一种基因身份证芯片的研发和制作方法

一种基因身份证芯片的研发和制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于对人个体SNP位点进行检测的基因芯片。本发明提供了一种基因芯片，其特征在于把能鉴定人个体的SNP，结合科学上已证实了的与疾病，特别是与儿童发育，如身高、体重、是否易发哮喘等健康、智育相关的科学资料，并将其融入生物鉴定芯片之中，最终使得这款生物芯片不仅是包含个人遗传学特征的“身份证”，而且可依据测得的遗传信息，有的放矢的使儿童健康成长。本发明还涉及更多的遗传信息，如加入遗传疾病诊疗基因、流行疾病易感基因、药物耐受性、敏感性关联基因等与人类健康息息相关基因的SNP信息。
【专利说明】一种基因身份证芯片的研发和制作

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物芯片技术和体外临床诊断检测【技术领域】，具体而言，本发明涉及 一种用于对人个体SNP位点进行检测的基因芯片。

【背景技术】
[0002] 人类遗传性状是指由遗传基因（DNA)决定的形态特征和生理特性，人与人之间除 同卵双胞胎外，遗传性状有很多不同。选择某些性状进行观察，可以认识自己的遗传特性有 哪些特点，与别人有什么异同，也可以了解自己和父母之间在性状遗传上的关系。遗传标记 指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的一种遗传特性。遗传标记有 两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作 为遗传标记。
[0003] DNA作为遗传物质的载体，是研究生物遗传特性的基本耙点。20世纪80年代以 来，随着分子生物学技术和分子遗传学的迅速发展，分子克隆及DNA重组技术的日趋完善， 研究者对基因结构和功能研究的进一步深入，在分子水平上寻找DNA的多态性，以此为标 记进行各种遗传分析。DNA分子标记直接反映 DNA水平上的遗传变异，信息量大，可靠性高， 因此，自产生以来已得到广泛应用。
[0004] 1985年，DNA重组技术的发展，孕育了第一代以DNA多态性为标记的人类遗 传特征鉴定系统，即DNA的限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)检测方法。采用人类小卫星DNA核心序列作为探针，在低强度杂交条 件下，同时与多个可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR)基 因座形成杂交产物。杂交形成的RFLP图谱由十数条不同的片段长度组成，形似商品上标记 的条码，故称为DNA指纹技术。图谱具有高度个体特异性，不同个体间片段数不同、片段长 度不同，无关个体间的平均匹配概率达到ΚΓ 12?ΚΓ19。DNA-RFLP检测使法医学第一次能够 认定同一性，因此小卫星DNA-RFLP分析被誉为DNA指纹。DNA指纹技术克服了血型标记检 测的局限性，在案件调查中发挥了重要作用。多年的实践应用发现，DNA-RFLP检测方法烦 琐，检测时间长，检测灵敏度低，有关结论解释的理论基础还不完善，在实际案件材料的检 测应用时受到限制。
[0005] 第二代DNA遗传标记是应用PCR技术扩增人类基因组中VNTR序列，这也是世界各 国已应有多年的技术。在卫星DNA中，VNTR大约占一半，具有串联重复的特征性序列，以相 对恒定的序列片段作为重复单位，在某个基因座串联重复。不同个体、不同等位基因间表现 为重复的次数不同，构成复杂的片段长度多态性。目前，法医DNA分型检测常规采用微卫星 DNA-VNTR序列遗传标记，这类卫星序列的重复单位长2?6bp，重复次数由数次到数十次， 等位基因片段长度均在400bp以下，故称短串联重复序列（short tandem repeat, STR)。 PCR-STR分型具有高灵敏度、高多态性的优势，荧光标记PCR-STR分型已成为法医物证鉴定 的标准技术。此技术需做大量PCR，通量低，成本高，且数据用途单一。
[0006] 第二代分型技术，法医物证学应用选择的STR基因座，等位基因数一般在10-20 个，杂合度0. 7左右，多态性程度较低，一般复合扩增13-16个基因座才能达到鉴定要求。对 一个新的STR遗传标记需进行一系列指标评估，具体包括十多个方面，过程繁冗且筛选效 率低。STR分型技术至今虽发展成熟，优点较多，但许多缺点也随着分子生物学技术的全面 革新而日渐暴露出来，表现为：
[0007] (1) STR座位片段长度等位基因的鉴别需要高分辨的电泳技术，区别几 bp长度差 异的基因，技术要求较高，花费大；
[0008] (2) -次处理的样品量有限（一般〈100个样品需要5天，>100个样品需要10天）， 实验过程难以完全实现自动化，实验周期较长，单个样品处理费用较高；
[0009] (3)同时被检测的STR位点有限，即单次检测的信息量较少，单次成本高；
[0010] (4)依赖于PCR扩增、测序技术，增加了分型结果的误差；
[0011] (5)位点特异性引物扩增的片段长度介于100_450bp，不适用于检测已降解的生 物样品；
[0012] (6) STR位点的信息不易数字化，难以借助于新型的智能化软件加以统筹分析；
[0013] (7)开发一个新的位点要求多、标准高、时间长、效率低，因此不易扩展更新整体的 信息量。


【发明内容】

[0014] 随着基因组技术的飞速发展，第三代遗传标记，单核苷酸多态性（SNP)已经在医 学，农学科研和实践中有了广泛的应用。在人的身份鉴定方面，过去三十年里，经过第一代 DNA人身份鉴定方法RFLP和第二代STR，我们已经进入可利用第三代遗传标记SNP的时代。
[0015] 第三代DNA遗传标记是应用单核苷酸多态性（SNP)。SNP是指基因组内某特定的 核苷酸位置上在不同个体上存在有2种不同的碱基成分。从生物遗传和变异的本质分析， SNP将是一种最能反映群体遗传结构和个体间遗传差异的标记系统。理论上，一个核苷酸位 置可以有4种碱基变异形式，但实际上SNP多表现为双等位基因，即二态性遗传变异。SNP 的多态性程度虽不如小卫星或微卫星，但是SNP数量巨大，基因组中分布频密。人类基因组 中每< lkb就有一个SNP位点，总计多于400万个，大约包含了人类基因组中已知多态性的 80%，是最常见的遗传变异形式，所以，从整体而言，SNP的多态性实际上要比其它DNA多态 性大得多。由于SNP位点均为二等位基因，在SNP检测时能通过简单的方式进行表 型分析，无须测定基因片段的长度，检测结果易于自动化。专家们认为，SNP将成为DNA个 体鉴定应用的第三代遗传标记系统。由于SNP还会改变蛋白质的表达量和功能活性，所以， 它的变异还可推测蛋白质的活性，由此推断遗传疾病，遗传性状，对药物代谢的速度等等。
[0016] 本发明提供了一种基因芯片，其特征在于把能鉴定人个体的SNP，结合科学上已证 实了的与疾病，特别是与儿童发育，如身高、体重、是否易发哮喘等健康、智育相关的科学资 料，并将其融入生物鉴定芯片之中，最终使得这款生物芯片不仅是包含个人遗传学特征的 "身份证"，而且可依据测得的遗传信息，有的放矢的使儿童健康成长。
[0017] 本发明还涉及更多的遗传信息，如加入遗传疾病诊疗基因、流行疾病易感基因、药 物耐受性、敏感性关联基因等与人类健康息息相关基因的SNP信息。
[0018] 疾病相关基因和SNP的定位标志着基因组学研究中的一场新革命的开始。本发明 在整合了序列数据、基因分型数据、分时基因表达数据、家谱及种群数据、历史及档案数据 和临床数据等各方面数据之后，利用这些数据进行疾病的危险评估、对有效的筛选过程进 行指导，并且为疾病预防策略、早期诊断、安全和有效的治疗、更好的前期诊断开辟另一条 道路。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1是与中国人群部分重要遗传学特征关联的SNP位点
[0020] 图2是整体技术路线

【具体实施方式】
[0021] (1)整体试验目标分为三部分：
[0022] 本发明通过以下技术方案实现：
[0023] 筛选SNP位点、设计芯片（引物）和样本实验。各部分紧紧相扣，互相制约，重复 检验直至筛选出符合要求的SNP位点。
[0024] 我们将从HapMap网站上下载完整的人类基因组SNP位点的信息（超过四百万 个），再从先后上传的各部分数据中将次要等位基因频率（minor allele frequency, MAF) 介于0· 46?0· 50之间，且与部分重要遗传学特征（如下表）关联的SNP位点（约1400个） 筛选出来，并列出对应的染色体分布和rs ID (reference SNP ID)。
[0025] 将约1000个rs ID由研发技术员运用专业软件设计相应的符合GoldenGate实 验要求的引物，制备出个性化的高密度新型基因芯片，我们通过大量样本测试这些SNP位 点，筛选出杂合度> 0.4, Fst彡0.06,符合哈迪-温伯格平衡，且侧翼序列的GC碱基百分 含量介于0.45?0.55%的位点（数百个）。最后，检测约2000个DNA样本（包括一部分 没有亲缘关系的个体，另一部分为家系样本），由生物信息员分析数据，计算出个体识别率 (Probability of discrimination Power，DP)和非父排除率（Excluding Probability of Paternity，PE)。累计非父排除率达0.9995是目前国际上通行的统计学衡量指标，个体识 别率一般为ΚΓ 9?1〇?，达到这两个标准的SNP位点估计为2000?3000个，最终的筛选结 果将实现使用符合标准的最少SNP位点，设计出一款专用于中国人群遗传学特征鉴定的低 密度高通量基因分型芯片，这正是本项目最大的创新性所在。
[0026] (2)基因分型试验的具体流程：
[0027] 第一步：使用专业试剂盒提取肌肉、血液、口腔上皮细胞等组织样品中的DNA，并 通过琼脂糖凝胶电泳及成像系统进行质量检测，最后使用紫外分光光度计进行浓度定量， 达到基因分型试验的要求；
[0028] 第二步：按照VeraCode GoldenGate分型试验的标准操作流程（S0P)完成实验：
[0029] 实验前准备工作：
[0030] 1、检测DNA样品：
[0031] (1)制备1 %的琼脂糖凝胶，使用0. 5 X TAE缓冲液电泳检测；
[0032] (2)使用紫外分光光度计测量DNA样品浓度，用TE缓冲液将浓度调至50ng/ul ;
[0033] 2、检查
[0034] 1、制备 SUD (single-use DNA)平板
[0035] 目的：激活样品DNA，使其标记上生物素
[0036] 试剂：TE(10mM Tris-HCl pH8. 0、lmM EDTA、室温保存）
[0037] MSlreagent (_2(TC 保存）
[0038] DNA samples and controls (-20°C保存）
[0039] 0· 2ml96 孔平板
[0040] 准备：将 heatblock 预热至 95°C ;
[0041] 提前预热 heat sealerl5min ;
[0042] 将DNA样品，MSI置于室温化冻，并振荡混匀；
[0043] 步骤：
[0044] (1)用TE缓冲液将DNA的浓度稀释至50ng/ul ;
[0045] (2)向平板每个孔中加入5μ 1 MSI ;
[0046] (3)分别加入 DNA 样品 5 μ 1 (250ng);
[0047] (4)用铝制热封膜将平板封口（亮面向上，热封3秒）；
[0048] (5) 250 X g 瞬时离心 30 秒；
[0049] (6) 23〇Orpm 涡旋 2〇 秒；
[0050] (7) 250 X g 瞬时离心 30 秒；
[0051] (8)将SUD平板放入heat block中95°C温育30分钟；（结束后温度调节至70°C )
[0052] (9)250Xg 瞬时离心 30 秒。
[0053] 2、沉淀 SUD (single-use DNA)平板
[0054] 目的：沉淀DNA，并去除未被激活的DNA
[0055] 试剂：PSlreagent (4°C保存）
[0056] 异丙醇（室温保存）
[0057] 步骤：
[0058] ⑴小心撕去平板上的热封膜；
[0059] (2)向平板每个孔中加入5μ 1 PS1 ;
[0060] (3)将平板封口（粘膜）；
[0061] (4) 250 Xg 瞬时离心 30 秒；
[0062] (5) 2300rpm涡旋20秒，直至溶液呈现均匀的蓝色；
[0063] (6)撕去粘膜，向每个孔中分别加入15 μ 1异丙醇，并用干净的粘膜重新封口；
[0064] (7) 1600rpm涡旋20秒，直至溶液呈现均匀的蓝色；
[0065] (8)3000Xg离心20分钟（可见管底有蓝色沉淀，如果取出平板时晃动了，必须重 新离心10分钟）；
[0066] (9)小心撕去封膜，快速倒扣于吸水纸上（轻轻拍打平板，使悬浮液流净，但不要 倾斜平板，以免样品交叉污染）；
[0067] (10) 8 X g瞬时离心1分钟（置于离心机中，手动旋转）；
[0068] (11)将平板正放，置于室温自然干燥15分钟。
[0069] 继续下步，或是_20°C可保存一天。
[0070] 3、重悬浮 SUD (single-use DNA)平板
[0071] 目的：使沉淀后的DNA重新悬浮
[0072] 试剂：RSI reagent (室温保存）
[0073] 步骤：
[0074] (1)向平板每个孔中加入10 μ 1 RSI ;
[0075] (2)将平板封口（粘膜）；
[0076] (3) 250 X g 瞬时离心 30 秒；
[0077] (4) 2300rpm涡旋1分钟，直至溶液呈现均匀的蓝色。
[0078] 继续下步，或是4°C过夜保存，或是_20°C可保存一个月。
[0079] 4、制备 ASE (Allele Specific Extension)平板
[0080] 目的：使连接了生物素的DNA，在杂交试剂中与三条寡核苷酸探针、磁珠结合，进 行延伸、连接反应。
[0081] 试剂：0Blreagent (_2(TC保存）
[0082] OPA reagent (-20 °C 保存）
[0083] 0· 2ml96 孔平板
[0084] 准备：将 heatblock 预热至 70°C ;
[0085] 提前预热 heat sealerl5min ;
[0086] 将0B1 (磁珠），0ΡΑ置于室温化冻，并振荡混匀；
[0087]步骤：
[0088] (1) SUD平板250 X g瞬时离心30秒；
[0089] (2)向ASE平板每个孔中加入10 μ 1 0ΡΑ ;
[0090] (3)向ASE平板每个孔中加入30 μ 1 0Β1 ;
[0091] ⑷小心撕去SUD平板上的封膜；
[0092] (5)将SUD平板中的每个样品分别转移10 μ 1至ASE平板中的对应位置；
[0093] (6)将ASE平板封口（热封膜）；
[0094] (7) 250 X g 瞬时离心 30 秒；
[0095] (8) 1600rpm涡旋1分钟，直至溶液呈现均匀的褐色；
[0096] (9)将ASE平板放入heatblock中，并立即将温度由70°C调至30°C，温育2-16小 时。
[0097] 5、添加 MEL (Mix for Extension and ligation)
[0098] 目的：洗掉多余的寡核苷酸探针和非特异性杂交的DNA
[0099] 试剂：AMlreagent (4°C 保存）
[0100] UBlreagent (4°C 保存）
[0101] MEL reagent (_2CrC 保存）
[0102] 准备：将ASE平板从heatBlock中取出；
[0103] 将 heat block 温度调至 45°C ;
[0104] 将MEL置于室温化冻，并振荡摇匀；
[0105] 步骤：
[0106] (1)将ASE平板250 Xg瞬时离心30秒；
[0107] (2)将平板置于磁力架上2分钟，直至磁珠被捕获在管壁上（奇右偶左）；
[0108] (3)小心撕去ASE平板上的热封膜；
[0109] (4)小心吸掉上清液，留下磁珠（无需换枪头，不能吸走磁珠）；
[0110] (5)向ASE平板每个孔中加入50μ 1 AM1 ;
[0111] (6)将ASE平板封口（粘膜）；
[0112] (7) 250 Xg 瞬时离心 30 秒；
[0113] (8) 1600rpm涡旋20秒，使磁珠完全悬浮起来；
[0114] (9)将ASE平板置于磁力架上2分钟，直至磁珠被捕获在管壁上，撕去封口膜，吸掉 上清液，留下磁珠（无需换枪头，不能吸走磁珠）；
[0115] (10)重复步骤（5)-(9) -次；
[0116] (11)移去磁力架，向ASE平板每个孔中加入50μ 1 UB1 ;
[0117] (12)重新将ASE平板置于磁力架上2分钟，直至磁珠被捕获在管壁上，撕去封口 膜，吸掉上清液，留下磁珠（无需换枪头，不能吸走磁珠）；
[0118] (13)重复步骤（11)-(12) -次；
[0119] (14)向ASE平板每个孔中加入37μ 1 MEL ;
[0120] (15)将ASE平板封口（粘膜）；
[0121] (16) 1600-1700rpm涡旋1分钟，使磁珠完全悬浮起来；
[0122] (17)将ASE平板放入heat block中，45°C温育15分钟。
[0123] 6、制备 PCR(Polymerase Chain Replication)平板
[0124] 目的：为PCR扩增反应做准备
[0125] 试剂：MMP reagent (_2〇°C 保存）
[0126] Titanium Taq DNA Polymerase (-2CTC保存）
[0127] 96 孔 PCR 平板
[0128] 准备：将MMP置于室温化冻，并振荡摇匀
[0129] 步骤：
[0130] (1)向 MMP 管中加入 64 μ 1 Titanium Taq DNA Polymerase，盖紧并颠倒数次混 匀；
[0131] (2)向PCR平板每个孔中加入上述混合试剂30 μ 1 ;
[0132] (3)将PCR平板封口（粘膜）；
[0133] (4) 250 X g瞬时离心30秒后置于避光处。
[0134] 7、温育 PCR (Polymerase Chain Replication)平板
[0135] 目的：加入与探针对应的三条被标记的通用引物
[0136] 试剂：UBlreagent (4°C保存）
[0137] IPlreagent (-2CTC保存）
[0138] 准备：将ASE平板从heatBlock中取出；
[0139] 将 heat block 温度调至 95°C ;
[0140] 将IP1置于室温化冻，并振荡摇匀；
[0141] 步骤：
[0142] (1)将ASE平板置于磁力架上2分钟，直至磁珠被捕获在管壁上，撕去封口膜，吸掉 上清液，留下磁珠（无需换枪头，不能吸走磁珠）；
[0143] (2)向ASE平板每个孔中加入50 μ 1 UB1 ;
[0144] (3)将ASE平板置于磁力架上2分钟，直至磁珠被捕获在管壁上，吸掉上清液，留下 磁珠（无需换枪头，不能吸走磁珠）；
[0145] (4)移去磁力架，向ASE平板每个孔中加入35 μ 1 IP1 ;
[0146] (5)将ASE平板封口（粘膜）；
[0147] (6) 1800rpm涡旋1分钟，使磁珠完全悬浮起来；
[0148] (7)将ASE平板放入heatblock中，95°C温育1分钟；
[0149] (8)取出ASE平板，置于磁力架上2分钟，直至磁珠被捕获在管壁上，分别吸取 30 μ 1上清液至PCR平板上对应的孔中（换枪头）；
[0150] (9)将PCR平板封口（PCR平板专用封口膜）。
[0151] 8、热循环 PCR (Polymerase Chain Replication)平板
[0152] 目的：扩增被标记的DNA模板，使荧光信号加强
[0153] 步骤：
[0154] 将封口的平板放入PCR仪中，按照下列程序进行扩增：
[0155] 37 °C lOmin ；
[0156] 95 °C 3min ；
[0157] 30 X 95 °C 35S ； 56 °C 35S ； 72 °C 2min ；
[0158] 72°C lOmin ；
[0159] 4°C 5min ；
[0160] PCR程序结束后，继续洗脱，或是_20°C保存。
[0161] 9、结合 PCR (Polymerase Chain Replication)产物
[0162] 目的：使PCR产物结合在滤膜上
[0163] 试剂：MPB reagent (4°C保存，使用之前充分涡旋）
[0164] 0. 45 μ Μ带盖苯乙烯过滤平板
[0165] 步骤：
[0166] (1)将PCR平板250 Xg瞬时离心30秒；
[0167] (2)向PCR平板每个孔中加入20μ1 MPB(事先振荡混匀，无需换枪头）；
[0168] (3)将移液器调至85μ 1，将混合物上下打匀后，移至过滤平板上对应的位置（需 换枪头），盖上盖子置于避光处60分钟。
[0169] 10、制备 INT (Intermediate)平板
[0170] 目的：洗脱，纯化PCR产物
[0171] 试剂：MH2reagent (室温保存）
[0172] UB2reagent (室温保存）
[0173] 0· IN NaOH(4°C 保存）
[0174] 96孔V-底平板
[0175] 步骤：
[0176] (1)将过滤平板放在一个用过的96孔V-底平板上（废液板）；
[0177] (2) 1000Xg25°C离心 5 分钟；
[0178] (3)向过滤平板每个孔中加入50 μ 1 UB2,并换新盖子；
[0179] (4) 1000Xg25°C离心 5 分钟；
[0180] (5)向INT平板每个孔中加入30 μ 1 MH2 ;
[0181] (6)用INT平板替换废液板，将过滤平板放上，两者位置对应；
[0182] (7)向过滤平板每个孔中加入30 μ 10. IN NaOH，并换新盖子；
[0183] (8) 1000 Xg25°C离心5分钟，这时在INT平板中看不到磁珠了，轻轻晃动摇匀；
[0184] 继续下步杂交试验，或是将INT平板封口，_20°C保存。
[0185] 11、杂交 VBP (VeraCode Bead Plate)
[0186] 目的：使纯化后的PCR产物与VeraCode Beads杂交
[0187] 试剂：MH2reagent (室温保存）
[0188] 0· IN NaOH(4°C 保存）
[0189] VeraCode Bead Plate
[0190] 准备：将INT平板从_20°C中取出，室温下避光化冻，250 Xg瞬时离心30秒；
[0191] 将 VeraCode Vortex Incubator 预热至 45°C ;
[0192] 步骤：
[0193] (1)向15ml离心管中加入的3ml MH2,再加入3ml NaOH，充分混匀；
[0194] (2)向INT平板每个孔中加入50 μ 1上述混合物，并上下吹打数次，充分混匀；
[0195] (3)转移100 μ 1 ΙΝΤ平板上的样品至VeraCode Bead平板上对应的位置；
[0196] (4)盖紧盖子；
[0197] (5)将 VeraCode Bead 平板放入 VeraCode Vortex Incubator 中，850印1]145。〇温育 3小时。
[0198] 12、洗脱 VBP (VeraCode Bead Plate)
[0199] 目的：洗脱 VeraCode Beads
[0200] 试剂：VW1 reagent (室温保存）
[0201] 步骤：
[0202] (1)取出 VeraCode Bead 平板；
[0203] (2) 250 X g 瞬时离心 30 秒；
[0204] (3)向平板中加入200 μ 1 VW1 ;
[0205] (4)盖紧盖子，轻轻圆周涡旋一下平板；
[0206] (5)静置2分钟，待微珠沉在管底，去除上清液（真空泵）；
[0207] (6)重复步骤（3)-(5) -次。
[0208] 如果不继续下步，请将平板封口，室温下置于避光处可保存一天。
[0209] 13、扫描 VBP (VeraCode Bead Plate)
[0210] 使用 BeadXpress Reader System 扫描平板
[0211] 步骤：
[0212] (1)开机，双击桌面图标；
[0213] (2)右击的左上角部分的 VeraScan 标志，选择 Reader | Initialize System ;
[0214] (3)右键单击左上角的 BeadXpress 标志，选择 Reader I Prime Fluidics ;
[0215] (4)打开托盘，将平板放进去，注意位置要对应好；
[0216] (5)点击Open Tray,托盘收进，点击Next,输入Plate ID，选择Scan Settings,继 续点击Next，开始扫描。
【权利要求】
1. 把能鉴定人个体的SNP融入生物芯片之中。
2. 依据测得的遗传信息，有的放矢的使儿童健康成长。
3. 加入遗传疾病诊疗基因、流行疾病易感基因、药物耐受性、敏感性关联基因等SNP信 息。
【文档编号】C40B40/06GK104152538SQ201310178183
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2013年5月15日 优先权日:2013年5月15日
【发明者】李艾斯 申请人:南京迈达医药科技有限公司