专利名称：一种高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高产谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌，特别是一种能高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌及其应用。
背景技术：
微生物谷氨酰胺转胺酶(蛋白质-谷氨酸-谷氨酰胺转胺酶，Microbial Transglutaminase, EC2. 3. 2. 13简称MTG)其生物学功能是直接改变蛋白质本身以及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构与功能性质的特性，提高蛋白质的营养价值。因此，MTG在食品、纺织、生物制药等领域有着广泛的应用前景。尽管微生物MTG已实现了工业化生产，但依靠菌种筛选和过程优化的传统发酵技术获得的产量仍然较为有限，远不能满足市场对MTG日益增长的需求。随着蛋白质表达技术的迅速发展，通过分子生物学的方法构建MTG高产重组菌成为国内外研究者关注的一个热点。为进一步提高产量，日本味之素公司率先开展了 MTG重组菌构建的工作。随后，德国Martin-Luther University、台湾食品工业发展研究所、台湾国立中兴大学、中科院微生物研究所、华南理工大学及诺和诺德(中国)制药有限公司等相关研究机构或企业相继报导了重组MTG的制备策略。至此，链霉菌MTG已在大肠杆菌、酵母、链霉菌及谷氨酸棒杆菌等宿主中成功表达。由于MTG以酶源形式分泌到胞外，在胞外经活化蛋白酶活化成有活性 MTG,因此在在选择大肠杆菌，酵母为表达宿主，不能够直接得到有活性的蛋白，还需经过处理。由于MTG基因来源于链霉菌，且可以被链霉菌的胞外蛋白酶活化，因此链霉菌可以作为 MTG表达的理想宿主。
发明内容
为解决MTG产量低，成本高的问题，且基因工程菌无法分泌表达成熟酶的缺陷， 本发明提供一种能高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌，可以实现MTG的高效分泌。在前期研究中，本研究室筛选出一株新的产谷氨酰胺转胺酶的菌株(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M203062)，通过基因克隆方法，得到了 MTG基因序列及其上下游序列，含MTG自身的启动子和终止子(Genebank :EU477523)。本发明将MTG基因连接到表达载体pIJ86 (购于The John Innes center), 以 S. Iividan TK24 为表达宿主(Hopwood, D.，Bibb, Μ.，Chate, r. K.，Bruton, C.， 1985.Geneticmanipulation of Streptomyces. A laboratory manual. The John Innes Foundations，Norwich, England.)，构建了高产 MTG 的工程菌。本发明所用到的培养基YEME培养基葡萄糖10g/L、蛋白胨5g/L、麦芽提取物3g/L、酵母粉3g/L、蔗糖 340g/L、MgCl2 · 6H20 5mmoL/L、甘氛酸 5g/L ；MS 培养基甘露醇 20g/L、黄豆粉 20g/L、琼脂粉 20g/L，pH7. 2-7. 3 ；R5 培养基蔗糖 103g/L、K2SO4 0. 25g/L、MgCl2 · 6H20 10. 12g/L、葡萄糖 10g/L、Difco酪蛋白氨基酸O. lg/L、Oxoid酵母提取物5g/L、TES 5. 73g/L。称取5. 5g Difco琼脂放入500mL三角瓶中，倒入250mL上述溶液，115°C灭菌15min。使用时，将培养基融化， 每瓶中加入=KH2PO4(O. 5% )2. 5mL、CaCl2 · 2H20(5mol/l) lmL、L-脯氨酸(20% )3. 75mL、 NaOH(lmol/L)2. 5mL ；斜面培养基(g/L):葡萄糖4g/L、麦芽粉(Difco) 3g/L、酵母粉4g/L、琼脂粉20g/ L, pH 7. 0 ；S. hygroscopicus 种子培养基(SM):酵母粉 5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、 MgSO4 · 7H20 2g/L、K2HPO4 2g/L、KH2PO4 2g/L ；pH 7. 0 ；S. hygroscopicus发酵培养基(FM):酵母粉5g/L、甘油30g/L、蛋白胨20g/L、大豆粉 15g/L、K2HP044g/L、MgSO4 · 7H20 2g/L、CaC05g/L ；pH 7. 4 ；胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB) :0xoid胰胨豆汤粉(TSB) 30g/L;Ml :葡萄糖 10g/L、蛋白胨 20g/L、MgSO4 · 7H20 2g/L、K2HPO4 2g/L、酵母粉 3g/L、甘氨酸 3g/L，pH 7.2。LB 培养基胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl 10g/L, pH 7. 0 ；本发明中谷氨酰胺转胺酶活力的测定比色法测定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY为作用底物，L-谷氨酸-Y单羟胺酸做标准曲线。I个单位谷氨酰胺转胺酶酶活定义为37°C时每分钟催化形成lymol L-谷氨酸-Y单羟胺酸的酶量(U/mL)。试剂A : IOOmg 的 N a -CBZ-GLN-GLY 溶解于 2mL O. 2moL/L 的 NaOH 溶液中，加入 O. 2mol/L ρΗ6· O 的 Tris-HC 缓冲液 4mL，0. lmol/L 羟胺 2mL，0. Olmol/L 的还原型谷胱甘肽 2mL,并调节pH至6. O。试剂B 3mol/L 的 HCL, 12% TCA, 5% FeCL3 按 I : I : I 混合。配制0-4 μ mol/mL的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液。取ImL试剂A与O. 4mL 不同浓度的L-谷氨酸-Y -单异羟肟酸标准溶液混合，37°C水浴10分钟。加O. 4mL试剂B 终止反应，在525nm比色，绘制出标准曲线。以O. 4mL经适当稀释的酶液代替标准溶液，在相同条件下保温和比色，从标准曲线求出酶活。以100°C加热10分钟的离心后的上清液为空白。酶活力(u/mL) = (6. 8548XOD525-O. 0164) X 稀释倍数本发明以pIJ86为表达载体，利用TGase天然启动子、信号肽构建了 TGase表达载体pIJ86/tgl,并将它们转化表达宿主S. Iividans TK24。在较优的发酵条件下,S. Iividans TK24(pIJ86/tgl)摇瓶发酵的TGase活力可达到3. OU/mL，3L发酵罐培养最高酶活为2. 3 U/ mL。通过本发明提供的工程菌及发酵方法，实现了 MTG在S. Iividan TK24中高效率分泌性表达，适合工业化生产。
图I表达载体pIJ86/tgl构建流程2 (A) tglPCR产物和(B) pi J86/tgl酶切电泳验证(A)M :DL10000DNA 标准分子量；1 :tglPCR 片段；(B)M DL 10000 DNA 标准分子量；I S. hygroscopicus 基因组 DNA ；2 Kpn I 和 Bgl II 酶切表达质粒 pIJ86/tgl图3重组菌表达上清
I :蛋白Marker ；2 :含表达质粒pIJ86/tgl ；3 :含空质粒；4 :不含质粒图4S. Iividans TK24 (pIJ86/tgl) 3L 罐发酵优化
具体实施例方式实施例I :表达载体的构建质粒构建如图I所示，HS. hygroscopicus基因组DNA为模板，根据反向PCR 的得到的TGase上下游基因序列，设计含有Kpn I和Bgl II位点的两端引物TGF : CGGGGTACCCCGTAGCGGGTGGCGAAGAT 和 TGR GGAAGATCTCACGAGGACACCGAACGACTG 引物均由上海生工生物工程公司合成。将上述PCR片段胶回收，经Kpn I和Bgl II酶切后，回收的目的片段，再与经过同样酶切处理后的PIJ86片段，用连接酶solution I连接过夜，连接产物转化E. coli JM109。得到的转化子经菌落PCR验证后，挑选阳性克隆接种到液体LB，培养 10-12h，提取质粒，并采用酶切电泳和测序鉴定(图2)。最终得到含有正确序列的表达载体 pIJ86/tgl。 实施例2 :重组MTG工程菌的构建将构建好的pIJ86/tgl转化链霉菌原生质体,具体步骤如下(I)在250mL三角瓶中加入50mL的YEME，接种100 μ L的孢子悬液，于30°C摇床中培养36 40h。(2)将培养物倒入离心管中，3500r/min离心lOmin。(3)弃上清，将菌丝体悬浮于15mL的10. 3 %的鹿糖溶液中，3500r/min离心 IOmin,弃上清。同此法洗两次。(4)取ImL菌丝体，加入4mL的溶菌酶溶液(溶菌酶母液为50mg/mL P Buffer,终浓度为2mg/mL,用P Buffer稀释),于30°C水浴30 60min (间隔5min轻轻摇动)至上清
呈乳状。(5)加入5mL的PBuffer并用5mL的吸管吹吸几次,继续温浴lOmin。(6)用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入无菌干净的离心管中，3500r/min离心 7min,原生质体沉淀呈黄色。(7)弃上清，轻柔打散原生质体，用PBuffer洗两次(洗去溶菌酶)。每次仍使用 3500r/min 离心 7min。(8)弃上清，用枪头将原生质体打散，分装，于_70°C保存。(9)将最多5 μ L的DNA (质粒或酶连产物)加于已经装有50 μ L原生质体的离心管(I. 5mL)的管壁上(不与原生质体接触)。(10)吸取200 μ L的25% PEG4000，将DNA冲入原生质体中，小心抽吸几次，混匀。(11)将混合物涂布于R5平板上(不含任何抗生素)。(12)30°C培养14 20h后，用含有适当抗生素的ImL无菌水溶液覆盖。(13)再培养I 2d后，即可看到小的转化子菌落长出。实施例3 :重组MTG工程菌的发酵优化种子培养接一铲生长良好的斜面培养物(也可以直接接种孢子悬液)至装有 IOOmL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇瓶转速为200r/min，温度30°C，培养时间24h。摇瓶培养将培养好的种子按8%的接种量接入发酵瓶中，培养温度30°C，摇瓶转速200r/min，500mL三角瓶装液量为50mL，培养时间42_72h。3L NBS发酵罐培养装液量I. 5L，接种量400mL，搅拌550r/min，通气2. Ovvm,温度 30。。。各培养基使用前添加阿泊拉霉素至终浓度为50yg/mL。将表达载体pIJ86/tgl转化至S. Iividans TK24,经过抗性平板筛选和质粒酶切验证，得到正确的重组菌S. Iividans TK24 (piJ86/tgl)，通过SDS-PAGE电泳(图3)可以检测到重组MTG条带，且最高酶活可达3U/ml。为进一步考察S. Iividans TK24(pIJ86/tgl)的工业化前景，在3L发酵罐上验证了重组菌的TGase生产能力。不控制环境pH的情况下，重组菌细胞干重在36h达到最大 (17. 6g/L)，甘油在60h时即全部消耗，TGase产量在42h到达最大值，I. 60U/mL。值得注意的是，在整个发酵过程中PH有明显波动，先下降后升高，在发酵后期升高至pH 8. 5 ;为了考察环境pH对TGase表达的影响，在发酵过程恒定pH 7.5。实验结果如图2_10所示，重组菌细胞干重显著提高，可以到达22. 7g/L，比不控制环境pH的条件下提高了 28. 9%;甘油在 60h被消耗完全，在发酵36h时TGase产量达到最值(2. 3U/mL)，较不控制不控制环境pH时提前 6h，TGase 产量提高 43. 75%。由此可见，pH 对 S. Iividans TK24 (pIJ86/tgl)生产重组TGase有重要影响(图4)。
权利要求
1.一种高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌(streptomyces Iividan),其特征在于细胞内含有高效表达MTG基因的载体pIJ86/tgl，MTG基因如Genebank EU477523所示。
2.构建权利要求I所述变铅青链霉菌的方法，其特征在于包括如下步骤通过基因克隆得到菌株吸水链霉菌CCTCC No. M203062谷氨酰胺转胺酶编码基因序列及其上下游序列； 将得到的tgl基因克隆到表达载体pIJ86转化变铅青链霉菌TK24原生质体，构建高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌。
3.应用权利要求I所述变铅青链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的方法，其特征在于步骤如下将培养好的变铅青链霉菌种子液按8%的接种量接入发酵培养基，培养温度30°C， 摇瓶转速200r/min，500mL三角瓶装液量为50mL，培养时间42_72h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于变铅青链霉菌种子液的制备方法为接种一铲生长良好的斜面培养物或直接接种孢子悬液至装有IOOmL种子培养基的500mL三角瓶中培养，摇瓶转速为200r/min，温度30°C，培养时间24h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于发酵培养基配方为酵母粉5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、大豆粉 15g/L、K2HPO4 4g/L、MgSO4 · 7H20 2g/L、CaCO3 5g/L ；pH 7. 4， 使用前添加阿泊拉霉素至终浓度为50 μ g/mL。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于种子培养基配方为酵母粉5g/L、甘油 30g/L、蛋白胨 20g/L、MgS04 · 7H20 2g/L、K2HP04 2g/L、KH2P04 2g/L ；pH 7.0，使用前添加阿泊拉霉素至终浓度为50 μ g/mL。
全文摘要
本发明公开了一种高效分泌谷氨酰胺转胺酶的变铅青链霉菌(Streptomyces lividan)，其细胞内含有高效表达MTG基因的载体pIJ86/tg1，MTG基因如GenebankEU477523所示，通过发酵优化本发明以pIJ86为表达载体，利用TGase天然启动子、信号肽构建了TGase表达载体pIJ86/tg1，并将它们转化表达宿主S.lividans TK24。在较优的发酵条件下，S.lividansTK24(pIJ86/tg1)摇瓶发酵的TGase活力可达到3.0U/mL，3L发酵罐培养最高酶活为2.3 U/mL。通过本发明提供的工程菌及发酵方法，实现了MTG在S.lividan TK24中高效率分泌性表达，适合工业化生产。
文档编号C12N9/10GK102586164SQ201210034340
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者刘松, 堵国成, 张东旭, 杨怡敏, 陈坚, 陈康康, 马建龙 申请人:江南大学