专利名称：一种神经干细胞培养瓶的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种用于神经干细胞培养的容器。
背景技术：
神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎或成体脑、脊髓等组织中的一种干细胞，是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。目前的科学技术已经可以在体外培养扩增神经干细胞，用于生命科学研究、药物筛选测试、临床应用研究等领域。神经干细胞在体外培养过程中大多呈悬浮状态不贴壁，并有形成神经球 (Neurosphere)的特性。神经球是神经干细胞聚集起来形成的球状物，根据生长进程的不同直径在几十微米至几百微米不等。神经球的细胞组成与许多因素有关，主要包括供体动物的年龄、细胞接种的密度、培养技术条件、细胞传代数等。神经球的形成有利于增强细胞之间的相互作用， 从而加快神经干细胞的增殖速度。目前市售的细胞培养瓶大多为聚苯乙烯材质(Polystyrene，PS)，虽然吸附较低， 但是对神经干细胞仍有一定的吸附性，培养神经干细胞需要购买经过专门处理的超低吸附表面的细胞培养瓶(一般是高分子水凝胶表面)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的细胞培养瓶，具有由蛋白质构成的超低吸附表面附着层，不仅能阻止神经干细胞贴壁，还能为神经干细胞的生长提供营养物质。本发明的技术方案如下一种神经干细胞培养瓶，由高分子聚合物构成的瓶身( 和瓶盖(1)组成，在所述瓶身内壁的细胞接触面上还附有一层透明的白蛋白包被层(3)，白蛋白包被层以物理吸附或共价交联的方式附着在容器内壁上。上述神经干细胞培养瓶在用于培养人类神经干细胞时，所述的白蛋白包被层优选使用人血白蛋白包被。上述神经干细胞培养瓶的瓶盖和瓶身的基本材质可使用任何具有一定机械强度并对细胞无毒害的高分子材质，其中瓶身还需具有良好的透明度以便于观察培养中的神经干细胞，优选使用聚苯乙烯材质。白蛋白(又称清蛋白，Albumin)属于球蛋白，是血浆中含量最多的蛋白质，具有维持血浆胶体渗透压、血浆物质载运、保护血细胞、提供营养、结合重金属离子和毒素等功能， 在生物学实验中常添加于细胞培养液中。此外因其能够与免疫反应板上的蛋白结合位点结合，也常在免疫实验中用作封闭液，以阻止后续操作步骤中的抗原或抗体与反应板结合。人血白蛋白(Human Albumin)是人体产生的白蛋白，可从健康人的血液中提取，能CN 102533550 A够直接静脉注射到病人体内，主要用于失血创伤、烧伤引起的休克，脑水肿及损伤引起的颅压升高，肝硬化及肾病引起的水肿或腹水，癌症术后恢复等方面的治疗，是一种临床药品， 国内多家生物医药企业有生产销售。本发明中的白蛋白包被层可以通过物理吸附或化学交联等多种方式附着在神经干细胞培养瓶的内壁上。本发明的有益效果是，通过在神经干细胞培养瓶内壁表面添加一层白蛋白包被层减少了神经干细胞在培养瓶内壁的吸附，有利于神经球的形成，并能为神经干细胞的生长提供营养物质，从而加快神经干细胞的生长增殖速度，同时成本又低于进口的超低吸附细胞培养瓶。
图1 本发明一个实施例的纵切面。图2 本发明另一个实施例的纵切面。图3 本发明与进口超低吸附细胞培养瓶使用效果对比试验的结果。
具体实施例方式本发明可以通过以下手段制造或实现(1)使用模具和高分子聚合物材料如聚苯乙烯制作瓶身和瓶盖成所需形状；(2)将用DPBS配制的白蛋白溶液灌入瓶内，在37°C 的温箱中过夜使白蛋白充分附着在内壁上以形成包被层；C3)用超纯水洗涤、晾干。本发明的一种使用方法如下(1)将神经干细胞悬液以1X10~5细胞/ml的密度接种到神经干细胞培养瓶，培养液成分为含有B27添加液、N2添加液以及EGF、bFGF、LIF 等生长因子的DMEM/F12细胞培养液(培养液各组分均可购自美国hvitrogen公司)；O) 放入CO2细胞培养箱中37°C培养；(3)监测神经球的生长情况，长到一定体积后将神经球挑出，酶消化、传代。实施例一种神经干细胞培养瓶(图1)，由聚苯乙烯构成的瓶身( 和瓶盖(1)组成，在所述瓶身内壁的细胞接触面上附有一层透明的人血白蛋白包被层(3)，人血白蛋白包被层以物理吸附的方式附着在容器内壁上。本实施例的制造方法如下(1)使用模具和高分子聚合物材料聚苯乙烯制作瓶身和瓶盖成如图1所示的形状；(2)将用DPBS配制的人血白蛋白溶液灌入瓶内，在37°C 的温箱中过夜使人血白蛋白充分附着在内壁上以形成包被层，然后用超纯水洗涤、晾干。比较例本发明和一般的海外进口超低吸附培养容器同条件培养的神经干细胞培养后的增值倍数比较按照前述的使用方法，在神经干细胞P3至P7代有明显增殖情况的代次中，应用本发明培养的神经干细胞增值率明显高于一般的海外进口经特殊处理的低吸附培养容器 (数据结果见图幻，并且经检测每代细胞都保持了细胞干性(检测方法免疫细胞化学方法检测神经干细胞标志物巢蛋白nestin的表达)，说明本发明可促进神经干细胞所需营养底物能量的供给，提高增值率，其制作成本也明显低于一般的海外进口经特殊处理的低吸附培养容器。
权利要求
1.一种神经干细胞培养瓶，由高分子聚合物构成的瓶身( 和瓶盖(1)组成，其特征在于在所述瓶身内壁的细胞接触面上还附有一层透明的白蛋白包被层(3)，白蛋白包被层以物理吸附或共价交联的方式附着在容器内壁上。
2.权利要求1所述的一种神经干细胞培养容器，其特征在于，所述的白蛋白包被层(3) 为人血白蛋白包被层。
全文摘要
本发明公开了一种神经干细胞培养瓶，涉及细胞生物学领域。本发明在神经干细胞培养瓶的内壁添加了一层白蛋白包被层，特别是使用人血白蛋白包被，能够大大减少神经干细胞在内壁的残留，降低储存过程中的损耗，延长神经干细胞在4℃储存时间，提高神经干细胞储存效果。
文档编号C12M3/00GK102533550SQ201210034620
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者杨立敏, 郑佳威, 金宜强, 黄倩莹 申请人:上海安集协康生物技术有限公司