专利名称：MDRPA中merA基因的检测引物及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)中耐消毒剂merA基因携带情况的检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
消毒防腐剂在生活中的应用和发展已有几个世纪。从经验性地用铜和银打造的容器来储存饮用水，用醋和蜂蜜清洗伤口，用香料保存鱼和肉，到用碘酒作为伤口消毒剂，在产科中应用含氯水溶液，将苯酚作为伤口敷料以及在外科中作为抗菌剂，和将二价汞离子用作杀芽孢剂，整个消毒防腐剂都处在不断的发展之中。20世纪初人类又进一步开发了双胍类(CRAs)和季胺类消毒剂(quateraryammon ium compounds，QACs)。到了 20 世纪 40 年代，常用的消毒防腐剂已有酚类化合物、有机汞、双胍类消毒剂、季胺类消毒剂、碘及其复合物、乙醇、甲醛、过氧化氢、银化合物、染料(如吖啶、三苯甲烷)和两性表面活性剂。直到目前，这些消毒剂中的大多数仍在广泛地使用。尽管消毒防腐剂一直在更新换代之中，但是在其广泛的选择压力下，细菌仍然渐渐产生了耐药性。现已发现，细菌对季胺类、双胍类以及重金属等消毒防腐剂的耐药与细菌本身的耐药基因有关。merA基因编码二价汞离子还原酶，携带该基因的细菌专一性地对汞离子耐药。该基因广泛分布于革兰阳性和阴性细菌体内，可以在革兰阳性和阴性菌体之间相互转导，并且经常与抗生素耐药基因连锁于同一质粒如PSN 2M上。Timg等将从健康儿童口腔中分离得到的革兰阴性细菌用100-200mmol的汞离子溶液反复诱导，然后通过DNA-DNA杂交和PCR 技术检测merA基因的存在，结果表明，在8个革兰阴性菌菌属中检测到merA基因，它们分别是柠檬酸杆菌属、奈瑟菌属、不动杆菌属、埃希杆菌属、肠道细菌属、克雷伯菌属、假单胞菌属和粘质沙雷菌。经过对不动杆菌和大肠埃希菌中分离到的IOOObp基因进行测序，发现它们与金葡菌的merA基因的同源性高达95% -96% ；与枯草芽胞杆菌的merA基因的同源性也高达89% -97% ο目前检测merA基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。
发明内容
本发明的目的是提供多药耐药铜绿假单胞菌(MDRPA)中耐消毒剂merA基因携带情况的PCR检测引物及其检测方法。为了达到上述目的，本发明提供了一组MDRPA中merA基因的检测引物，其特征在于，包括(八).11^八基因正向弓|物5，-0区8区088(；(^88081彻(；-3，；(B) .merA 基因反向弓 I物5，_acttgcggatcggtgaac_3，。本发明还提供了一种MDRPA中merA基因的检测方法，其特征在于，采用上述MDRPA中merA基因的检测引物，具体步骤为第一步取经培养后鉴定为MDRPA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本 DNA,作为检测样品；取不携带merA基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成merA序列，构建携带merA基因的重组质粒为阳性对照品；第二步用无菌水配制浓度为5-15umol/L的merA基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的merA基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的merA基因检测探针溶液；merA基因正向引物的序列为5，-cgagcaacccgaacatctac-3，，merA基因反向引物的序列为5’ -acttgcggatcggtgaac-3’，merA基因检测探针的序列为 FAM-accggcggcgatg-MGBNFQ ；第三步在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的merA基因正向引物溶液0. l_lul、merA基因反向引物溶液0. I-Iul、merA基因检测探针溶液0. Ι-lul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品0. Ι-lul，用灭菌重蒸馏水补足25ul ；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60°C保温1-3分钟，80-10(TC保温1_3分钟，再运行30-50个循环，每个循环包括在 80-100°C保温 10-20 秒，再在 50-70°C保温 0. 5-1. 5 分钟；第四步用软件SDS2. 2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带merA基因。本发明是对多药耐药铜绿假单胞菌中是否还有耐消毒剂merA基因的检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解细菌中merA基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。本发明基于实时荧光定量PCR技术，应用具有分辨率更高、杂交特异性更强、重现性好等特点的Taqman-MGB探针，不仅检测率高、可重复性强，检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品， 使结果判读更直观。
图1为携带merA基因的阳性对照品的Realtime PCR曲线图；图2为Realtime PCR阴性对照品的Realtime PCR曲线图；图3为携带merA基因检测样品的Realtime PCR曲线图；图4为merA基因检测样品的琼脂糖凝胶电泳图；图5为merA基因检测样品的测序图。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例1、采用固相亚磷酰胺三酯法制备一组用于检测MDRPA中merA基因携带情况的引物，包括merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3‘；merA 基因反向弓I物5，-acttgcggatcggtgaac-3'
2、检测方法(1)取经培养后鉴定为多药耐药铜绿假单胞菌阳性的临床样本分离株，高温灭活， 用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP030(^)提取样本DNA，稀释至30ul (浓度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；将标准铜绿假单胞菌株(保藏单位中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ATCC Number :27853)，高温灭活， 用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP030(^)提取样本DNA，稀释至30ul (浓度lOng/ul)，作为阴性对照品；人工合成merA序列(由上海生工合成)，构建携带merA基因的重组质粒，稀释至30ul (浓度lOng/ul)，为阳性对照品。(2)根据merA基因的保守区域，采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR 引物设计软件，设计合成引物及Taqman探针，探针序列一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料(由上海生工合成)，用无菌水配制浓度为lOumol/L的merA基因正向引物溶液，浓度为lOumol/L的merA基因反向引物溶液以及浓度为lOumol/L的merA基因检测探针溶液，其中，引物和检测探针序列如下merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3，；merA 基因反向弓I物5，_acttgcggatcggtgaac_3，；merA 基因检测探针FAM_accggcggcgatg-MGBNFQ。(3)在每一个 PCR 反应孔中加入 PCR Master Mix (Applied Biosystems 公司生产的 iTaqman Universal PCR Master Mix 2X，包括 10XPCR 缓冲液、MgC12、dNTP、DNA 聚合酶)12. 5ul，merA基因正向引物溶液0. 5ul，merA基因反向引物溶液0. 5ul，merA基因检测探针溶液0. 5ul。然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤(1)得到的检测样品、阴性对照品或阳性对照品0. 5ul，最后用灭菌重蒸馏水补足25ul。在ABI7300型荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为50°C保温2分钟，95°C保温2分钟，再运行40个循环，每个循环包括在95°C保温15秒，再在60°C保温1分钟。(4)用软件SDS2. 2进行结果分析，如图1所示，为阳性对照品的Realtime PCR曲线，呈S形。如图2所示，为阴性对照品的Realtime PCR曲线，为非S形。如图3所示，为检测样品的Realtime PCR曲线，呈S形。得出判断，该样品为携带merA基因菌株。利用本发明对超过100例MDRPA样本的检测结果显示，根据上述方法进行的merA 基因携带情况检出率可达99%以上，可重复性达到100%。而琼脂糖凝胶电泳法的检出率约80%，如图4所示，为merA基因检测样品的琼脂糖凝胶电泳图；本发明与直接测序法相比，结果一致性可达到99. 5%以上，如图5所示，为merA基因检测样品的测序图。
权利要求
1.MDRPA中merA基因的检测引物，其特征在于，包括(A)· merA 基因正向弓I物5，-cgagcaacccgaacatctac-3，；(B).merA 基因反向弓I物5，-acttgcggatcggtgaac-3，。
2.—种MDRPA中merA基因的检测方法，其特征在于，采用权利要求1所述的MDRPA中 merA基因的检测引物，具体步骤为第一步取经培养后鉴定为MDRPA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带merA基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成merA序列，构建携带merA基因的重组质粒为阳性对照品；第二步用无菌水配制浓度为5-15umol/L的merA基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的merA基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的merA基因检测探针溶液；merA基因正向引物的序列为5，-cgagcaacccgaacatctac-3', merA基因反向引物的序列为5’ -acttgcggatcggtgaac-3’，merA基因检测探针的序列为 FAM-accggcggcgatg-MGBNFQ ；第三步在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的 merA基因正向引物溶液0. l_lul、merA基因反向引物溶液0. I-Iul、merA基因检测探针溶液0. Ι-lul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品0. Ι-lul，用灭菌重蒸馏水补足25ul ；在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60°C保温1-3分钟，80-10(TC保温1_3分钟，再运行30-50个循环，每个循环包括在 80-100°C保温 10-20 秒，再在 50-70°C保温 0. 5-1. 5 分钟；第四步用软件SDS2. 2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带merA基因。
全文摘要
本发明公开了一组MDRPA中merA基因的检测引物及使用该引物的检测方法。所述的MDRPA中merA基因的检测引物其特征在于，包括merA基因正向引物5’-cgagcaacccgaacatctac-3’；merA基因反向引物5’-acttgcggatcggtgaac-3’。检测方法为取经培养后鉴定为MDRPA阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带merA基因的铜绿假单胞菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成merA序列，构建携带merA基因的重组质粒为阳性对照品；分别进行PCR反应。本发明检测率高、可重复性强。
文档编号C12R1/385GK102534028SQ201210032899
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者傅咏南, 张奕, 王校 申请人:上海中优医药高科技有限公司