专利名称：一种包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，特别是一种包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi 表达载体。
背景技术：
核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)是指具有特定序列的小RNA双链(short interfering RNA, si RNA)转运到细胞后通过诱导同源信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA)降解，导致特定基因发生转录后基因沉默的现象(Fire et al，Nature 1998391 806)。siRNA是具有两个碱基冗余的3’羟基末端的核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)双链分子，该分子能与沉默复合物结合并对靶基因mRNA进行切割。切割通常发生在siRNA同源部分的中间，离siRNA反义链5’端10个碱基处。siRNA不仅易被环境中广泛存在的RNA酶降解，而且具有稳定性差、抑制作用短暂、不能遗传、成本高等缺点(Emily et al, Methods in Molecular Biology 2008442 :45)。因此，研究者发展了由 RNA聚合酶(RNA polymerase, Pol)在生物体内转录来获得siRNA的方法，该方法通常由短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)产生(Paddison et al,Genes & Development 2002 16 :948)。shRNA 是由一条 RNA 单链经自身折叠而成，包括两个短的反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成类似发夹状结构。shRNA由表达载体转录得到，可以模仿siRNA的双链结构，能够在体内、 体外有效抑制靶基因mRNA的表达，实现RNAi效应。由于shRNA具有可遗传、成本低廉，结构更稳定等一系列优点，因此已成为研究基因功能的重要工具，并在肿瘤基因治疗、遗传病研究等领域发挥重要作用。
目前，shRNA表达载体通常是由RNA聚合酶III (Pol III)启动子调控的，例如 HI、U6启动子。Pol III启动子具有明确的转录起始位点与转录终止位点(TTTTTT)，可以在体内实现高效而稳定的基因沉默。但是Pol III启动子缺乏组织特异性，其调控产生的 RNAi效应也缺乏组织特异性。组织特异性Pol II启动子会调控转录产物在特定组织细胞及器官内的表达。例如，前列腺特异抗原(PSA)启动子可以使转录产物只在前列腺细胞内表达(Zhao et al, Seminars and Original Investigations 200927 :539),载月旨蛋白 A-Kapolipoprotein A-I,apoA-I)启动子具有肝组织特异性(任雪玲等，中国现代医学杂志 200922 :3403)，人端粒酶逆转录酶(Human telomerase reverse transcriptase，hTERT) 启动子在肿瘤细胞内可以调控基因转录，而在非肿瘤细胞内是沉默的(Takeda et al, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 200888 :3531)等等。因此，利用 Pol II启动子实现shRNA的组织特异性转录是解决RNAi效应组织特异性问题的有效策略。
Pol II启动子可以实现转录产物的组织特异性，但其转录调节机制与Pol III启动子明显不同。首先，Pol II启动子没有明确的转录起始位点，而且一旦转录开始，新生成的mRNA会在5’端加上倒转的鸟核苷酸三磷酸，并通过进一步的甲基化作用而产生HI7G帽子结构。其次，Pol II启动子也没有明确的转录终止位点，其转录终止发生在成熟转录产7物的3’端下游几千碱基之后。转录产物通过内切及进一步的多腺苷酸化作用，在3’末端加上数量不等的腺嘌呤，形成多聚腺嘌呤(PolyA)的尾巴。Pol II启动子调控机制中的5’ 端VG帽子结构和3’端poly A尾巴对于转录产物的功能非常重要，不仅是影响转录产物稳定性的主要因素之一，同时也促进转录产物迅速通过核孔进入胞浆。当Pol II启动子调控产生的转录产物是shRNA时，shRNA迅速、不断进入胞浆中将会造成RNAi效应的不确定性，例如脱靶效应。因此，有效去除Pol II启动子调控产生的shRNA结构上的5’端VG帽子和3’端poly A尾巴对于诱导有效及稳定的RNAi效应至关重要。核酶(Ribozyme)是一类具有催化功能的RNA分子，可以通过转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程。在这些具有催化活性的核酶中有一些分子可以自身为底物进行自体催化，将RNA分子中的多余部分切除，我们称这类分子为自剪切核酶。 Shinagawa等研究者将自剪切核酶插入到巨细胞病毒启动子与shRNA序列之间，通过核酶的自我剪切作用切除转录产物5’端的帽子结构(Siinagawa et al,Genes & Development 200317 :1340)。锌指蛋白MAZ结合序列可以有效终止转录，由于序列中缺乏加尾信号，因此不会在转录产物的3，末端形成polyA尾巴(Yonaha et al，The EMBO Journal 200019 3770)。因此，以锌指蛋白MAZ结合序列作为shRNA终止序列，可有效去除shRNA结构中的 PolyA尾巴，从而减缓了转录产物由细胞核进入细胞质的速度，增加RNAi效应的稳定性和效率。在机体内，所有生命过程都是一种复杂的过程，是多因素、多基因、多条件综合作用的结果。基于细胞分子水平研究，细胞内的每一条通路都涉及多个基因，而每一个基因可能存在多个不同的通路中。例如，在药物成瘾的分子机制中涉及原癌基因c-fos、原癌基因 JunB 等多个分子(Angel et al,Biochim Biophys Acta 19911072 :129)；人表皮生长因子受体(Human epidermal growth factor rec印tor,hEGFR)在紫夕卜线福射损伤(Ann et al, Science Signaling)、肿瘤发生发展(Ann et al, Nature Review Cancer 20099 :508)等多个机制中具有关键作用。因此，靶向于单个基因的RNAi技术在基因功能研究、基因治疗等方面很难达到理想目标。以肿瘤为例，研究证明大部分肿瘤并非由单一通路支配，其各个阶段至少需要两个或两个以上不同的与癌症相关的基因异常失活或者激活，而不同的基因则处于一个相互交织、相互协同的分子网络系统。所以单单从一个方面或一个基因入手，往往达不到预期抑癌效果，无法彻底抑制癌细胞生长，肿瘤也就无法得到根治。RNAi技术能够有效抑制目的基因的表达，已广泛用于包括肿瘤在内的多种疾病的基因治疗。目前已有研究者根据肿瘤发生发展过程中不同的关键性基因设计shRNA，构建靶向不同癌相关基因的RNAi表达载体用于肿瘤基因治疗的实验性研究。也有研究者认识到多个基因协同治疗的重要性与必要性，尝试采用联合RNAi技术用于肿瘤基因治疗(Daniel et al, TRENDS in Biotechnology 2006 M :76)。但是，研究者通常分别构建靶向单个基因的RNAi表达载体， 然后采用共转染的方法，将不同的RNAi表达载体共同转染肿瘤细胞，进而研究联合基因沉默对于肿瘤基因治疗的效果。由于RNAi表达载体在转染哺乳动物细胞时对其用量有严格的要求，这就从某种程度上限制了 RNAi效果。因此，在某些实验尤其是需要同时抑制两个基因时往往受到很大的限制
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是要提供一种包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，可有效解决RNAi表达载体在转染哺乳动物细胞时同时抑制两个基因时受到限制及基因沉默过程中有非组织特异性作用的问题。本发明解决的技术方案是，该载体含有一个组织特异性双基因沉默shRNA表达框 (如图1所示，其中ts-PM π是指具有组织特异性的RNA聚合酶II启动子，Ribo-R是指自剪切核酶序列，即含有自剪切位点的核酶序列，MCS是指多克隆位点，TSS是指具有转录终止功能的序列，shRNA是指shRNA模板序列，其中I，II，III，IV，V，VI，VII分别指不同的限制性内切酶，用箭头表示该酶的酶切位点，其中以I和II的酶切位点作为组织特异性启动子插入的多克隆位点，以MCS-I表示，限制性内切酶III和IV的酶切位点形成第一个shRNA 模板序列插入的多克隆位点，以MCS-2表示，第一个shRNA模板序列以shRNA-Ι表示，限制性内切酶V和VI的酶切位点形成第二个shRNA模板序列插入的多克隆位点，以MCS-3表示，第二个shRNA模板序列以shRNA-2表示)，所述的组织特异性双基因沉默shRNA表达框包含一个插入组织特异性启动子的多克隆位点、两个含有自剪切位点的核酶序列、两个插入shRNA模板序列的多克隆位点和一个转录终止序列；所述的插入组织特异性启动子的多克隆位点位于两个含有自剪切位点的核酶序列中的第一个含有自剪切位点的核酶序列上游；所述的转录终止序列位于两个含有自剪切位点的核酶序列中的第二个含有自剪切位点的核酶序列下游；所述的两个插入shRNA模板序列的多克隆位点中的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点位于两个含有自剪切位点的核酶序列之间，第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点位于第二个含有自剪切位点的核酶序列与转录终止序列之间；所述的多克隆位点是指包含两个或多个限制性内切酶酶切位点的一段DNA序列；一种包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的构建方法，由以下步骤实现(1)在第一个自剪切核酶序列的5’末端和3’末端分别添加和初始载体的限制性内切酶II和III的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得第一个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸，用限制性内切酶II和III双酶切，插入至初始载体相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列的载体A，所述的第一个自剪切核酶序列上含有一个自剪切位点，载体A上相应也含有第一个自剪切位点，初始载体为可插入核酸片段、能携带外源核酸进入哺乳动物细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子，如初始载体 pEGFP-Cl ；(2)在第二个自剪切核酶序列的5’末端和3’末端分别添加和载体A的第一个自剪切核酶序列下游的限制性内切酶IV和V的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得第二个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸，用限制性内切酶IV和V双酶切，插入至载体A相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列和第二个自剪切核酶序列共两个自剪切核酶序列的载体B，所述的第二个自剪切核酶序列上含有一个自剪切位点，因此载体 B上相应含有第一个自剪切位点和第二个自剪切位点共两个自剪切位点；(3)在转录终止序列的5’末端和3’末端分别添加和载体B的第二个自剪切核酶序列下游的限制性内切酶VI和VII的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得具有转录终止序列的寡核苷酸，用限制性内切酶VI和VII双酶切，插入至载体B相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列和第二个自剪切核酶序列共两个自剪切核酶序列以及一个转录终止序列的载体C，即为含有一个组织特异性双基因沉默shRNA表达框的包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，所述载体C的限制性内切酶II 酶切位点上游具有限制性内切酶I酶切位点，限制性内切酶I和II酶切位点作为插入组织特异性启动子的多克隆位点，限制性内切酶III和IV酶切位点作为第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点，限制性内切酶V和VI酶切位点作为第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点；所述的人工合成的具有自剪切核酶序列的寡核苷酸和人工合成转录终止序列的寡核苷酸均由北京三博远志生物技术公司提供完成。注本说明书中所述“构建”载体，属于现有技术，具体操作参照《分子克隆实验指南》([美]J.萨姆布鲁克和D. W.拉塞尔，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)。北京科学出版社，2002年)。含有自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的应用(1)在第一个shRNA模板序列的5’末端和3’末端分别添加和载体C的第一个 shRNA模板序列多克隆位点相同的限制性内切酶III和IV的酶切位点，人工合成，用限制性内切酶III和IV双酶切后，插入至载体C中的含有一个组织特异性双基因沉默shRNA表达框中的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点处，采用常规方法构建载体D，在第二个 shRNA模板序列的5’末端和3’末端分别添加和载体D的第二个shRNA模板序列多克隆位点相同的限制性内切酶V和VI的酶切位点，人工合成，用限制性内切酶V和VI双酶切后， 插入至载体D中的第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点处，采用常规方法构建载体E ；人工合成用于扩增组织特异性启动子的引物，以人源细胞的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得具有组织特异性启动子序列的PCR产物，将具有组织特异性启动子序列的 PCR产物用和载体E的组织特异性启动子多克隆位点的限制性内切酶I和II的酶切位点相应的限制性内切酶I和II双酶切，插入至载体E的组织特异性启动子多克隆位点，采用常规方法构建靶向两个不同基因的含有组织特异性双基因沉默shRNA表达框的载体F ；或在载体C中插入组织特异性启动子的多克隆位点处先插入经PCR扩增，双酶切后的组织特异性启动子，采用常规方法构建载体G，在载体G中的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点处再插入人工合成后经双酶切的第一个shRNA模板序列，采用常规方法构建载体H， 在载体H中的第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点处插入人工合成后经双酶切的第二个shRNA模板序列，采用常规方法构建靶向两个不同基因的含有组织特异性双基因沉默 shRNA表达框的载体R ；所述的人源细胞为人肝癌细胞SMMC-7721等人的细胞；(2)或将上述构建的含有组织特异性双基因沉默shRNA表达框的载体F或载体R 中的组织特异性双基因沉默shRNA表达框插入到其它不同的载体K中，即可采用常规方法构建不同的含有自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体H ；所述的载体K为可插入外源核酸片段、能携带外源核酸进入哺乳动物细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子；所述的组织特异性启动子是具有组织特异性的RNA聚合酶II启动子，包括具有肿瘤组织特异性的人端粒酶逆转录酶启动子(又称hTERT启动子)SEQ ID N0:25或具有肝组织特异性的载脂蛋白A-I启动子(又称apoA-I启动子)SEQ ID NO :24 ；所述的自剪切位点是自剪切核酶序列中发生自我剪切作用的位点(如图2所示)，自剪切核酶序列包括顺式作用无勾双髻鲨核酶序列(简称ribozyme序列)SEQ ID NO :1 ；所述的转录终止序列是可以终止DNA转录的序列，包括锌指蛋白MAZ结合序列(简称MAZ序列)SEQ ID NO 2 ；所述的两个shRNA模板序列是指经转录可以得到shRNA，并诱导靶基因发生RNAi效应的序列，包括靶向人端粒酶逆转录酶的shRNA模板序列(简称hTERT shRNA序列)SEQ ID NO :3、靶向人表皮生长因子受体的shRNA模板序列(简称hEGFR shRNA序列)SEQ ID NO :5、靶向细胞原癌基因c-fos的shRNA模板序列(简称c-fos shRNA序列)SEQ ID NO :6、靶向原癌基因 JunB的shRNA模板序列(简称JunB shRNA序列)SEQ ID NO 4中的任何两个。本发明的构建方法简单，易操作，可根据需要替换不同的组织特异性启动子或靶向不同基因的shRNA模板序列，即可构建出具有自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi 表达载体。
图1为组织特异性双基因沉默RNAi表达载体上shRNA表达框结构示意图。图2为顺式作用无勾双髻鲨核酶模板序列及发生自我剪切作用的位点。图3组织特异性双基因沉默RNAi表达载体pTSDS结构示意图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式
作详细说明。1、菌株与载体初始载体pEGFP-Cl (GenBank登录号为U55763)购自BD Biosciences Clontech 公司；载体 pRS 购自 OriGene 公司，序列见于 http://www. origene. com/rna/vector_information. mspx ；肝癌细胞 SMMC-7721，肺癌细胞 A549，食管癌细胞 EC9706，人胚肺细胞WI-38(第12代)均购自中国科学院细胞库。2、酶与试剂限制性内切酶(Ase I、Nhe I,Bgl II、HindIII、EcoR I,Kpn I,BamH I) >T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶等常用酶类购自i^ermentas公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；高糖DMEM培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司；体外转染试剂ExGen 500购自!^ermentas公司；脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 购自^witrogen公司，所有引物、寡核苷酸合成及基因测序均由北京三博远志生物技术公司提供完成。3、10%胎牛血清的DMEM培养基向900mlDMEM培养基中加入100ml胎牛血清制成。4、试验中用到的核酸序列，所用序列不用来限制本发明的范围。(1)用于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的引物特异性hTERT 引物上游引物，5 ‘ -cggaagagtgtctggagcaa-3 ‘；下游引物，5 ‘ -ggatgaagcggagtctgga-3 '。特异性β-actin引物上游引物， 5 ‘ -ctgggacgacaggagaaaa-3 ‘ ； T M>5 ‘ -aaggaaggctggaagagtgc-3 ‘。 特异性 hEGFR 引物上游引物，5 ‘ -agctcacgcagttgggcact-3 ‘；下游引物，5 ‘ -tctcatgggcagctccttca-3 ‘。特异性 c_fos 引物上游引物， 5 ‘ -ccgactccttctccagcat-3 ‘；下游弓I 物，5 ‘ -tcaccgtggggataaagttg-3 ‘。 特异性JunB引物上游引物，5 ‘ -atgtgcactaaaatggaaca-3 ‘；下游引物， 5 ‘ -cctgaccagaaaagtagctg-3 ‘。
(2)用于聚合酶链式反应(PCR)扩增启动子的引物用于扩增载脂蛋白A-I启动子的引物上游引物， 5，-ATTAATaggggaaggggatgagtg-3，；下游弓I物，5，_GCTAGCgagaagaagggcctggctga_3，。用于扩增hTERT 启动子的引物上游引物，5，-ATTAATtccgcccggagcagctgcg-3，； 下游弓I物，5' -GCTAGCgcagcactcgggccaccag-3‘。说明为了方便构建载体，在启动子扩增引物上增加酶切位点，以大写字母表示， 其中上游引物上添加的是Ase I酶切位点，在下游引物上添加的是Nhe I酶切位点。实施例1 (1)第一个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入初始载体pEGFP-Cl，在第一个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列(SEQ ID NO 1)的5，末端添加Nhe I酶切位点(GCTAGC)，在3，末端添加Bgl II酶切位点 (AGATCT)，人工合成，得第一个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Nhe I和Bgl II双酶切，插入初始载体pEGFP-Cl的Nhe I和Bgl II酶切位点， 由此采用常规方法构建载体PRib (SEQ ID NO 7)；(2)第二个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pRib，在第二个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列(SEQ ID N0:1) 的5’末端添加HindIII酶切位点(AAGCTT)，3’末端添加EcoR I酶切位点(GAATTC)，人工合成，得第二个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Hindi11 和EcoR I双酶切，插入到载体pRib的第一个自剪切核酶序列下游的HindIII和EcoR I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pDi-Rib(SEQ ID NO 8)；(3)具有转录终止序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pDi-Rib，在锌指蛋白MAZ结合序列(SEQ ID NO 2)的5，末端添加Kpn I酶切位点(GGTACC)，3’末端添加BamH I酶切位点(GGATCC)，人工合成，得具有锌指蛋白MAZ结合序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切，插入到载体pDi-Rib的第二个自剪切核酶序列下游的Kpn I和BamH I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pTSDS(SEQ ID NO 9)；如图3所示，在图3中列出了载体pTSDS的结构示意图， 其中ts-PM π是指组织特异性RNA聚合酶II启动子，Ribo-c是指顺式作用无勾双髻鲨核酶序列，MAZ是指锌指蛋白MAZ结合序列，shRNA-Ι是指第一个shRNA模板序列，shRNA-2是指第二个shRNA模板序列，其中Ase I、Nhe I,Bgl II、HindIII、EcoR I,Kpn I是指限制性内切酶 Ase I, Nhe I, Bgl II、Hindlll、EcoR I, Kpn I 的酶切位点，在载体 pTSDS 的 Nhe I 酶切位点上游存在Ase I酶切位点，Ase I和Nhe I酶切位点之间形成了组织特异性启动子插入的多克隆位点，可以在该位点插入具有组织特异性的RNA聚合酶II启动子，Bgl II 和HindIII酶切位点之间形成了第一个shRNA模板序列插入的多克隆位点，可以在该位点插入第一个靶基因的shRNA模板序列，EcoR I和Kpn I酶切位点之间形成了第二个shRNA 模板序列插入的多克隆位点，可以在该位点插入第二个靶基因的shRNA模板序列；(4)第一个shRNA模板序列多克隆位点插入hTERT shRNA序列为了方便插入载体pTSDS，在hTERT shRNA序列(SEQ ID NO :3)的5，末端添加 Bgl II酶切位点，3’末端添加HindIII酶切位点，人工合成，得含有hTERT shRNA序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Bgl II和HindIII双酶切，酶切后插入到载体pTSDS的第一个shRNA模板序列的多克隆位点，即Bgl II和HindIII酶切位点，由此采用常规方法构建得到靶向 hTERT 的载体 pTSDS-t(SEQ ID NO :10)；(5)第二个shRNA模板序列多克隆位点插入JunB shRNA序列为了方便插入载体pTSDS-t，在JunB shRNA序列(SEQ ID NO 4)的5，末端添加 EcoR I酶切位点，3’末端添加Kpn I酶切位点，人工合成，得含有JimB shRNA序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切，酶切后插入到载体pTSDS_t的第二个 shRNA模板序列的多克隆位点，即EcoR I和Kpn I酶切位点，由此采用常规方法构建得到靶向 hTERT 和 JunB 的载体 pTSDS-tb (SEQ ID NO :11)；(6)apoA-I启动子的扩增，以及apoA-I启动子插入组织特异性启动子多克隆位占.
^ \\\ ·人工合成用于扩增apoA-I启动子的引物上游引物 5，-ATTAATaggggaaggggatgagtg-3，，下游弓 I物 5，_GCTAGCgagaagaagggcctggctga_3，，以人肝癌细胞SMMC-7721基因组为模板进行PCR扩增，得到具有apoA-I启动子序列(SEQ ID NO 24)的PCR产物，将具有apoA-I启动子序列的PCR产物以限制性内切酶Ase I和Nhe I双酶切，插入至载体pTSDS-tb的组织特异性启动子多克隆位点，即Ase I和Nhe I酶切位点， 经测序验证，采用常规方法构建得到同时靶向hTERT和JimB双基因的肝组织特异性的双基因沉默 RNAi 表达载体 pTSDS/apo-tb (SEQ ID NO :12)；(7)载体pTSDS/apo-tb转染肝癌细胞SMMC-7721及RNAi效应验证人肝癌细胞SMMC-7721在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基和37°C、5% CO2条件下进行常规培养，转染前1 按1 X IO6个/孔接种于6孔板，培养过夜，细胞贴壁生长到 90%融合时，用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将肝特异性双基因沉默载体pTSDS/ apo-tb转染至肝癌细胞SMMC-7721，具体步骤如下将40 μ 1载体pTSDS/apo-tb与10 μ 1 脂质体转染试剂Lipofectamine 2000加入500 μ 1无血清DMEM培养基中，涡旋混勻，室温静置20min，得混合物，然后将该混合物加入人肝癌细胞SMMC-7721，37°C培养6小时，然后加入含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，同时设置对照试验，对照试验是采用相同的办法将载体pTSDS/apo-tb转染人食管癌细胞EC9706 ；转染7 后，四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)测定细胞增殖，实验结果显示，转染载体pTSDS/apo-tb的肝癌细胞生长抑制率为57%，而转染载体pTSDS/apo-tb的食管癌细胞生长没有受到显著抑制，采用Trizol法提取细胞总RNA，采用RT-PCR技术检测靶基因沉默效率用特异性hTERT引物扩增hTERT片段(SEQ ID NO 19)，用特异性JunB引物扩增 JunB片段(SEQ ID NO :22)，同时以特异性β-actin引物扩增肿瘤细胞看家基因β -actin 片段(SEQ ID NO :2；3)作为内参基因的表达水平，实验结果显示，转染载体pTSDS/apo-tb的肝癌细胞中hTERT与JunB的相对表达量分别为0. 24和0. 31，即hTERT和JunB的表达均受到显著抑制，抑制率分别为76%和69%，转染载体pTSDS/apo-tb的食管癌细胞中hTERT 与JunB的相对表达量分别为0. 94和0. 99，即hTERT mRNA和hEGFR mRNA的表达均未发生明显变化，试验结果表明肝特异性双基因沉默载体pTSDS/apo-tb在肝癌细胞中可以显著抑制hTERT和JimB的表达，诱导RNAi效应，抑制细胞增殖，而在非肝细胞的食管癌细胞中却不能明显诱导RNAi效应。实施例2
(1)第一个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入初始载体pEGFP-Cl，在第一个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列(SEQ ID NO 1)的5，末端添加Nhe I酶切位点(GCTAGC)，在3，末端添加Bgl II酶切位点 (AGATCT)，人工合成，得第一个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Nhe I和Bgl II双酶切，插入初始载体pEGFP-Cl的Nhe I和Bgl II酶切位点， 由此采用常规方法构建载体PRib (SEQ ID NO 7)；(2)第二个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pRib，在第二个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列(SEQ ID N0:1) 的5’末端添加HindIII酶切位点(AAGCTT)，3’末端添加EcoR I酶切位点(GAATTC)，人工合成，得第二个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Hindi11 和EcoR I双酶切，插入到载体pRib的第一个自剪切核酶序列下游的HindIII和EcoR I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pDi-Rib(SEQ ID NO 8)；(3)具有转录终止序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pDi-Rib，在锌指蛋白MAZ结合序列(SEQ ID NO 2)的5，末端添加Kpn I酶切位点(GGTACC)，3’末端添加BamH I酶切位点(GGATCC)，人工合成，得具有锌指蛋白MAZ结合序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切，插入到载体pDi-Rib的第二个自剪切核酶序列下游的Kpn I和BamH I酶切位点，由此采用常规方法构建载体 pTSDS(SEQ ID NO 9)；(4)hTERT启动子的扩增，以及hTERT启动子插入组织特异性启动子多克隆位点人工合成用于扩增hTERT启动子的引物上游引物 5，-ATTAATtccgcccggagcagctgcg-3，，下游弓I物，5，_GCTAGCgcagcactcgggccaccag_3，，以人肝癌细胞SMMC-7721基因组为模板进行PCR扩增，得到具有hTERT启动子序列(SEQ ID NO 25)的PCR产物，以限制性内切酶Ase I和NheI双酶切，酶切后插入至载体pTSDS的组织特异性启动子多克隆位点，即Ase I和 Nhe I酶切位点，经测序验证，采用常规方法构建得到具有肿瘤特异性的双基因沉默RNAi 表达载体 pTSDS/tert (SEQ ID NO :13)；(5)第一个shRNA模板序列多克隆位点插入hEGFR shRNA序列为了方便插入载体pTSDS/tert，在 hEGFR shRNA 序列(SEQ ID NO 5)的 5，末端添加Bgl II酶切位点，3，末端添加HindIII酶切位点，人工合成，得含有hEGFR shRNA序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Bgl II和HindIII双酶切，酶切后插入到载体pTSDS/ tert的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点，即Bgl II和HindIII酶切位点，由此采用常规方法构建得到靶向hEGFR的载体pTSDS/tert-e (SEQ ID NO :14)；(6)第二个shRNA模板序列多克隆位点插入c-fos shRNA序列为了方便插入载体pTSDS/tert-e，在 c-fos shRNA 序列(SEQ ID NO 6)的 5，末端添加EcoR I酶切位点，3’末端添加Kpn I酶切位点，人工合成，得含有c-fos shRNA序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切，酶切后插入到载体pTSDS/tert-e 的第二个shRNA模板序列的多克隆位点中的EcoR I和pn I酶切位点，采用常规方法构建得到同时靶向c-fos和hEGFR的肿瘤组织特异性双基因沉默载体pTSDS/tert-ef (SEQ ID NO 15)；
(7)肿瘤组织特异性双基因沉默病毒载体的构建将同时靶向c-fos和hEGFR的肿瘤特异性双基因沉默载体pTSDS/tert-ef以限制性内切酶Ase I和BamH I双酶切，并以T4DNA聚合酶将粘性末端进行补平，琼脂糖凝胶电泳回收小片段(SEQ ID NO :17)，以限制性内切酶EcoR I和HindIII双酶切逆转录病毒载体pRS (OriGene)，并以T4DNA聚合酶将粘性末端进行补平，琼脂糖凝胶电泳回收大片段(SEQ ID NO :18)，以T4DNA连接酶将上述小片段和大片段进行连接，采用常规方法构建得到肿瘤组织特异性双基因沉默病毒载体pTSDS/MMLV/tert-ef(SEQ ID NO :16)；(8)载体pTSDS/MMLV/tert-ef细胞转染及RNAi效应验证肺癌细胞A549在含10%胎牛血清的DMEM培养基和37°C、5% CO2条件下进行常规培养，转染前1 按7. 25 X IO5个/孔接种于6孔板，培养过夜，细胞贴壁生长到60 %融合时，用体外转染试剂ExGen 500将肿瘤特异性双基因沉默载体pTSDS/MMLV/tert-ef转染至肺癌细胞，具体步骤如下将3 μ g载体pTSDS/MMLV/tert-ef溶解在200 μ 1 150mmol/L的 NaCl中，涡旋混勻，加入9. 87 μ 1转染试剂ExGen500迅速涡旋10s，室温温育lOmin，然后将转染试剂EXGen500和载体pTSDS/MMLV/tert-ef的混合物加入培养基中，同时设置对照试验，对照试验是将载体pTSDS/MMLV/tert-ef转染非肿瘤细胞系的人胚肺细胞WI-38 (第12 代)；同时靶向hEGFR和c-fos双基因的肿瘤特异性双基因沉默病毒载体pTSDS/MMLV/ tert-ef转染4 后，MTT法测定细胞增殖，实验结果显示，转染载体pTSDS/MMLV/tert-ef 的肺癌细胞生长抑制率为57%，而转染载体pTSDS/MMLV/tert-ef的人胚肺细胞生长没有受到显著抑制，采用Trizol法提取细胞总RNA，采用RT-PCR技术检测靶基因沉默效率用特异性hEGFR引物扩增hEGFR片段(SEQ ID NO 20)，以特异性c-fos引物扩增c-fos片段 (SEQ ID N0:21)，同时以特异性β-actm引物扩增β-actm片段(SEQ ID NO 23)作为内参基因的表达水平，实验结果显示，转染载体pTSDS/MMLV/tert-ef的肺癌细胞中c-fos与 hEGFR的相对表达量分别为0. 31和0. 19，即c-fos和hEGFR的表达均受到显著抑制，抑制率分别为69%和81%，转染载体pTSDS/MMLV/tert-ef的人胚肺细胞中hEGFR与c-fos的相对表达量分别为0. 94和0. 97，即c-fos和hEGFR的表达均未发生明显变化，试验结果表明肿瘤特异性双基因沉默载体pTSDS/MMLV/tert-ef在肺癌细胞中可以显著抑制c-fos和 hEGFR的表达，诱导RNAi效应，抑制细胞增殖，而在非肿瘤细胞系的人胚肺细胞中却不能明显诱导RNAi效应。由上述表明，本发明载体经反复多次实验，均取得了满意的有益技术效果，充分证明，本发明是可用于双基因沉默的组织特异性RNAi表达载体，克服了 shRNA载体已知的缺陷，通过一个转录单元同时获得两个独立的shRNA转录子，同时实现基因沉默的组织特异性，以减少基因沉默过程中的非特异性作用。本发明利用自剪切核酶构建同时靶向两个不同基因的双基因RNAi表达载体，并将其用于基因治疗领域。具体策略就是，在启动子与第一个shRNA序列之间，以及两个shRNA序列之间分别插入一个自剪切核酶序列，通过转录产物中核酶的自我剪切功能不仅切除5’末端的m7G帽子，同时将两个shRNA分离。同时，本发明在构建双基因RNAi载体的过程中，采用具有组织特异性的Pol II启动子，从而调控 shRNA表达的组织特异性，进而实现组织特异性的双基因沉默，是医药领域的一大创新。
权利要求
1. 一种包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，其特征在于，该载体含有一个组织特异性双基因沉默shRNA表达框，所述的该表达框包含一个插入组织特异性启动子的多克隆位点、两个含有自剪切位点的核酶序列、两个插入shRNA模板序列的多克隆位点和一个转录终止序列；所述的插入组织特异性启动子的多克隆位点位于两个含有自剪切位点的核酶序列中的第一个含有自剪切位点的核酶序列上游；所述的转录终止序列位于两个含有自剪切位点的核酶序列中的第二个含有自剪切位点的核酶序列下游；所述的两个插入shRNA模板序列的多克隆位点中的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点位于两个含有自剪切位点的核酶序列之间，第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点位于第二个含有自剪切位点的核酶序列与转录终止序列之间；包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的构建，由以下步骤实现(1)在第一个自剪切核酶序列的5’末端和3’末端分别添加和初始载体的限制性内切酶II和III的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得第一个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸，用限制性内切酶II和III双酶切，插入至初始载体相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列的载体A，所述的第一个自剪切核酶序列上含有一个自剪切位点，载体A上相应也含有第一个自剪切位点，初始载体为可插入外源核酸片段、能携带外源核酸进入哺乳动物细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子；(2)在第二个自剪切核酶序列的5’末端和3’末端分别添加和载体A的第一个自剪切核酶序列下游的限制性内切酶IV和V的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得第二个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸，用限制性内切酶IV和V双酶切，插入至载体A相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列和第二个自剪切核酶序列共两个自剪切核酶序列的载体B，所述的第二个自剪切核酶序列上含有一个自剪切位点，因此载体B上相应含有第一个自剪切位点和第二个自剪切位点共两个自剪切位点；(3)在转录终止序列的5’末端和3’末端分别添加和载体B的第二个自剪切核酶序列下游的限制性内切酶VI和VII的酶切位点相同的酶切位点，人工合成，得具有转录终止序列的寡核苷酸，用限制性内切酶VI和VII双酶切，插入至载体B相同的酶切位点，采用常规方法构建含有第一个自剪切核酶序列和第二个自剪切核酶序列共两个自剪切核酶序列以及一个转录终止序列的载体C，即为含有一个组织特异性双基因沉默shRNA表达框的包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，所述载体C的限制性内切酶II酶切位点上游具有限制性内切酶I酶切位点，限制性内切酶I和II酶切位点作为插入组织特异性启动子的多克隆位点，限制性内切酶III和IV酶切位点作为第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点，限制性内切酶V和VI酶切位点作为第二个插入shRNA模板序列的多克隆位占.所述的组织特异性启动子是具有组织特异性的RNA聚合酶II启动子，包括具有肿瘤组织特异性的人端粒酶逆转录酶启动子SEQ ID NO :25或具有肝组织特异性的载脂蛋白A-I 启动子SEQID NO 24 ；所述的自剪切位点是自剪切核酶序列中发生自我剪切作用的位点， 自剪切核酶序列包括顺式作用无勾双髻鲨核酶序列SEQ ID NO :1 ；所述的转录终止序列是可以终止DNA转录的序列，包括锌指蛋白MAZ结合序列SEQ ID NO 2 ；所述的两个shRNA模板序列是指经转录可以得到shRNA，并诱导靶基因发生RNAi效应的序列，包括靶向人端粒酶逆转录酶的shRNA模板序列SEQ ID NO :3、靶向人表皮生长因子受体的shRNA模板序列SEQ ID NO :5、靶向细胞原癌基因c-fos的shRNA模板序列SEQ ID NO :6、靶向原癌基因JunB 的shRNA模板序列SEQ ID NO 4中的任何两个。
2.根据权利要求1所述的包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，其特征在于，由以下步骤实现(1)第一个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入初始载体PEGFP-C1，在第一个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列SEQ ID NO 1的5，末端添加Nhe I酶切位点GCTAGC，在3，末端添加Bgl II酶切位点AGATCT，人工合成，得第一个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Nhe I和 Bgl II双酶切，插入初始载体pEGFP-Cl的Nhe I和Bgl II酶切位点，由此采用常规方法构建载体 pRib SEQ ID NO 7 ；(2)第二个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pRib，在第二个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列SEQ ID N0:1的5’末端添加HindIII酶切位点AAGCTT，3’末端添加EcoR I酶切位点GAATTC，人工合成，得第二个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶HindIII和EcoR I 双酶切，插入到载体PRib的第一个自剪切核酶序列下游的HindIII和EcoR I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pDi-Rib SEQ ID NO 8 ；(3)具有转录终止序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pDi-Rib，在锌指蛋白MAZ结合序列SEQ ID NO :2的5，末端添加Kpn I酶切位点GGTACC，3，末端添加BamH I酶切位点GGATCC，人工合成，得具有锌指蛋白MAZ结合序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切，插入到载体pDi-Rib的第二个自剪切核酶序列下游的Kpn I和BamH I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pTSDS SEQ ID NO:9。
3.权利要求1所述的包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的应用， 包括在第一个shRNA模板序列的5’末端和3’末端分别添加和载体C的第一个shRNA模板序列多克隆位点相同的限制性内切酶III和IV的酶切位点，人工合成，用限制性内切酶III 和IV双酶切后，插入至载体C中的含有一个组织特异性双基因沉默shRNA表达框中的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点处，采用常规方法构建载体D，在第二个shRNA模板序列的5’末端和3’末端分别添加和载体D的第二个shRNA模板序列多克隆位点相同的限制性内切酶V和VI的酶切位点，人工合成，用限制性内切酶V和VI双酶切后，插入至载体D 中的第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点处，采用常规方法构建载体E ；人工合成用于扩增组织特异性启动子的引物，以人源细胞的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得具有组织特异性启动子序列的PCR产物，将具有组织特异性启动子序列的PCR产物用和载体E的组织特异性启动子多克隆位点的限制性内切酶I和II的酶切位点相应的限制性内切酶I和 II双酶切，插入至载体E的组织特异性启动子多克隆位点，采用常规方法构建靶向两个不同基因的含有组织特异性双基因沉默shRNA表达框的载体F ；或在载体C中插入组织特异性启动子的多克隆位点处先插入经PCR扩增，双酶切后的组织特异性启动子，采用常规方法构建载体G，在载体G中的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点处再插入人工合成后经双酶切的第一个shRNA模板序列，采用常规方法构建载体H，在载体H中的第二个插入shRNA模板序列的多克隆位点处插入人工合成后经双酶切的第二个shRNA模板序列，采用常规方法构建靶向两个不同基因的含有组织特异性双基因沉默shRNA表达框的载体R。
4.根据权利要求3所述的包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的应用，包括将构建的含有组织特异性双基因沉默shRNA表达框的载体F或载体R中的组织特异性双基因沉默shRNA表达框插入到其它不同的载体K中，采用常规方法构建不同的含有自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体H ；所述的载体K为可插入外源核酸片段、能携带外源核酸进入哺乳动物细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。
5.根据权利要求3所述的包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的应用，其特征在于，由以下步骤实现(1)第一个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入初始载体PEGFP-C1，在第一个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列SEQ ID NO 1的5，末端添加Nhe I酶切位点GCTAGC，在3，末端添加Bgl II酶切位点AGATCT，人工合成，得第一个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Nhe I和 Bgl II双酶切，插入初始载体pEGFP-Cl的Nhe I和Bgl II酶切位点，由此采用常规方法构建载体 pRib SEQ ID NO 7 ；(2)第二个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pRib，在第二个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列SEQ ID N0:1的5’末端添加HindIII酶切位点AAGCTT，3’末端添加EcoR I酶切位点GAATTC，人工合成，得第二个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶HindIII和EcoR I 双酶切，插入到载体PRib的第一个自剪切核酶序列下游的HindIII和EcoR I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pDi-Rib SEQ ID NO 8 ；(3)具有转录终止序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pDi-Rib，在锌指蛋白MAZ结合序列SEQ ID NO :2的5，末端添加Kpn I酶切位点GGTACC，3’末端添加BamH I酶切位点GGATCC，人工合成，得具有锌指蛋白MAZ结合序列的寡核苷酸双链以限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切，插入到载体pDi-Rib的第二个自剪切核酶序列下游的Kpn I和BamH I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pTSDS SEQ ID NO9 ；(4)第一个shRNA模板序列多克隆位点插入hTERTshRNA序列为了方便插入载体pTSDS，在hTERT shRNA序列SEQ ID NO :3的5，末端添加Bgl II酶切位点，3’末端添加HindIII酶切位点，人工合成，得含有hTERT shRNA序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Bgl II和HindIII双酶切，酶切后插入到载体pTSDS的第一个shRNA 模板序列的多克隆位点，即Bgl II和HindIII酶切位点，由此采用常规方法构建得到靶向 hTERT 的载体 pTSDS-t SEQID NO :10 ；(5)第二个shRNA模板序列多克隆位点插入JimBshRNA序列为了方便插入载体pTSDS-t，在JunB shRNA序列SEQ ID NO :4的5，末端添加EcoR I 酶切位点，3’末端添加Kpn I酶切位点，人工合成，得含有JimB shRNA序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切，酶切后插入到载体pTSDS-t的第二个shRNA模板序列的多克隆位点，即EcoR I和Kpn I酶切位点，由此采用常规方法构建得到靶向hTERT和 JunB 的载体 pTSDS-tb SEQ ID NO :11 ；(6)apoA-I启动子的扩增，以及apoA-I启动子插入组织特异性启动子多克隆位点人工合成用于扩增apoA-I启动子的引物上游引物 5，-ATTAATaggggaaggggatgagtg-3，，下游弓 I物 5，_GCTAGCgagaagaagggcctggctga_3，，以人肝癌细胞SMMC-7721基因组为模板进行PCR扩增，得到具有apoA-I启动子序列SEQ ID NO M WPCR产物，将具有apoA-I启动子序列的PCR产物以限制性内切酶Ase I和Nhe I双酶切，插入至载体pTSDS-tb的组织特异性启动子多克隆位点，即Ase I和Nhe I酶切位点，经测序验证，采用常规方法构建得到同时靶向hTERT和JimB双基因的肝组织特异性的双基因沉默 RNAi 表达载体 pTSDS/apo-tb SEQ ID NO :12。
6.根据权利要求3所述的包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体的应用，其特征在于，由以下步骤实现(1)第一个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入初始载体PEGFP-C1，在第一个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列SEQ ID NO 1的5，末端添加Nhe I酶切位点GCTAGC，在3，末端添加Bgl II酶切位点AGATCT，人工合成，得第一个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Nhe I和 Bgl II双酶切，插入初始载体pEGFP-Cl的Nhe I和Bgl II酶切位点，由此采用常规方法构建载体 pRib SEQ ID NO 7 ；(2)第二个具有自剪切核酶序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pRib，在第二个顺式作用无勾双髻鲨核酶序列SEQ ID N0:1的5’末端添加HindIII酶切位点AAGCTT，3’末端添加EcoR I酶切位点GAATTC，人工合成，得第二个具有顺式作用无勾双髻鲨核酶序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶HindIII和EcoR I 双酶切，插入到载体PRib的第一个自剪切核酶序列下游的HindIII和EcoR I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pDi-Rib SEQ ID NO 8 ；(3)具有转录终止序列的寡核苷酸的插入为了方便插入载体pDi-Rib，在锌指蛋白MAZ结合序列SEQ ID NO :2的5，末端添加Kpn I酶切位点GGTACC，3’末端添加BamH I酶切位点GGATCC，人工合成，得具有锌指蛋白MAZ结合序列的寡核苷酸双链以限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切，插入到载体pDi-Rib的第二个自剪切核酶序列下游的Kpn I和BamH I酶切位点，由此采用常规方法构建载体pTSDS SEQ ID NO9 ；(4)hTERT启动子的扩增，以及hTERT启动子插入组织特异性启动子多克隆位点人工合成用于扩增hTERT启动子的引物上游引物5' -ATTAATtccgcccggagcagctgcg-S',下游弓I物，5，-GCTAGCgcagcactcgggccaccag-3',以人肝癌细胞SMMC-7721基因组为模板进行PCR扩增，得到具有hTERT启动子序列SEQ ID NO 25的PCR产物，以限制性内切酶Ase I和Nhe I双酶切，酶切后插入至载体pTSDS的组织特异性启动子多克隆位点，即Ase I和Nhe I酶切位点，经测序验证，采用常规方法构建得到具有肿瘤特异性的双基因沉默RNAi表达载体pTSDS/tert SEQ ID NO :13;(5)第一个shRNA模板序列多克隆位点插入hEGFRshRNA序列为了方便插入载体pTSDS/tert，在hEGFR shRNA序列SEQ ID NO :5的5，末端添加Bgl II酶切位点，3’末端添加HindIII酶切位点，人工合成，得含有hEGFR shRNA序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶Bgl II和HindIII双酶切，酶切后插入到载体pTSDS/tert的第一个插入shRNA模板序列的多克隆位点，即Bgl II和HindIII酶切位点，由此采用常规方法构建得到靶向 hEGFR 的载体 pTSDS/tert-e SEQ ID NO :14;(6)第二个shRNA模板序列多克隆位点插入c-fosshRNA序列为了方便插入载体pTSDS/tert-e，在c-fos shRNA序列SEQ ID NO :6的5，末端添加 EcoR I酶切位点，3’末端添加Kpn I酶切位点，人工合成，得含有c-fos shRNA序列的寡核苷酸双链，以限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切，酶切后插入到载体pTSDS/tert-e的第二个shRNA模板序列的多克隆位点中的EcoR I和pn I酶切位点，采用常规方法构建得到同时靶向c-fos和hEGFR的肿瘤组织特异性双基因沉默载体pTSDS/tert-ef SEQ ID NO: 15 ；(7)肿瘤组织特异性双基因沉默病毒载体的构建将同时靶向c-fos和hEGFR的肿瘤特异性双基因沉默载体pTSDS/tert-ef以限制性内切酶Ase I和BamH I双酶切，并以T4DNA聚合酶将粘性末端进行补平，琼脂糖凝胶电泳回收小片段SEQ ID NO :17，以限制性内切酶EcoR I和HindIII双酶切逆转录病毒载体pRS，并 WT4DNA聚合酶将粘性末端进行补平，琼脂糖凝胶电泳回收大片段SEQ ID N0:18，&T4DNA 连接酶将上述小片段和大片段进行连接，采用常规方法构建得到肿瘤组织特异性双基因沉默病毒载体 pTSDS/MMLV/tert-ef SEQ ID NO: 16。
全文摘要
本发明涉及包含自剪切位点的组织特异性双基因沉默RNAi表达载体，有效解决RNAi表达载体在转染哺乳动物细胞时同时抑制两个基因时受到限制及基因沉默过程中有非组织特异性作用的问题，该载体含有组织特异性双基因沉默shRNA表达框，组织特异性双基因沉默shRNA表达框包含一个插入组织特异性启动子的多克隆位点、两个含有自剪切位点的核酶序列、两个插入shRNA模板序列的多克隆位点和一个转录终止序列。
文档编号C12N15/66GK102533831SQ20121003393
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者任雪玲, 宋雨, 张云, 张振中, 柴丽娜 申请人:郑州大学