专利名称：一种可溶细菌纤维素的制备方法
技术领域：
本发明属于细菌纤维素的制备领域，特别涉及一种可溶细菌纤维素的制备方法。
背景技术：
细菌纤维素是一种由木醋杆菌等细菌分泌的胞外多糖聚合物，自然发酵成膜的细菌纤维素与普通植物纤维素一样，都不溶于水，从而限制了其在水溶性材料方面的应用。细菌纤维素的溶解是近年来兴起的一项研究，此研究大大扩展了细菌纤维素应用范围，研究可溶性细菌纤维素经济可行的发酵工艺，提高产率和产量，研制开发具有自主知识产权的细菌纤维素生物医用材料是目前国内外研究的重点和难点。据研究发现静置培养的木醋杆菌发酵液中存在部分低分子量的水溶性细菌纤维素，但是产量不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可溶细菌纤维素的制备方法，本发明工艺简单易行，充分利用了发酵液中的原料，通过添加多糖提高可溶纤维素的合成，添加玻璃珠或提高搅拌速度增加剪切力提高可溶纤维素产量，以及控制发酵PH值等技术得到的可溶性细菌纤维素有一定粘度。本发明的一种可溶细菌纤维素的制备方法，包括以碳源和氮源组成液体培养基，将细菌纤维素生产菌株接入培养基放在摇床上或者发酵罐中动态发酵培养，在液体培养基中加入多糖、酸及玻璃珠，20 32°C下培养3-7天后取发酵液离心，得到的上清液经有机溶剂沉淀，得到可溶细菌纤维素。所述的液体培养基中的碳源是以下的一种或几种，包括甘露醇、甘油等醇类化合物，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等六碳糖，阿拉伯糖和木糖等五碳糖，蔗糖和麦芽糖等二糖；氮源为以下的一种或几种，包括蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、尿素、玉米浆等有机氮源，硫酸铵、氯化铵、硝酸钠等无机氮源。所述碳源浓度为25-100g/L，氮源浓度为3-10g/L，液体培养基pH值为4. 5 6. O。所述细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属 (Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、葡萄糖氧化杆菌 (Gluconobacter oxydans)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobacter sp.)、产喊菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氣菌属(Azotobacter sp. )、土壤杆菌属 (Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、木醋杆菌(Acetobacter xyIinum)或红茶菌(kombucha)。所述动态发酵培养的转速为50-300rpm，优选180rpm。所述多糖为羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、可溶性淀粉、糊精、果胶、透明质酸、琼脂或肝素，与液体培养基质量体积比为0.06g 100ml，优选果胶。所述酸为醋酸、乳酸、柠檬酸、盐酸、硫酸或植酸，与液体培养基质量体积比为0. Ig : 100ml,优选朽1檬酸。所述玻璃珠直径为0.添加量为10 30g,优选直径4mm,添加量为20g。所述有机溶剂为无水乙醇、甲醇或丙酮。所述培养时间优选5天。经醇沉淀提取的可溶性细菌纤维素可再溶于水，溶于水后粘度大于水的粘度，说明提取的可溶性细菌纤维素可以增加溶液的粘度，可作为增稠剂应用于食品工业中。有益.效果本发明工艺简单易行，采用动态摇床振荡培养或发酵罐培养以不利于长链纤维素聚合的方式来提高可溶性细菌纤维素的产量，充分利用了发酵液中的原料，通过添加多糖提高可溶纤维素的合成，添加玻璃珠或提高搅拌速度增加剪切力提高可溶纤维素产量，以及控制发酵PH值等技术得到的可溶性细菌纤维素有一定粘度，制得的可溶细菌纤维素可作为增稠剂等应用于食品中。
图I为添加多糖对可溶性细菌纤维素产量的柱状图；图2为添加玻璃珠对可溶性细菌纤维素产量的折线图；图3为时间对可溶性细菌纤维素产量的柱状图；图4为转速对可溶性细菌纤维素产量的柱状图；图5为有机酸对可溶性细菌纤维素产量的柱状图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例I以25g/L甘露醇为碳源，以3g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸膏为氮源，组成液体培养基，将木醋杆菌或红茶菌等细菌纤维素生产菌株放在摇床上动态发酵培养。以0.06 100 (w/v)的浓度分别向50mL培养基中加入羧甲基纤维素钠(CMC)、海藻酸钠、可溶性淀粉和果胶，不添加多糖的基础发酵培养基作为空白对照。将培养I天的种子液摇匀，在无菌操作下，以6%接种量接入种至添加有不同多糖的发酵培养基中。为了扣除添加的多糖对细菌纤维素产量值的影响，增加一个对照组，此对照组为在基础培养基分别添加0. 06%的CMC、海藻酸钠、可溶性淀粉和果胶，但是不接种。种子液摇匀后，放入震荡摇床上，20-30°C下以180r/min转速动态连续培养5天。取出动态培养的木醋杆菌发酵液， 在8000r/min转速下高速离心lOmin，分离上清与沉淀，沉淀放入G3玻沙漏斗中于105°C烘箱中烘绝干重，称量得到不溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。 上清用的95%乙醇以四倍体积进行沉淀，用G3玻沙漏斗抽滤，得到的沉淀放入105°C烘箱中烘绝干重，称重，计算可溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。实验结果见图1，柱形图的下部分为扣除多糖含量的细菌纤维素的产量，上部分为添加的多糖的量。由图I可知，果胶能显著提高可溶性细菌纤维纤维素的产量，其可溶性细菌纤维素产量为2. 96g/L，比空白对照的2. 39g/L提高了 23. 93%，但是对不溶性细菌纤维素产量的提高没有显著效果。添加果胶得到的不溶性细菌纤维素产量为3. 30g/L，空白对照产量为3. 40g/L，产量降低了 2. 7%。相反，CMC、海藻酸钠和可溶性淀粉对提高可溶性细菌纤维素并无明显效果，其可溶性细菌纤维素产量分别1.60g/L、l. 17g/L、2. 03g/L，相比对照的细菌纤维素产量降低了 33. 1%、23. 94%和15.32%。其中，CMC对可溶性细菌纤维素无显著影响，但是能大大提高不溶性细菌纤维素的产量，添加CMC后细菌纤维素产量为8. 64g/ L，产量提高了 154. 8%。可溶性淀粉对不溶性细菌纤维素产量也有提高，其产量为3. 49g/ L，提高3%。对于细菌纤维素总产量来说，CMC和果胶都能提高细菌纤维素的总产量，添加 CMC对BC产量提高的效果最显著，其产量为10. 21g/L，相比于对照的5. 72g/L，产量提高了 78. 48%，添加果胶的BC产量为6. 20g/L，相比对照产量提高了 8.4%。可溶性淀粉和海藻酸钠则对BC产量的提高无明显影响。其产量相比对照分别降低了 22. 1%和4.3%。木醋杆菌发酵液中添加CMC和果胶后，其溶液的粘度变化导致流变学性质发生变化，溶液内物质分布更加均一，有利于木醋杆菌的生长代谢，促进BC生产。实施例2将培养I天的种子液摇匀，在无菌操作下，以6%接种量接入种子液至50mL的分别添加有10g、20g和30g大小不同的玻璃珠的发酵培养基中(大玻璃珠直径8mm，小玻璃纸直径4mm,培养基由100g/L鹿糖、3g/L蛋白胨和5g/L酵母浸膏组成，pH5. 0),摇勻后,放入震荡摇床上，30°C下以180r/min转速动态连续培养5天，取出动态培养的木醋杆菌发酵液，在 8000r/min转速下高速离心lOmin，分离上清与沉淀，沉淀放入G3玻沙漏斗中于105°C烘箱中烘绝干重，称量得到不溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。上清用的95%乙醇以四倍体积进行沉淀，用G3玻沙漏斗抽滤，得到的沉淀放入105°C烘箱中烘绝干重，称重，计算可溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。图2显示添加适量玻璃珠可促进BC产量，其效果随添加量的不同而不同。可溶性细菌纤维素随着添加大玻璃珠的量的增加而降低。当大玻璃珠添加量为IOg时，对BC产量有提高，此时可溶性细菌纤维素的产量为2. 80g/L，相比于对照的2. 24g/L，产量提高了 24.8%,大玻璃珠添加量为20g和30g时，不利于可溶性BC的生长，此时BC产量为I. 92g/L 和I. 76g/L，比对照分别降低了 14. 5%和21. 2%。对于小玻璃珠来说，添加量越大，可溶性细菌纤维素的产量就越高，但是，在添加量为IOg小玻璃珠时，其对细菌纤维素的产量提高并不明显，细菌纤维素产量为2. 03g,比对照降低了 9. 2%，而添加量为20g和30g时，其产量分别是2. 93g/L和3. 03g/L，产量分别提高了 30. 8%和35. I %。添加小玻璃珠对可溶性细菌纤维素产量提高的效果比大玻璃珠的效果明显。对于不溶性沉淀，添加大玻璃珠和小玻璃珠对BC产量都有明显提高，特别是大玻璃珠，在添加量为20g时，产量为13. 52g/L对比对照产量提高了 287%，小玻璃珠在20g时细菌纤维素产量最高，此时产量为9. 07g/L,提高了 160%。分别加入IOg和20g的两种规格的玻璃珠都能提高细菌纤维素总产量，分别加 A IOg和20g的大玻璃珠时，产量为11. 41g/L和15. 44g/L，相比对照的5. 73g/L，产量分别提高了 99. 0%m 169%。添加IOg和20g小玻璃珠时，产量分别为7. 40g/L和12. 00g/L,比对照提高了 29. 1%和109.4%。
添加玻璃珠对细菌纤维素的影响主要表现在添加玻璃珠在动态培养过程中能够增加发酵液内的剪切力，木醋杆菌分泌细菌纤维素时，液体内的剪切力在一定程度上阻止了细菌纤维素之间的交联和缠绕，进而使细菌纤维素往分子量更低的可溶性细菌纤维素方向生长，但是玻璃珠的量过多，发酵液内的剪切力太大会导致木粗杆菌细胞受损，抑制木醋杆菌的生长繁殖，不利于细菌纤维素的分泌，使得可溶性BC和不溶BC产量急剧降低。等量的小玻璃珠与大玻璃珠相比，相同的条件下在液体内产生的剪切力要小很多，对BC产量的影响也相对缓和。实施例3将培养I天的种子液摇匀，在无菌操作下，以6%接种量接入种至50mL的发酵培养基(培养基由50g/L甘油或葡萄糖、3g/L酵母浸膏和5g/L硫酸铵组成，pH5. 0)中，摇匀后，放入震荡摇床，30°C下以180r/min转速动态连续培养，每隔24h取样一次，测可溶性细菌纤维素及不溶性细菌纤维素的产量。连续发酵10天，取出动态培养的木醋杆菌发酵液， 在8000r/min转速下高速离心lOmin，分离上清与沉淀，沉淀放入G3玻沙漏斗中于105°C烘箱中烘绝干重，称量得到不溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。 上清用的95%乙醇以四倍体积进行沉淀，用G3玻沙漏斗抽滤，得到的沉淀放入105°C烘箱中烘绝干重，称重，计算可溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。由图3可知，动态发酵条件下，发酵液在第二天时可溶性BC产量迅速上升，到第五天时达到最大，之后达产量到平稳，第五天细菌纤维素产量为3. 81g/L，相比于之后的细菌纤维素产量3. 88g/L、3. 82g/L、3. 98g/L，质量提高不大，第十天时细菌纤维素产量为
4.28g/L，产量虽然有所上升，但是提高效率并不明显。在发酵初期，可溶BC和不溶BC的产量都迅速增加，主要原因主要是，细菌纤维素的发酵生产是一个好氧的过程，动态发酵为细菌纤维素的生产提供了良好的有氧环境，使得木醋杆菌在氧气及营养充足的情况下迅速增长繁殖，分泌大量的细菌纤维素，产量迅速增加。细菌纤维素产量达到最大值时，培养基中的营养成分几乎被消耗完全，细菌纤维素的发酵生产受到阻碍，同时细菌在发酵过程中分泌的一些代谢产物使培养基内的环境越来越不利于细菌的生长，并会使生成的细菌纤维素被部分降解，进而不溶性细菌纤维素产量下降；可溶BC产量在第五天的时候达到最大，而不溶性BC产量在第七天时产量达到最大，说明可溶性细菌纤维素与不溶性细菌纤维素的生产机制并不相同，其具体生产机制有待进一步研究。实施例4将培养I天的种子液摇匀，在无菌操作下，以6%接种量接入种子液至50mL的发酵培养基中，摇匀后，放入震荡摇床上，30°C下分别以100r/min、150r/min、180r/min、200r/ min、250r/min的转速动态发酵，连续培养5天，取出动态培养的木醋杆菌发酵液，在8000r/ min转速下高速离心lOmin，分离上清与沉淀，沉淀放入G3玻沙漏斗中于105°C烘箱中烘绝干重，称量得到不溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。上清用的 95%乙醇以四倍体积进行沉淀，用G3玻沙漏斗抽滤，得到的沉淀放入105°C烘箱中烘绝干重，称重，计算可溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。由图4 可知，在转速为 100r/min、150r/min、180r/min、200r/min 范围内，可溶性细菌纤维素产量随转速的增大而提高，此时产量为2. 03g/L、3. 32g/L、3. 37g/L、3. 49g/L、3. 5g/L。转速为250r/min时，可溶性细菌纤维素的质量不再增大。不溶性细菌纤维素方面，在转速为100r/min、150r/min、180r/min范围内纤维素产量随转速增大而提高，此时其产量分别为2. 75g/L、3. 37g/L、3. 68g/L，但到200r/min、 250r/min时，产量降低。BC总产量(3_5(c))与不溶BC的产量情况相似，在摇床转速为 180r/min 时最大，产量为 7. 05g/L，其次为 150r/min 时的 6. 69g/L，200r/min、250r/min 时， BC总产量降低。动态发酵过程中其反应器震荡产生的搅拌力影响木醋杆菌分泌合成细菌纤维素， 其转速对细菌纤维素的产量也就有着很大的影响，转速低的情况下，其剪切力比较小，转速高，剪切力较高。转速越大，剪切力越强，对可溶性细菌纤维素的形成越有利，可溶性细菌纤维素的产量就越高。但是对不溶性细菌纤维素，在一定转速范围内有利于生成细菌纤维素， 但转速过高，发酵液内分子间的剪切力过大，反而不利于不溶性细菌纤维素的产生。实施例550mL的发酵培养基中分别加入0.1 100 (w/v)的乳酸、柠檬酸、醋酸，调pH至
5.0，将培养I天的种子液摇匀，在无菌操作下，以6%接种量接入上述发酵培养基中，摇匀后，动态连续培养5天，取出动态培养的木醋杆菌发酵液，在8000r/min转速下高速离心 lOmin，分离上清与沉淀，沉淀放入G3玻沙漏斗中于105°C烘箱中烘绝干重，称量得到不溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。上清用的95%乙醇以四倍体积进行沉淀，用G3玻沙漏斗抽滤，得到的沉淀放入105°C烘箱中烘绝干重，称重，计算可溶性细菌纤维素的产量，产量表示为g/L(纤维素/培养基)。在木醋杆菌生物代谢过程中戊糖循环(HMP)和柠檬酸循环(TCA) 2条代谢途径参与了 BC的生物合成。由于糖酵解(EMP)活力缺乏或微弱，即缺乏磷酸果糖激酶或酶活力微弱，因此木醋杆菌不能在厌氧条件下代谢葡萄糖。从草酰乙酸经丙酮酸盐，由于草酰乙酸脱羧酶和丙酮酸盐激酶奇特的调节作用，木醋杆菌发生糖原异生作用。在这种条件下，一条代谢途径是由己糖磷酸盐通过异构化和磷酸化，直接合成纤维素。另一种为非直接途径，即经过戊糖循环和糖异生途径生成纤维素。在细菌产纤维素的过程中，发酵液中的有机酸既可将其作为碳源，又可作为能源物质起作用。因为纤维素的合成与细胞生长有关联，添加有机酸使之参与TCA循环，在细菌的生长早期促进代谢流从纤维素的合成转向TCA循环，产生更多的能量，加速细胞的生长，从而整体地提高了纤维素的产量。由图5可知，添加柠檬酸对可溶性细菌纤维素产量的提高有很明显的效果，其发酵生产的细菌纤维素产量能达到2. 71g/L，相比于对照的2. 08g/L，产量提高了 30. 6% ;而醋酸与乳酸降低了可溶性细菌纤维素的产量，其产量分别为1.67g/L和1.51g/L，相比对照，产量分别降低了 19. 7%和27.3%。不溶性细菌纤维素方面酸的影响则正好相反，醋酸与乳酸的对不溶性细菌纤维素的产量有所提高，其产量为6. 98g/L和6. 81g/L，相比对照的5. 35g/L，产量提高了 30. 5%和 27. 2%。而朽1檬酸降低了不容性细菌纤维素的产量,此时朽1檬酸的产量为5. 63g/L,比对照降低了 5. 3%。对于BC总产量来说，醋酸，柠檬酸和乳酸都能提高BC的产量，添加有机酸后这三者BC的产量分别为8. 65g/L，8. 35g/L和8. 32g/L，比对照的7. 43g/L产量分别提高了 36. 5%, 22. 4%，和 20. 3% 0对于醋酸促进细菌纤维素合成的原因，Kiyoshi认为细菌纤维素产量的提高不是因为培养基的PH降低而是与醋酸本身的性质有关。在细菌产纤维素的过程中，葡萄糖被降解生成高能化合物UDPG，而这种高能化合物是合成细菌纤维素的直接前体物质。如果流加的葡萄糖部分地被其它碳源如醋酸等代替，可以利用醋酸产生ATP而节约葡萄糖，这样葡萄糖转化细菌纤维素的量将增加。但当醋酸的浓度过大时，对细胞生长造成抑制而降低了细菌纤维素的产量。而乳酸的促进作用主要是因为纤维素的合成和细胞生长之间有一定联系，可通过增强细菌的生长能力来提高纤维素的合成。而一定浓度范围内的乳酸能加快木醋杆菌的细胞生长，因为乳酸在生长早期可促进代谢流从纤维素合成转向TCA循环，能量来源于从乳酸到酮戊二酸的氧化反应，加速了细胞生长，从而提高了整体的纤维素产量。总体说来，在动态发酵条件下，柠檬酸促进了可溶性细菌纤维素的生产，醋酸和乳酸促进了不溶性细菌纤维素的生产，原因是动态发酵提供的有氧环境使得木粗杆菌能够在充足的条件下充分利用醋酸和乳酸为能源物质，细菌纤维素生产反应过程中，促进了细菌纤维素的生产，可溶性细菌纤维素则是在有氧条件下充分利用了柠檬酸，具体机制有待进一步的研究。由此也可以得出，可溶性细菌纤维素的生产机制与不溶性细菌纤维素的生产机制并不相同。经醇沉淀提取的可溶性细菌纤维素可再溶于水，溶于水后粘度大于水的粘度，说明提取的可溶性细菌纤维素可以增加溶液的粘度，可作为增稠剂应用于食品工业中。
权利要求
1.一种可溶细菌纤维素的制备方法，包括以碳源和氮源组成液体培养基，将细菌纤维素生产菌株接入培养基放在摇床上或者发酵罐中动态发酵培养，在液体培养基中加入多糖、酸及玻璃珠，20 32°C下培养3-7天后取发酵液离心，得到的上清液经有机溶剂沉淀，得到可溶细菌纤维素。
2.根据权利要求I所述的一种可溶细菌纤维素的制备方法，其特征在于所述碳源为甘露醇、甘油、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或几种；所述氮源为蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏、牛肉膏、尿素、玉米浆、硫酸铵、氯化铵、硝酸钠中的一种或几种。
3.根据权利要求I所述的一种可溶细菌纤维素的制备方法，其特征在于所述碳源浓度为25-100g/L，氮源浓度为3-10g/L，液体培养基pH值为4. 5 6. O。
4.根据权利要求I所述的一种可溶细菌纤维素的制备方法，其特征在于所述细菌纤维素生产菌株为醋酸菌属、葡萄糖酸杆菌属、葡糖酸醋杆菌属、葡萄糖氧化杆菌、根瘤菌属、 八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、土壤杆菌属、洋葱假单胞菌、空肠弯曲菌、木醋杆菌或红茶菌。
5.根据权利要求I所述的一种可溶细菌纤维素的制备方法，其特征在于所述动态发酵培养的转速为50-300rpm。
6.根据权利要求I所述的一种可溶细菌纤维素的制备方法，其特征在于所述多糖为羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、可溶性淀粉、糊精、果胶、透明质酸、琼脂或肝素，与液体培养基质量体积比为O. 06g IOOml0
7.根据权利要求I所述的一种可溶细菌纤维素的制备方法，其特征在于所述酸为醋酸、乳酸、柠檬酸、盐酸、硫酸或植酸，与液体培养基质量体积比为O. Ig 100ml。
8.根据权利要求I所述的一种可溶细菌纤维素的制备方法，其特征在于所述玻璃珠直径为O.添加量为10 30g。
9.根据权利要求I所述的一种可溶细菌纤维素的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为无水乙醇、甲醇或丙酮。
全文摘要
本发明涉及一种可溶细菌纤维素的制备方法，包括以碳源和氮源组成液体培养基，将细菌纤维素生产菌株接入培养基放在摇床上或者发酵罐中动态发酵培养，在液体培养基中加入多糖、酸及玻璃珠，20～32℃下培养3-7天后取发酵液离心，得到的上清液经有机溶剂沉淀，得到可溶细菌纤维素。本发明工艺简单易行，采用动态摇床振荡培养或发酵罐培养，以不利于长链纤维素聚合的方式来提高可溶性细菌纤维素的产量，添加玻璃珠或提高搅拌速度增加剪切力提高可溶纤维素产量，以及控制发酵pH值等技术得到的可溶性细菌纤维素有一定粘度，制得的可溶细菌纤维素可作为增稠剂等应用于食品中。
文档编号C12R1/02GK102586360SQ20121003420
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者洪枫, 王华平 申请人:东华大学