一种用于诊断和预示乳腺癌的生物标志物和检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤诊断领域，具体涉及乳腺癌检测诊断标志物和生物检测试剂盒， 用于辅助诊断和预示乳腺癌。
【背景技术】
[0002] 2012年，Cell Research杂志在线发表了中国科学院健康科学研究所胡国宏研究 组与上海交通大学Med-X中心徐学敏、胡晓芳研究组合作的最新研究成果Differential secretome analysis reveals CST6as a suppressor of breast cancer bone metastasis。该研究成果掲示了CST6在乳腺癌骨转移中发挥重要作用。
[0003] 乳腺癌是对女性健康构成最大威胁的一种恶性疾病，涉及多种基因异常，包括癌 基因的激活、抑癌基因的失活等，其发展是一个多因素多阶段的过程。转移不仅是恶性肿瘤 最重要的生物学特征之一，更是影响乳腺癌患者治疗效果和导致死亡的主要原因，骨是乳 腺癌最常见的远处转移部位之一。分泌蛋白质组学不仅可以筛查参与乳腺癌发生和转移的 相关分子，也可以为临床早期诊断和预测转移预后提供有效的生物标志物。该项研究利用 来源于乳腺癌MDA-MB-231不同转移能力的各种亚系SCPs细胞，通过分泌蛋白质组学检测， 结果得到128种差异蛋白。其中调节酶活性的蛋白中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂（cystatins) 家族可能参与了乳腺癌细胞不同倾向转移能力的调控。结合全基因组表达芯片结果和甲 基化芯片结果分析，认为cystatins家族成员CST6可能在乳腺癌骨转移中起重要的调节 作用。该研究在低骨转移的SCP4构建shRNA后knock-downCST6,结果证明促进细胞生长 增殖、克隆形成、侵袭和迀移。相反，高骨转移能力的SCP2过表达CST6,结果证明发挥抑制 作用。此外，不同条件培养液中CST6蛋白水平的改变也可以影响细胞的侵袭和迀移，说明 CST6是通过癌细胞的分泌作用从而发挥抑制肿瘤转移的作用。体内动物实验进一步证明 CST6在乳腺癌骨转移中发挥了重要的作用。
[0004] 迄今尚未见半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中Cystatin SN和Cystatin S与乳腺癌 相关的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一目的在于提供Cystatin SNmRNA和Cystatin SmRNA在诊断和预 示乳腺癌方面的联合应用，通过Cystatin SNmRNA和Cystatin SmRNA联合检测，提高诊 断和预示乳腺癌的特异性；本发明的第二目的在于提供Cystatin SNmRNA和Cystatin S mRNA联合检测试剂盒，该试剂盒具有特异性高、灵敏度高和使用方便等优点。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0007] -种诊断和预示乳腺癌的试剂，该试剂中含有能够用于检测标志物Cystatin SN mRNA和Cystatin SmRNA浓度的试剂；所述Cystatin SNmRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述Cystatin SmRNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
[0008] 进一步地，所述诊断和预示具体为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0009] 上述试剂在诊断和预示乳腺癌方面的应用，用该试剂检测出标志物CystatinSN mRNA和CystatinSmRNA的浓度后，联合CystatinSNmRNA和CystatinSmRNA的浓度对 乳腺癌进行诊断和预示，联合公式为： " cxpi-2.332 +Ο.ΟΟΒ?/ + 0.014?:>)
[0010] ρ=----* i+cxp(-2.332 + 0.0086- + 0.0i4b)
[0011] 其中，a=CystatinSNmRNA浓度，b=CystatinSmRNA浓度。
[0012] 进一步地，所述诊断和预示具体为诊断、疗效评估或转移复发监控。
[0013] -种诊断和预示乳腺癌的试剂盒，包含CystatinSNmRNA定量检测试剂和 CystatinSmRNA定量检测试剂；所述CystatinSNmRNA定量检测试剂包括如SEQIDN0. 7 和SEQIDNO. 8所示的检测引物和核苷酸序列如SEQIDNO. 20所示的TaqMAN探针；所述 CystatinSmRNA定量检测试剂包括如SEQIDNO. 9和SEQIDNO. 10所示的检测引物和核 苷酸序列如SEQIDNO. 22所示的TaqMAN探针。
[0014] 进一步地，所述试剂盒还包括RPN1mRNA定量检测试剂，RPN1mRNA的核苷酸序列 如SEQIDN0. 3所示；所述RPN1mRNA定量检测试剂包括如SEQIDN0. 11和SEQIDN0. 12 所示的检测引物和核苷酸序列如SEQIDNO. 24所示的TaqMAN探针。
[0015] 进一步地，所述试剂盒还包括特异捕获CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和 RPN1mRNA的磁珠，所述特异捕获CystatinSNmRNA的磁珠上结合有SEQIDNO. 4所示探 针，所述特异捕获CystatinSmRNA的磁珠上结合有SEQIDNO. 5所示探针，所述特异捕获 RPN1mRNA的磁珠上结合有SEQIDN0. 6所示探针。
[0016] 进一步地，所述试剂盒还包括 10XBuffer、dNTP、MgCl2、DMS0、DTT、Taq酶、UDG、逆 转录酶和RNA酶抑制剂。
【附图说明】
[0017] 图1 :特异性探针和非特异性探针富集CystatinSNmRNA比较结果；
[0018] 图2 :特异性探针和非特异性探针富集CystatinSmRNA比较结果；
[0019] 图3 :特异性探针和非特异性探针富集RPN1mRNA比较结果；
[0020] 图4 :乳腺癌组织与癌旁组织中CystatinSNmRNA浓度的比值结果图（C/T表示 乳腺癌组织/癌旁组织）；
[0021] 图5 :乳腺癌组织与癌旁组织中CystatinSmRNA浓度的比值结果图（C/T表示乳 腺癌组织/癌旁组织）。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以 对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实 施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版， J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0023] 实施例1 :磁珠法特异性富集尿液中CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1 mRNA
[0024] 根据CystatinSN、CystatinS和RPN1 (核糖体结合蛋白1)的mRNA序列设计捕获 CystatinSNmRNA、CystatinSmRNA和RPN1mRNA的特异探针（CystatinSNmRNA的核苷 酸序列如SEQIDNO. 1，CystatinSmRNA的核苷酸序列如SEQIDNO. 2,RPN1mRNA的核苷 酸序列如SEQIDNO. 3):捕获CystatinSNmRNA的探针为 5'-aaagagcacaactgtttcttctg ca(dA)30-3'（SEQIDN0·4)，捕获CystatinSmRNA的探针为5'-taccaggtctattagaagca( dA)30-3'（SEQIDNO. 5)，捕获内参基因RPN1mRNA的探针为 5'-gatgagcttctcattctcaatg tacg(dA)30-3'（SEQIDNO. 6)。上述特异探针能够与磁珠（GE，货号为 3815-2103-010150) 的olig(dT)互补结合，得结合特异探针的磁珠。
[0025] 富集步骤如下：将新鲜尿液与样本运输保存液按照体积比为2 :1的比例混合，得 处理后的尿液样本，该处理后的尿液样本4°C条件下可保存一周，_20°C条件下可保存1年； 然后分别将200μL含有磁珠的靶序列捕获液加入到200μL处理后的尿液中，于75°C条件 下处理5分钟；涡旋混匀后，室温静置15分钟；然后将样品置于磁性分离器上，5分钟后， 吸弃上清，加入lmL漂洗液，涡旋混匀，上磁性分离器，5分钟后，吸弃上清；最后室温（18~ 25°C)静置5分钟，加入洗脱液20μL，枪头吹打混匀，上磁力架5分钟，将上清转至新的EP 管中。
[0026] 富集过程中，样品运输保存液中各组分浓度如下LiDS(十二烷基硫酸 锂），10mMNaH2P04,10mMNa2HP04,5mMEDTA，7mMEGTA，ρΗ7· 5 ;靶序列捕获液中各组分浓度 如下：135mMHEPES，1.25MLiCl，110mMLi0H，10mMEDTA，卩!17.0,50(^8/11^磁珠，2 4]\1捕 获探针；漂洗液中各组分浓度如下：100mMHEPES，350mMNaCl，10mMNa0H，2mMEDTA，3% 乙醇，0. 2%羟基甲酯，0. 1%羟基丙酯，0. 1%SDS，pH7. 5 ;洗脱液中各组分浓度如下：20mM Tris-HCl，ρΗ7·5,ImMEDTA。
[0027] 同时以非特异性探针oligo(dT)以上述相同的方法非特异性富集mRNA。
[0028] 将上述富集获得的mRNA通过定量PCR分别检测CystatinSNmRNA、CystatinS mRNA和RPN1mRNA的相对含量，检测所使用的引物如下：
[0029]CystatinSNmRNA检测引物：上游引物：5' -agagccaggcaacagacc-3'（SEQID NO. 7)
[0030]下游引物：5' -gttcatggaaggcacagg-3'（SEQIDΝ0·8