专利名称：3d adcc nk facs测定法的制作方法
3D ADCC NK FACS 测定法本文中报告了一种基于由淋巴瘤细胞和天然杀伤细胞形成的三维球状体(spheroid)或聚集体的新的抗体依赖性细胞毒性-FACS测定法。此测定法可用于单一及高通量形式的对治疗性免疫球蛋白的体外功能分析。
背景技术：
已建立的肿瘤细胞系的单层培养物经常在基础肿瘤生物学研究和抗肿瘤药物开发中使用。然而，二维的、平坦的培养模型不能充分反映三维(3D)肿瘤构造。因此，涉及溶质扩散梯度的体内形成的特定方面只能在三维培养系统，像例如多细胞肿瘤球状体或聚集体模型中研究。肿瘤球状体或聚集体模拟无血管肿瘤区，其特征在于由多细胞层所致扩散屏障引起的有限的营养物供应。然而，研究中3D培养物的普遍使用受限于不便的生成和操作。因此，开发出一种简单且快速的方法来以高通量方式生成悬浮培养的单一球状体或聚集体。具有相等大小 和同质球面几何学的单一球状体或聚集体可以在24小时培养期内在96孔板的单个孔中生成。它是一种标准化的培养形式，易于化合物操作和球状体收获以供随后分析。一致的大小和几何学保证在每个球状体或聚集体中形成几乎相同的扩散梯度(IvaSCu，A.和Kubbies, M.，J. Biomol. Screening 11 (2006) 922-932)。已知的球状体生成方案包括添加鼠基底膜提取物(rBM)，即胞外基质蛋白的一种混合物，其诱导聚集体压缩成球状体。Inami, K.等报告了抗C-ERC/间皮蛋白(mesothelin)单克隆抗体的体内抗肿瘤活性(Cancer Sci. 101(2010)969-974)。发明概述已经发现了凭借三维球状体或聚集体中肿瘤细胞和天然杀伤细胞的组合，在一方面，可以使免疫球蛋白的评估更像体内，并且在另一方面，其现在适合于高通量分析。如本文中报告的第一方面是一种用于在体外检测抗体的效应器功能的方法，包括将包含肿瘤细胞和天然杀伤细胞的三维球状体或聚集体与免疫球蛋白一起温育的步骤。在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤a)用第一荧光染料标记肿瘤靶细胞，b)混合天然杀伤细胞和肿瘤靶细胞，c)将每200 μ I约104个细胞添加至多孔板的孔，d)离心所述多孔板，并且由此启动三维细胞球状体的形成，e)将免疫球蛋白添加至所述多孔板的孔，f)将所述多孔板温育约20小时至约72小时，g)用第二荧光染料标记孔中的死细胞，并i)通过荧光激活细胞分选(FACS)来分析所述多孔板的孔中的细胞，并且由此检测所述抗体的效应器功能。在一个实施方案中，天然杀伤细胞是人天然杀伤细胞，并且具有90%或更多的纯度。在又一个实施方案中，天然杀伤细胞和肿瘤靶细胞以10:1至1:10的比率混合。在又一个实施方案中，比率是1:3至1:10的。在另一个实施方案中，比率是1:2至1:4的。在一个实施方案中，离心以100至1，OOOrpm持续10分钟。在又一个实施方案中，离心为约
I,OOOrpm0在一个实施方案中，第二荧光染料是碘化丙啶。在一个实施方案中，温育持续约20小时至约28小时。在一个实施方案中，肿瘤细胞是淋巴瘤细胞。在另一个实施方案中，淋巴瘤细胞选自下组Raji细胞、SU-DHL4细胞、和Z138细胞。在另一个实施方案中，以孔中100 μ g/ml至O. 001 μ g/ml的终浓度添加抗体。在又一个实施方案中，以孔中20 μ g/ml至O. I μ g/ml的终浓度添加抗体。在一个实施方案中，以孔中8 μ g/ml至12 μ g/ml的终浓度添加抗体。如本文中报告的又一方面是包含肿瘤细胞和天然杀伤细胞的三维球状体或聚集体用于高通量分析众多抗体和众多肿瘤细胞的组合的用途。
如本文中报告的另一方面是一种用于在体外确定具有效应器功能的抗体的方法，包括a)提供至少一种抗体，b)用第一荧光染料标记肿瘤细胞，c)混合天然杀伤细胞和肿瘤靶细胞，d)将每200 μ I约IO4个细胞添加至多孔板的孔，e)离心所述多孔板，并且由此启动三维细胞球状体的形成，f)将每种提供的抗体添加至所述多孔板的各个孔，g)将所述多孔板温育约20小时至约72小时，h)用第二荧光染料标记每个温育孔中的死细胞，i)通过荧光激活细胞分选来分析所述多孔板的每个孔，并j)将具有最闻比率或超过I的死细胞与活细胞比率的抗体确定为具有效应器功能的抗体。还有，如本文中报告的一个方面是试剂盒，其包含a)用荧光染料标记的肿瘤细胞，b)分离的天然杀伤细胞，c) 96孔多孔板，和d)碘化丙啶。在一个实施方案中，多孔板是96孔多孔板。发明详述本文中报告了一种基于使用三维球状体或聚集体共培养测定法的细胞分析技术，其中该球状体或聚集体包含肿瘤细胞和天然杀伤细胞。此测定法在一个实施方案中可用于单一和高通量形式的对免疫球蛋白的体外功能分析。在一个实施方案中，将单一三维球状体或聚集体在已经用聚HEMA(聚(羟乙基甲基丙烯)酸)包被的96孔圆底多孔板的每孔中放置。在又一个实施方案中，NK细胞是正常的二倍体人天然杀伤(NK)细胞。在一个实施方案中，已经通过应用负选择技术，即在选择步骤期间不触碰细胞(见例如Horgan, K.等，Curr.Prot. Tmmunol · (2009),第 7 章，第 7. 4 单兀 Immunomagnetic purification of T cellsubpopulations,及Neurauter, A. A.等，Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 106(2007) 41-73)选择NK细胞。已经发现了，用这些NK细胞有可能定量活细胞和死细胞的正确百分比。用单层培养物实施肿瘤生物学领域中的大多数体外实验，因为这些是容易且方便操作的。然而，虽然它们提供了研究独特功能的有价值模型，但是单层培养物由于缺乏基质组分、胞外基质和二维(2D)培养物与三维(3D)实体瘤间的基础几何差异而不能充分反映肿瘤病理生物学。细胞的三维构造提供了例如与影响细胞分化、增殖和存活的激素、生长因子和营养物的分布和功能相关的细胞-细胞和细胞-基质相互作用的复杂网络。在一个实施方案中，用于自聚集体生成三维球状体的方法包括对培养基添加自Engelbreth-Holm-Swarm鼠肿瘤衍生的重建基底基质(rBM, Matrigel ),即一种含有胞外基质组分诸如胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、触觉蛋白(entactin)(巢蛋白(nidogen))、和蛋白聚糖的蛋白质性凝胶。三维结构容许共培养肿瘤细胞与成纤维细胞、免疫和内皮细胞，实现在体外调查肿瘤/基质相互作用效果(Friedrich, J.,等，Int. J. Radiat.Biol. 83(2007)849-871)。在旋转器(spinner)(Sutherland, R. Μ.和 Durand, R. E. , Recent Results CancerRes. 95 (1984) 24-49)和回旋旋转技术(gyratory rotation technique) (Moscona, A. , Exp.Cell Res. 22(1961)455-475)中，将经胰蛋白酶处理的细胞在具有磁搅拌器的培养容器中 放置，抑制细胞附着于基质，并且促进细胞-细胞粘着。在一种新近开发的技术中，在倒置微板的悬滴中培养球状体(Kelm’J.M·，等，Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 173-180)。然而，所有这些方法受限于较长的培养时间、不等大小的球状体的形成、或困难的机械可达性(mechanical accessibility)。另外,在悬浮培养物中,许多肿瘤细胞系在三维的紧密球状体中较差地生长(Mueller-Klieser, ff.，Crit. Rev. Oncol. Hematol. 36 (2000) 123-139)。研究中以高通量方式使用球状体或聚集体需要如下的标准化方案，其以容易存取(accessible)的多孔板形式快速生成具有相似扩散梯度和细胞生理学的同质大小的球状体，以供随后的生物化学或细胞分析用。此外，此类方案应当可适用于极其多种肿瘤细胞系O已经发现了可以用如本文中报告的方法满足此需要。因此，如本文中报告的一个方面是一种用于检测抗体的效应器功能的测定法，包括a)用绿色荧光团CMFDA (5_氯甲基荧光素二乙酸酯)标记淋巴瘤(靶)细胞，b)自人血液，在一个实施方案中，以超过90%的纯度分离人正常的天然杀伤(NK)细胞，c)以1:10至10:1的比率混合NK和淋巴瘤靶细胞，d)将每200 μ I约IO4个细胞添加至多孔板的一些或所有孔，e)离心多孔板，f)将感兴趣的免疫球蛋白添加至多孔板的孔，g)将多孔板温育多至72小时，在一个实施方案中，温育20小时至72小时，h)将碘化丙啶添加至孔，并i)通过FACS分析多孔板的孔中的细胞。已经发现了，通过组合淋巴瘤细胞和天然杀伤细胞，可以提供灵敏的抗体依赖性细胞的细胞毒性测定法。在一个实施方案中，检测抗体的效应器功能是检测或测定抗体的抗体依赖性细胞的细胞毒性。另外，肿瘤和免疫效应器功能细胞的三维测定设置也是有利的。在一个实施方案中，如本文中报告的方法是体外方法。在另一个实施方案中，肿瘤细胞和天然杀伤细胞的混合导致三维球状体的形成。
在图I和2中，显示了通过FACS分析的活细胞和死细胞的分布。图Ia显示了通过FACS分析测定的用CMFDA标记的活的和死的Raji细胞的分布。活的Raji细胞位于FACS图的右下部分。图Ib和Ic显示了在没有添加抗体的情况中Raji细胞和天然杀伤细胞的共培养物中活细胞和死细胞的分布。活的天然杀伤细胞位于FACS图的左下部分，活的Raji细胞位于FACS图的右下部分，死的天然杀伤细胞位于FACS图的左上部分，而死的Raji细胞位于FACS图的右上部分。从图Ib (Raji与NK细胞的比率为I: I)和Ic (Raji与NK细胞的比率为1:10)看，可以看出在没有抗体的情况中并且不依赖于Raji细胞与天然杀伤细胞的比率，相应的活的和死的淋巴瘤细胞的百分比没有显著改变。
图2a显示了在与抗体一起温育后对活的和死的Raji细胞的FACS分析。与图Ia的FACS图比较,可以看出通过仅将Raji细胞与抗体一起温育,死细胞的分数由于抗体的直接细胞死亡诱导功能而增加。在存在NK细胞的情况中，死的Raji细胞的数目由于ADCC效应器功能而增加甚至更多(右上簇图2bRaji/NK比率I: I和图2c Raji/NK比率1:10)。可以看出通过添加天然杀伤细胞，可以提高测定法的灵敏性。在所述测定法中，将多孔板离心，在一个实施方案中，以1，OOOg持续10分钟。在离心期间，每孔内的所有细胞在孔的底部成团粒。这对于启动每孔中的单一球状体或聚集体的形成确保相等细胞数目。在图3中，显示了各个组分，即Raji细胞、天然杀伤细胞和抗体的添加顺序对测定法的影响。可以看出平行添加所有三种组分略微，但不显著引起较高的细胞死亡率。然而，为了更紧密模拟体内情况，在一个实施方案中，所述测定法包括在添加要测试的抗体前形成淋巴瘤-NK三维球状体或聚集体。可以用任何肿瘤(靶)细胞实施如本文中报告的测定法。在一个实施方案中，肿瘤细胞是淋巴瘤细胞。在又一个实施方案中，淋巴瘤细胞选自Raji细胞、SU-DHL4细胞、和Z138细胞。在一个实施方案中，在使用粘着生长的癌或肉瘤肿瘤细胞作为肿瘤细胞时，在存在液体重建的基底膜(rBM)的情况中实施三维球状体的形成。在一个实施方案中，使用
2.5%浓度的rBM(v/v)。在此实施方案中，将所有细胞掺入一个具有圆形几何学的独特球状体中。在培养时间24小时后完成形成和压缩。因此,在一个实施方案中,温育持续20小时至28小时。较低浓度的rBM不确保所有细胞掺入球状体中，而较高浓度损害球状体的圆形几何学。在10分钟离心步骤后，孔内的所有细胞掺入一个平坦的团粒中。3小时后，一定程度的压缩在存在和没有rBM的情况中变得明显。在没有rBM的情况中，在6小时和24小时后未能观察到聚集体的进一步变紧。在一个实施方案中，肿瘤细胞是Raji细胞，并且rBM在该方法的所有步骤中是缺乏的。在一个实施方案中，将5000个细胞在具有10% FCS (胎牛血清)和2. 5%rBM(v/v)的RPMI 1640中离心。在24小时培养期后分析球状体大小。所有球状体在形状上是规则的，展现出一致的圆形几何学，而且展现出较窄的大小变化。在图4中，用不同淋巴瘤肿瘤(祀)细胞系和用不同抗体浓度实施如本文中报告的测定法。可以看出可以用不同淋巴瘤细胞系以相同效率实施如本文中报告的测定法。可以进一步看出，可以以10 μ g/ml至O. I μ g/ml的抗体浓度实施测定法。因此，在一个实施方案中，如本文中报告的测定法包括添加O. I μ g/ml至15μ g/ml，在又一个实施方案中，8μ g/ml至12 μ g/ml的浓度的抗体。在图5中，显示了如本文中报告的测定法的灵敏性，其取决于淋巴瘤细胞与天然杀伤细胞的比率。可以看出淋巴瘤(靶)细胞与天然杀伤细胞的1:1至1:10的比率指示NK细胞的ADCC效应器功能。因此，在一个实施方案中，淋巴瘤细胞与天然杀伤细胞的比率是1:1至1:10，在另ー个实施方案中，1:3至1:10，在又一个实施方案中，1:2至1:4。凭借如本文中报告的测定法，可以在24小时培养期内平行地在多孔板的单个孔或多个孔中生成具有较窄的大小分布和同质球面几何学的单一三维球状体或聚集体。已经显示了这可以是ー种标准化的培养形式，易于化合物操作和球状体收获以供随后分析。球状体或聚集体的几乎一致的大小和几何学保证每个球状体中相似扩散梯度的形成。因此，如本文中报告的ー个方面是ー种自动化的或高通量的測定法，其包括如上文概述的測定法。球状体生成方案包括添加鼠基底膜提取物(rBM)，即胞外基质蛋白质的ー种混合物，其诱导聚集体压缩成球状体。、在图6中，显示了用于生成三维球状体的ー个例示性方案。本文中报告了一种用于在体外检测抗体的效应器功能的方法，包括将包含肿瘤细胞和天然杀伤细胞的三维球状体或聚集体与抗体一起温育。在一个实施方案中，所述方法包括下列步骤-混合天然杀伤细胞和肿瘤细胞，-将每200μ I约IO4个细胞添加至多孔板的孔，-离心所述多孔板，并且由此诱导三维球状体或聚集体的形成，-将免疫球蛋白添加至所述多孔板的孔，-将所述多孔板温育约20小时至约72小时，并-通过荧光激活细胞分选来分析所述多孔板的孔中的细胞，并且由此检测所述抗体的效应器功能。在又一个实施方案中，所述方法另外包括以下步骤作为第一歩-用第一荧光染料标记肿瘤细胞。在另ー个实施方案中，所述方法包括进ー步的步骤-用第二荧光染料标记死细胞，并-通过荧光激活细胞分选来分析所述多孔板的孔中的细胞，并且由此检测所述抗体的效应器功能。在一个实施方案中，天然杀伤细胞是人天然杀伤细胞。在又一个实施方案中，以10:1至1:10的比率混合天然杀伤细胞和肿瘤细胞。在又一个实施方案中，比率是1:2至1:4。在一个实施方案中，温育持续约20小时至约28小时。在一个实施方案中，离心以1，OOOrpm持续10分钟。在一个实施方案中，肿瘤细胞是淋巴瘤细胞。在又一个实施方案中，淋巴瘤细胞是Raji细胞、或SU-DHL4细胞、或Ζ138细胞。在一个实施方案中，以15 μ g/ml至O. I μ g/ml的浓度添加抗体。在另ー个实施方案中，以8μ g/ml至12 μ g/ml的浓度添加抗体。如本文中报告的另ー个方面是包含肿瘤细胞和天然杀伤细胞的三维球状体或聚集体用于测定众多抗体与众多肿瘤细胞的组合的效应器功能的用途。如本文中报告的又ー个方面是用于在体外确定具有效应器功能的抗体的方法，包括下列步骤-混合天然杀伤细胞和肿瘤细胞，-将每200μ I约IO4个细胞添加至多孔板的孔，-离心所述多孔板，并且由此诱导三维球状体或聚集体 的形成，-将抗体添加至所述多孔板的各个孔，-将所述多孔板温育约20小时至约72小时，并-将具有某个死细胞与活细胞比率的抗体测定为具有效应器功能的抗体。在一个实施方案中，所述方法另外包括下列第一歩-提供至少ー种抗体，并-用第一荧光染料标记肿瘤细胞。在另ー个实施方案中，所述方法包括下列步骤-将每种提供的抗体添加至多孔板的各个孔，由此对每个孔添加最多ー种抗体，-用第二荧光染料标记每个温育孔中的死细胞，-通过荧光激活细胞分选分析多孔板的每个孔中的细胞，并-将具有最闻的死细胞与活细胞比率的抗体确定为具有效应器功能的抗体。如本文中报告的测定法和方法用如WO 2005/044859 (通过提及而将其收入本文)中报告的抗CD20抗体例示。此抗体仅为了例示本发明而选定，并且不应解释为限制。本发明的范围在权利要求书中列出。提供以下实施例和图来帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求书中列出。应当理解，可以在不背离本发明的精神的前提下对规程做出修饰。附图
简述图I在没有抗体的情况中对活的和死的Raji细胞和天然杀伤(NK)细胞的FACS分析。象限左下活的NK细胞，左上死的NK细胞，右下活的Raji细胞，右上死的Raji细胞。小图A :仅Raji细胞，小图B :比率I: I的Raji细胞和NK细胞，小图C :1:10的Raji细胞和NK细胞。图2在存在添加的抗⑶20抗体(10 μ g/ml)的情况中对活的和死的Raji细胞和天然杀伤细胞的FACS分析。象限左下活的NK细胞，左上死的NK细胞，右下活的Raji细胞，右上死的Raji细胞。小图A :仅Raji细胞，小图B :比率1:1的Raji细胞和NK细胞，小图C :比率1:10的Raji细胞和NK细胞。图3通过淋巴瘤细胞、NK细胞和抗体应用日程表的变化来优化淋巴瘤/球状体-聚集体共培养。淋巴瘤细胞=Raji细胞。图4在存在NK细胞的情况中活淋巴瘤细胞的百分比，作为抗CD20抗体浓度的函数。小图A :Raji细胞，小图B :SU-DHL4细胞，小图C :Z138细胞。NK细胞与淋巴瘤细胞比率(E:T比率)为3:1。图5在存在抗⑶20抗体浓度的情况中活淋巴瘤细胞的百分比，作为效应物(NK):革巴物(淋巴瘤)比率的函数。小图A :Raji细胞，小图B :SU-DHL4细胞，小图C :Z138细胞。抗CD20 抗体浓度10 μ g/ml。
图6示意性的例示性方法。图7仅Raji细胞和与纯化的NK细胞共培养的Raji细胞的显微图像。实施例I材料和方法细胞系Raji 细胞、SU-DHL4 细胞和 Z138 细胞系分别获自 ATCC (Manassas, VA, USA)、DSMZ (Braunschweig, Germany)和 M. Dyer 教授(University of Leicester, UK)。将 Raji细胞和SU-DHL4细胞在RPMI 1640培养基(PAN Biotech,产品目录编号P04-18500)中并将Z138在补充有10% FCS (Gibco,产品目录编号10500-064)和Pen/Str印(Roche,产品目录编号11 074 440 001)的DMEM培养基(PAN Biotech,产品目录编号P04-02500)中于37° C在湿润的培养箱中培养。使用具有90%或更多细胞存活力的指数生长细胞进行NK 细胞共培养实验。NK细胞的纯化将全血自正常的健康供体抽入真空容器(vaccutainer)管(Becton Dickinson,产品目录编号368484)中。通过Ficoll制备(PAN Biotech,产品目录编号P04-60125)获得PBMC。为了使NK细胞保持未触及(untouched)，使用NK细胞负选择试剂盒(Miltenyi，产品目录编号130-092-657)来纯化NK细胞。简言之，将Ficoll分离的PBMC以IxlO7个细胞/40 μ I在MACS缓冲液(PBS/0. 5% BSA/2mM EDTA)中重悬浮。将10 μ I NK细胞-生物素-抗体混合物添加至细胞,并且于4° C温育10分钟，接着添加30 μ I MACS缓冲液。此后，将20 μ I NK细胞-微珠混合物添加至细胞，并于4° C温育15分钟。添加2mlMACS缓冲液，并且将细胞以300g离心10分钟。将团粒在500 μ I MACS缓冲液中重悬浮，并加载至之前用500 μ I MACS缓冲液平衡的分离柱上。随后，用500 μ I MACS缓冲液将该柱清洗三次，并使用CASY细胞计数器(Scharfe System)在总洗脱液中測定细胞数目。通过对MACS洗脱液的等分试样染色来測定NK细胞制备物的纯度。简言之，将约2xl05个细胞在100μ I RPMI 1640/10% FCS中重悬浮，并用10 μ I每种抗CD56-PE和抗CD3-FITC抗体(Becton Dickinson，分别为产品目录编号555516和555339)于4。C染色15分钟。此后，将2ml RPMI 1640/10% FCS添加至细胞，将所述细胞以400g离心5分钟。将团粒在 0.5ml RPMI 1640/10% FCS 中重悬浮，并使用 FACS Scan 或 FACS Canto II 仪(BectonDickinson)来分析淋巴细胞散射门内的⑶56阳性但⑶3阴性细胞级分的百分比。单核细胞的纯化将全血自正常的健康供体抽入真空容器(vaccutainer)管(Becton Dickinson,产品目录编号368484)中。通过Ficoll制备(PAN Biotech,产品目录编号P04-60125)获得PBMC。为了使单核细胞保持未触及，使用负选择单核细胞富集试剂盒(Stem CellTechnologies,产品目录编号19059)来纯化单核细胞。淋巴瘤细胞的CMFDA染色将CMFDA冻干物(Invitrogen，产品目录编号C7025)在DMSO中重悬浮以获得IOmM储备溶液。将IxlO6个淋巴瘤细胞于37° C在Iml补充有I μ MCMFDA的完全培养基中温育30分钟。此后，使细胞成团粒，在完全培养基中清洗一次，并最终在完全培养基中以IxlO6个细胞/ml重悬浮。
实施例2自淋巴瘤细胞系生成3D球状体/聚集体使用CASY仪(Scharfe-Systems, Reut I ingen)来测定淋巴瘤细胞数目，并将细胞悬浮液在冰冷的培养基中稀释至2. 5x IO4个细胞/ml(每个球状体/聚集体5，000个细胞)和5x IO4个细胞/ml(每个球状体/聚集体10，000个细胞)。将体积200 μ I的细胞悬浮液添加至具有圆(Corning Inc. , New York, USA)或圆维(Nunc, Roskilde, The Netherlands)底的96孔板的每个孔。为了防止细胞附着，将板用50μ I在95%こ醇(ν/ν)中的O. 5%聚HEMA (Polysciences, Eppelheim, Germany)预包被，并于37。C风干3天。通过使用具有摇摆斗(swinging bucket)的 Eppendorf 5810 离心机(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)以1，OOOg将板离心10分钟来启动球状体形成。将板在标准细胞培养条件下于37° C和7%CO2在湿润的培养箱中温育。实施例3 自实体瘤细胞系生成3D球状体/聚集体用Accutase (PAA Laboratories GmbH, Innsbruck, Austria)解离单层细胞以生成单细胞悬浮液。使用CASY仪(Scharfe-Systems,Reutlingen)来测定细胞数目，并将细胞悬浮液在冰冷的培养基中稀释至2. 5x IO4个细胞/ml(每个球状体/聚集体5，000个细胞)和5x IO4个细胞/ml(每个球状体/聚集体10，000个细胞)。将rBM在冰上融化过夜，并且以终浓度2. 5%(v/v)用冰冷的移液器尖头添加至细胞悬浮液。将体积200 μ I的细胞悬浮液添加至具有圆(Corning Inc. , New York, USA)或圆维(Nunc, Roskilde, The Netherlands)底的96孔板的每个孔。为了防止细胞附着，将板用50μ I在95%こ醇(ν/ν)中的0. 5%聚HEMA (Polysciences, Eppelheim, Germany)预包被，并于37。C风干3天。通过使用具有摇摆斗的 Eppendorf 5810 离心机(Eppendorf AG, Hamburg, Germany)以 1，OOOg 将板离心 10分钟来启动球状体形成。将板在标准细胞培养条件下于37° C和7% CO2在湿润的培养箱中温育。实施例4球状体/聚集体淋巴瘤/NK共培养和与抗体一起温育可以改变细胞共培养和抗体添加的顺序。在ー个例示性的共培养实验中，在6孔板中以指示的比率混合淋巴瘤细胞(经CMFDA标记的)和NK细胞。例如，E:T (NK细胞与淋巴瘤细胞)比率3:1对应于3+1 (例如，75% NK细胞和25%淋巴瘤细胞)的细胞混合物。将200 μ I细胞悬浮液添加至经聚HEMA包被的96孔V板(Nunc，产品目录编号249662)的单个孔。聚HEMA包被每孔50 μ I在95%こ醇中的0. 5%聚HEMA ;于37° C干燥72小时(Polysciences,产品目录编号18894)。将板以1，OOOg离心10分钟。此后，将抗体以如上文指示的浓度添加，并将细胞聚集体/球状体于37° C，7% CO2在湿润的培养箱中温育。图7中显示了仅Raji细胞和与纯化的NK细胞共培养的Raji细胞的显微图像，以及共培养的Raji和单核细胞细胞的图像，以例示肿瘤细胞与NK细胞以外的免疫细胞的3D共培养。实施例5活细胞和细胞死亡分析使用10，000个细胞来生成球状体/聚集体，并将其与抗体一起温育,如实施例2和3中概述的。活的淋巴瘤肿瘤细胞的鉴定如下将来自代表相同实验条件的各个孔的各个聚集体合并，通过移液来解离，并以300g离心10分钟。将各个球状体合并，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗一次，在Accutase溶液中重悬浮，并于37° C温育。每5分钟，通过移液来重悬浮球状体/聚集体，并在5至15分钟内完成解离。将细胞使用完全培养基清洗，离心，并将细胞团粒在完全培养基中重悬浮，并以I μ g/ml的浓度添加碘化丙啶(Sigma，产品目录编号P4170)。通过FACS分析(Becton Dickinson, Canto II仪)实施突光分析。鉴定活的淋巴瘤细胞，如图Ib中显示的。PI和CMFDA阳性细胞的右上象限代表死的淋巴瘤细胞，而PI阴性但CMFDA阳性细胞的右下象限代表活的淋巴瘤肿瘤靶细胞级分。在左下象限中是活的NK细胞，而死的NK细胞位于左上象限中。在一个备选的设置中，可以实施凋亡测定法。使用10，000个细胞来生成球状体/聚集体，并将其与抗体一起温育，如实施例2和3中概述的。对于凋亡分析,将球状体/聚集体转移至96孔圆锥底板中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗一次，在Accutase溶液中重悬浮，并于37° C温育。每5分钟，通过移液来重悬浮球状体/聚集体，并在5至15分钟内完成解离。将来自8个球状体/聚集体的单细胞悬浮液合井，并在存在补充的2mMCaCl2的情况中用膜联蛋白-V-fluos和碘化丙唳(膜联蛋白-V-fluos染色试剂盒，Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)对细胞染色。使用流式细胞仪(FACS扫描仪，BectonDickinson, San Jose, CA, USA)获得10，000个细胞的荧光。对点图应用象限统计学，其中活细胞的数目位于左下象限中。为了获得死的和活的细胞的绝对数，使用Fuchs-Rosenthal细胞计数室对来自球状体/聚集体的总细胞数目计数，并乘以相同球状体/聚集体中活的或死的细胞的百分比，如自膜联蛋白-V-fluos/PI染色測定的。
权利要求
1.一种用于在体外检测抗体的效应器功能的方法，包括将包含肿瘤细胞和天然杀伤细胞的三维球状体或聚集体与所述抗体一起温育。
2.依照权利要求I的方法，包括下列步骤 a)混合天然杀伤细胞和肿瘤细胞， b)将每200μ I约IO4个细胞添加至多孔板的孔， c)离心所述多孔板，并且由此诱导三维球状体或聚集体的形成， d)将抗体添加至所述多孔板的孔， e)将所述多孔板温育约20小时至约72小时， f)通过荧光激活细胞分选来分析所述多孔板的孔中的细胞，并且由此检测所述抗体的效应器功能。
3.依照权利要求2的方法，其特征在于所述天然杀伤细胞是人天然杀伤细胞。
4.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于以10:1至1:10的比率混合所述天然杀伤细胞和肿瘤细胞。
5.依照权利要求4的方法，其特征在于所述比率是1:2至1:4。
6.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述温育持续约20小时至约28小时。
7.依照权利要求2至6中任一项的方法,其特征在于所述离心以1，OOOrpm持续10分钟。
8.依照前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述肿瘤细胞是淋巴瘤细胞。
9.依照权利要求8的方法，其特征在于所述淋巴瘤细胞是Raji细胞、或SU-DHL4细胞、或Z138细胞。
10.依照权利要求2至9中任一项的方法,其特征在于以15μ g/ml至O. I μ g/ml的浓度添加所述抗体。
11.依照权利要求10的方法,其特征在于以8μ g/ml至12 μ g/ml的浓度添加所述抗体。
12.包含肿瘤细胞和天然杀伤细胞的三维球状体或聚集体用于测定众多抗体与众多肿瘤细胞的组合的效应器功能的用途。
13.一种用于在体外确定具有效应器功能的抗体的方法，包括 a)混合天然杀伤细胞和肿瘤细胞， b)将每200μ I约IO4个细胞添加至多孔板的孔， c)离心所述多孔板，并且由此诱导三维球状体或聚集体的形成， d)将每种提供的抗体添加至所述多孔板的各个孔， e)将所述多孔板温育约20小时至约72小时，并 f)将具有超过I的死细胞与活细胞比率的抗体确定为具有效应器功能的抗体。
14.一种试剂盒，其包含 a)用荧光染料标记的肿瘤细胞， b)分离的天然杀伤细胞， c)96孔多孔板，和 d)碘化丙啶。
全文摘要
本文中报告了基于三维球状体/聚集体共培养测定法的细胞分析技术，其中所述球状体或聚集体是由肿瘤和天然杀伤细胞形成的。此方法可用于单一和高通量形式的对抗体的体外功能分析。
文档编号G01N33/50GK102741695SQ201180008240
公开日2012年10月17日 申请日期2011年2月4日 优先权日2010年2月11日
发明者A.查兰德, C.克莱因, M.库比斯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司