为表达EpCAM的细胞，即EpCAM+ ;图1B细胞均为图1A中红色点细胞(图1中的2)，即EpCAM+，其中P2为表达EpCAM，表达⑶44的细胞，即EpCAM+⑶44+，P3为表达EpCAM，不表达CD44的细胞，即EpCAM+CD44_。
b)原代结肠癌干细胞的体外培养:稀释原代细胞，以平均0.5个细胞/孔的密度接种在96孔板中，培养条件为2%胎牛血清(购自Hyclone公司)，8%血清替代物(购自Gibco)，I X非必须 氨基酸(购自Gibco)，100U/mL青霉素，100 μ g/mL链霉素的DMEM培养液(购自Gibco),于37°C、5% 二氧化碳、95%空气的恒温培养箱(购自Sanyo公司)中进行培养。三天换细胞培养液一次，取单细胞来源的克隆。
c)结肠癌干细胞的培养及鉴定:当原代细胞形成的悬浮球状克隆直径达到0.5毫米左右时，300g离心5分钟，去上清；加入0.25%胰蛋白酶(购自Sigma公司)，37°C消化10分钟；轻轻将细胞球吹散后以1: 5的比例重新接种到新鲜细胞培养液中。体内成瘤能力和体外克隆形成能力是鉴定肿瘤干细胞特征的两个金标准。上述低粘附板中的球状克隆长至0.5_直径时，用玻璃管小心吸出单个克隆球，接种到裸鼠(BALB/c nude，购自中国医学科学院动物所)皮下，观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，计算体积。当皮下肿瘤长轴达到5mm或40天时，处死裸鼠，剥取皮下肿瘤。部分肿瘤继续接种到裸鼠皮下，检测次级皮下肿瘤的发生；部分肿瘤固定在10%中性福尔马林溶液中，石蜡包埋切片，免疫组化方式检测CD44等肿瘤干细胞表面蛋白的表达，苏木素/伊红(H&E)染色观察皮下肿瘤的组织形态；还有部分肿瘤用胶原酶/透明质酸酶消化成单细胞悬液，流式细胞技术分析CD44等肿瘤干细胞相关蛋白的表达。除体内成瘤实验以外，传代中的单细胞悬液经过计数以后接种1000个到0.35%软琼脂中，21天以后用结晶紫染色，所有克隆均可以被染上蓝紫色(图2)。只统计直径大于等于0.5mm的克隆的数目，计算克隆形成能力(=克隆数目/1000X 100%)o
实施例2建立具有肿瘤干细胞特征的细胞系
a)表达CD44膜蛋白的肿瘤干细胞系的建立:用上述方法分离、培养获得的结肠癌细胞具有肿瘤干细胞的特征，具有极高的肿瘤形成能力和克隆形成能力，命名为P6C。P6C能在体外稳定传代，目前已经传代到第120代。P6C在低粘附培养条件下形成悬浮的克隆球，在粘附条件下能贴壁形成干细胞样克隆(holoclone)。
b)0ct3/4启动子激活指示细胞系的建立:0ct3/4启动子被调控激活状态下EGFP表达发出绿色荧光，以此指示干细胞因子0ct3/4的活化状态。转染细胞系P6C的前一天，将细胞系P6C从克隆球中用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，预铺于铺有明胶的六孔板中(2X IO5个细胞/孔)。0ct3/4promoter EGFP质粒(该质粒为0ct3/4启动子克隆到EGFP基因上游的质粒)，购自上海交通大学医学院，取2 μ g该质粒与6 μ L脂质体lipo2000 (购自Invitrogen公司)的混合物；6小时后吸去质粒_脂质体，加入细胞培养液，隔天换细胞培养液(与前述细胞培养液一致)。第三天收集所有细胞，通过流式细胞仪分选表达EGFP的细胞，于新鲜细胞培养液中贴壁培养；1周以后再次收集细胞，流式分选表达EGFP的细胞；重复分选I次，把分选到的细胞以平均0.5个细胞/孔的密度接种到96孔板中，得到EGFP绿色突光指示0ct3/4启动子激活状态的P6C指示细胞,如图3所示。
实施例3肿瘤干细胞系P6C的分化特性检测
a)将贴壁培养的细胞系P6C用0.2%胰蛋白酶37°C消化成单细胞悬液，计数，加入PH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)至终浓度为IO6个细胞/毫升。
b)分别加入荧光标记的小鼠抗人单克隆抗体ant1-⑶24 (I: 50，购自Biolegend) ;anti_CD44(l: 50,购自 BD pharmingen) ;anti_CD133 (1: 50,购自Miltenyi) ;ant1-CD45_FITC(I: 50，购自 BD pharmingen) ;anti_CD31(l: 50，购自 BDpharmingen) ;anti_CKl (1: 50,购自 Santa Cruz) ；ant1-CK20 (1: 50,购自 Santa Cruz)；ant1-CDX2(l: 100，购自 DAKO)。
c)4°C孵育20分 钟，然后用流式细胞仪检测对应抗原的表达情况；FITC标记的山羊抗小鼠IgG与P6C细胞系孵育作为阴性对照。
如图4所示，表明细胞系P6C表达上皮细胞标志物⑶24，癌症干细胞标志物⑶44，⑶133 ;不表达内皮来源标志物⑶45，⑶31 ;低表达分化的癌细胞标志物CK1、CK20、⑶X2。球状克隆状态的P6C(P6MC)表达更多的肿瘤干细胞标志蛋白⑶44和⑶133。结肠癌细胞系SW480作为分化癌细胞对照。
实施例4肿瘤干细朐系P6C表汰干细朐闵子0ct3/4
a)在低粘附培养板中如实施例1所述条件下培养肿瘤干细胞系P6C，收集P6C球状克隆。
b)加入多聚甲醒(购自Sigma公司)固定20分钟，2N HCl处理20分钟。
c)加入小鼠抗人0ct3/4单克隆抗体(购自Santa Cruz公司)，室温孵育3小时。
d)加入Cy3标记的抗小鼠IgG 二抗。
e) DAPI复染细胞核后封片。
如图5所示，荧光显微镜下检测到P6C表达内源性0ct3/4，且与DAPI染色结果重合，表明0ct3/4定位于细胞核中。
实施例5肿瘤干细胞系P6C体外克隆形成能力检测
a)细胞系P6C用0.2%胰蛋白酶37°C消化10分钟，玻璃管吹打成单细胞悬液，计数。
b) IOOOrpm离心去上清，加入细胞培养液(同前所述)至终浓度IO4个细胞/毫升。
c)取20微升P6C单细胞悬液接种于六孔板，每4_5天更换新鲜细胞培养液。
d)21天以后吸去细胞培养液，pH7.2磷酸盐缓冲液洗I次。
e)加入1%结晶紫(购自Sigma公司)染色，PBS洗一次。计算每孔克隆数量，结果如图6所示，显示P6C的克隆形成能力显著高于结肠癌细胞系HCT116和SW480。
实施例6肿瘤干细胞系P6C在免疫缺陷小鼠皮下形成肿瘤
a) 2 X IO6个P6C细胞接种在六孔板中，加入如前所述的细胞培养液培养24小时。
b)将DsRed红色荧光质粒(购自中国科学院动物研究所)I μ g与3 μ L转染试剂(购自Origen公司)在200 μ L无血清DMEM中混合均匀，滴入预铺P6C细胞的六孔板中，共同孵育6小时。
c)吸去细胞培养液混合物，加入如前所述细胞培养液，24小时之后在荧光显微镜下观察红色荧光，估算转染效率。
d)往细胞培养液中加入0.5 μ g/mL终浓度的嘌呤霉素(puromycin)(购自Sigma公司)，隔天吸去死细胞并加入新鲜细胞培养液(含嘌呤霉素)，重复4次，获得稳定表达DsRed红色荧光蛋白的P6C细胞。
e)0.2%胰蛋白酶消化此细胞成单细胞悬液，并以平均0.5个细胞/孔的密度接种于96孔板中。14天后取形成的单细胞克隆接种于裸鼠(BALB/cnude，购自中国医学科学院动物所)皮下，用活体荧光成像的方法检测皮下肿瘤的形成，如图7所示。
实施例7肿瘤干细胞系P6C能在免疫缺陷小鼠盲肠形成原位肿瘤
a)以3X IO5个细胞/mL细胞培养液的密度将稳定表达DsRed红色荧光的P6C肿瘤干细胞系接种在底面积为25cm2的培养瓶中，加入如前所述的细胞培养液培养24小时，获得对数生长期的细胞。
b)0.2%胰蛋白酶消化此细胞成单细胞悬液，计数，并以2X107个细胞/mL的浓度重悬在磷酸盐缓冲液PBS中。
c) 100 μ L 3%戊巴比妥溶液腹腔注射联合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID，购自中国医学科学院动物所)，待5分钟小鼠麻醉后在超净工作台剪开小鼠腹膜，暴露盲肠。
d)用胰岛素针吸取50 μ L P6C细胞悬液，并将细胞悬液移植到盲肠肠壁。
e)手术缝合小鼠腹膜和皮肤，4周后用活体荧光成像的方法检测盲肠原位肿瘤的形成，如图8所示。
实施例8肿瘤干细胞系P6C形成的肿瘤能够转移到肝脏
a)以3X IO5个细胞/mL细胞 培养液的密度将稳定表达DsRed红色荧光的P6C肿瘤干细胞系接种在底面积为25cm2的培养瓶中，加入如前所述的细胞培养液培养24小时，获得对数生长期的细胞。
b)0.2%胰蛋白酶消化此细胞成单细胞悬液，计数，并以2X107个细胞/mL的浓度重悬在磷酸盐缓冲液PBS中。
c) 100 μ L 3%戊巴比妥溶液腹腔注射联合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID，购自中国医学科学院动物所)，待5分钟小鼠麻醉后在超净工作台剪开小鼠腹膜，暴露盲肠。
d)用胰岛素针吸取50 μ L P6C细胞悬液，并将细胞悬液移植到盲肠肠壁。
e)手术缝合小鼠腹膜和皮肤，12周后用活体荧光成像的方法检测肿瘤转移到肝脏，如图8所示。
实施例9肿瘤干细胞系P6C的耐药性
a)将P6C细胞克隆球用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，预铺于铺有明胶的六孔板中(2 X IO5个细胞/孔)，培养24小时。
b)加入终浓度为2 μ M, 5 μ M喜树碱(Camptothecin,购自Sigma公司),培养24小时至48小时。
c)明场显微镜下观察细胞形态，按与步骤b)相同的方法处理的普通结肠癌细胞系HCT116(购自ATCC)和SW480作为一般结肠癌细胞系耐药性对照，未加喜树碱处理的P6C、HCT116和SW480细胞作为阴性对照。
d)收集所有贴壁和悬浮的细胞，AnnexinV/PI染色(Manon van Engeland, LucJ.W.Nieland, Fran s C.S.Ramaekers, Bert Schutte, and Chris P.M.Reutelingsperger,Annexin V-Affinity Assay:Α Review on an Apoptosis Detection System Based onPhosphatidylserine Exposure，Cytometry, 1998 年，31 期，1-9 页)，流式细胞技术检测活细胞比例。
试验结果如图9所示，图示浓度和作用时间下细胞形态的检测(图9A)和MTT细胞活力检测(Denis Gerlier, Nicole Thomasset，Use of MTT colorimetric assay tomeasure cell activation,Journal of Immunological Methods，94 卷，1-2 期，57-63 页，1986年)(图9B)都显示相对于结肠癌细胞HCT116和SW480，P6C都具有高耐药性。
权利要求
1.一种表达CD44 I吴蛋白的人结直肠癌肿瘤干细胞系，所述细胞系为保减号为CGMCCN0.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C。
2.一种人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C的指示细胞系，所述细胞系通过将Otc3/4启动子连接EGFP基因的质粒转染于权利要求1所述的细胞系而得。
3.根据权利要求1或2所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系能够形成肿瘤。
4.根据权利要求3所述的细胞系，其特征在于，所述肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤。
5.根据权利要求4所述的细胞系，其特征在于，所述肿瘤能够发生转移，优选地，所述肿瘤能够转移到肝脏。
6.根据权利要求1所述的细胞系的制备方法，包括以下步骤: 1)分离原代结肠癌干细胞:取结肠癌组织剪碎后，消化获得单细胞悬液，再加入小鼠抗人EpCAM Alexa Fluor647单抗和小鼠抗人⑶44 FITC单抗孵育；再用无菌流式细胞分选技术分离出原代结肠癌细胞； 2)原代结肠癌干细胞的体外培养:稀释步骤I)获得的原代细胞，接种于96孔板中进行培养； 3)结肠癌干细胞的培养及鉴定:当原代细胞形成的悬浮球状克隆直径达到0.5毫米左右时，离心去上清，再将其消化后，以1: 5的比例重新接种到新鲜细胞培养液中，筛选体内成瘤能力和体外克隆形成能力的P6C细胞； 4)将步骤3)获得的结肠癌干细胞再次按与步骤I)、2)和3)相同的方法分离、培养筛选表达⑶44膜蛋白的肿瘤干细胞系P6C，即得。
7.根据权利要求6所述的细胞系的制备方法，其特征在于，还包括将Otc3/4启动子连接EGFP基因的质粒转染于步骤4)获得的肿瘤干细胞系。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞系或权利要求6或7所述的方法制得的细胞系在制备用于肿瘤形成或转移肿瘤的药物中的应用。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞系或权利要求6或7所述的方法制得的细胞系在制备筛选抗肿瘤发生、肿瘤生长或肿瘤转移的药物中的应用。
10.根据权利要求8或9所述 的应用，其特征在于，所述肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤。
全文摘要
本发明提供一种人结直肠癌肿瘤干细胞系及其制备方法和应用，所述细胞系为保藏号为CGMCC No.5558的人结直肠癌肿瘤干细胞系P6C，所述细胞系的制备方法，包括以下步骤1)分离原代结肠癌干细胞；2)原代结肠癌干细胞的体外培养3)结肠癌干细胞的培养及鉴定；4)将步骤3)获得的结肠癌干细胞再次按与步骤1)、2)和3)相同的方法分离、培养筛选表达CD44膜蛋白的肿瘤干细胞系所述细胞系的应用为其在制备用于诱导肿瘤形成的药物、用于肿瘤转移的药物和筛选抗肿瘤发生、抗肿瘤生长和抗肿瘤转移药物中的应用。
文档编号C12N5/10GK103243074SQ20121003312
公开日2013年8月14日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者陈佺, 杜蕾, 王珺, 金海京, 王晓慧 申请人:中国科学院动物研究所