。然而，在一些发育调节型调节区可以优先地在某些器官或组 织内、在特定的发育阶段活化，它们也可以发育调节的方式活化或在植物中的其他器官或 组织中处于基础水平。组织特异型调节区的实例，例如种子特异型调节区，包括油菜籽蛋 白启动子，和十字花科植物启动子（Rask et al.，1998, J.Plant Physiol. 152:595-599; Bilodeau et al.，1994, Plant Cell 14:125-130)。叶子特异型启动子的实例包括质体蓝 素启动子（见美国7, 125, 978号，通常引用将其并入本文）。
[0107] 诱导型调节区为能响应于诱导物而直接地或间接地激活一种或多种DNA序列或 基因的转录的调节区。在诱导物不存在时，DNA序列或基因不会发生转录。通常，与诱导 型调节区特异地结合从而激活转录的蛋白因子可以以失活形式存在，然后由诱导物直接 地或间接地转换为活性形式。然而，蛋白因子也可不存在。诱导物可以为化学剂，诸如蛋 白、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过热、冷、盐、或有毒元素直接赋予或通 过病原体或致病剂（诸如病毒）的作用间接赋予的生理应激。通过向细胞或植物外部施 加（诸如通过喷洒、浇水、加热或相似的方法）诱导物，包含诱导型调节区的植物细胞可 暴露于诱导物。诱导型调节元件可来源于植物或非植物基因（例如Gatz，C.和Lenk，LR. P.，1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358;通过引用将其并入本文）。可能的诱导型启动 子的实例包括但不限于，四环素诱导型启动子（6&丨2，(：.，1997,41111.1^￥.?131^?1178；[01. Plant Mol. Biol. 48, 89-108;通过引用将其并入本文），类固醇诱导型启动子（Aoyama. T. and Chua，N.H.，1997, Plant 1.2, 397-404;在此通过引用将其并入本文）和乙醇诱 导型启动子（Salter, M.G et al.，1998, Plant lOurnal 16，127-132;Caddick，M.X et al.，1998, Nature Biotech. 16, 177-180,通过引用将其并入本文）、细胞分裂素诱导型IB6 和 CKI 1 基因（Brandstatter，I and K. ieber，1. 1.，1998，Plant Cell 10, 1009-1019 ; Kakimoto, T.，1996, Science 274, 982-985 ;通过引用并入本文）和植物生长素诱导型元件 DR5(Ulmasov，T et al.，1997, Plant Cell 9, 1963-1971;通过引用将其并入本文）。
[0108] 组成型调节区在植物的各个部分并且贯穿植物发育连续地指导基因表 达。已知的组成型调节元件的实例包括CaMV 35S转录物相关的启动子（Odell et al.，1985，Nature, 313:810-812)，水稻肌动蛋白 l(Zhang et al.，1991，Plant Cell, 3:1155-1165)，肌动蛋白 2(An et al.，1996, Plant J.，10:107-121)，或 tms 2(美 国5,428，147号，通过引用将其并入本文），磷酸丙糖异构酶1(乂11的&1.，1994，？1 &拉 Physiol. 106:459-467)基因，玉米泛素 1 基因（Cornejo et al.，1993,Plant Mol. BioI.29:637-646)，拟南芥泛素 1 和 6 基因〇1〇1如"6七31.，1995，？13拉]?〇1. Biol. 29:637-646)，烟草翻译起始因子 4A 基因（Mandel et al.，1995, Plant Mol. Biol.29:995-1004)。
[0109] 本文所用的术语〃组成型〃不是必然指基因在组成型调节区控制下在所有细胞类 型中以相同水平表达，而是指基因在多种细胞类型中表达，虽然经常观察到丰度的改变。组 成型调节元件可与其他序列连接，从而进一步地增强与它们可操作地连接的核苷酸序列的 转录和/或翻译。例如，CPMV-HT系统来源于豇豆花叶病毒（CPMV)的非翻译区，并且展示了 相关编码序列增强的翻译。〃天然〃意指核酸或氨基酸序列为天然存在的，或〃野生型"。 〃可操作地连接〃意指具体序列（例如调节元件和感兴趣的编码区）直接地或间接地相互 作用从而实现预期的功能，诸如基因表达的介导或调节。例如，可操作地连接的序列的相互 作用可以通过与可操作地连接的序列相互作用的蛋白所介导。
[0110] 例如，通过使用调节元件、扩增元件和/或增强子，可进一步地改变多蛋白与蛋白 酶的比率。例如，第一核酸可包含调节元件、扩增元件和/或增强子。第二核酸可以包含或 可以不包含相同组合的调节元件、扩增元件和/或增强子。
[0111] 例如，不同的启动子可用于驱动多蛋白与蛋白酶之间的体内差异表达。例如，第一 集合或组合的调节元件可包括诱导型启动子，而第二集合或组合的调节元件中的启动子可 为组成型的，或第二集合或组合的调节元件可包含诱导型启动子，而第一集合或组合的调 节元件中的启动子可为组成型的。第一和第二集合或组合的调节元件之间的启动子强度也 可以是不同的，从而实现多蛋白与蛋白酶之间的体内差异表达。
[0112] 以下实施例中进一步地展示了本发明。
[0113] 实施例1表达EV71
[0114] 基因合成
[0115] 使用编码EV71结构蛋白P1和蛋白酶3CD的DNA区段。GenBank中P1和3CD的候 选序列是可利用的。这些序列的非限制性实例为：
[0116] 对P1氨基酸序列而言：氨基酸序列GenBank登录号ADG57603(氨基酸1-862) (SEQ ID N0:5);核苷酸序列：GenBank 登录号 GQ279369(核苷酸 743-3328) (SEQ ID N0:6);
[0117] 对3CD(HK08株）而言：氨基酸序列：GenBank登录号ADG57603(氨基酸 1549-2193) (SEQ ID N0:1);核苷酸序列：GenBank 登录号 GQ279369(核苷酸 5386-7321) (SEQ ID NO:2)；
[0118] 对3CD (GDFS08株）而言：氨基酸序列GenBank登录号ACI25378 (氨基酸 1549-2193) (SEQ ID N0:3);核苷酸序列：GenBank 登录号 FJ194964(核苷酸 5387-7321) (SEQ ID N0:4)〇
[0119] 合成两个P1基因。使用野生型序列产生第一个，而第二个是基于使用本领域中已 知的标准方法确定的优化序列（人密码子利用）。基于野生型序列合成两个3CD基因。通 过Invitrogen?(以前GeneArt?])合成3个野生型基因，并且通过DNA2. 0优化和合成优 化P1基因。
[0120] 分子克隆
[0121] 合成的基因被克隆到植物表达载体中。选择的载体组分包括来自于基于豇豆花叶 病毒（CPMV)的盒或苜蓿质体蓝素基因的转录和翻译调节元件。在我们的平台上已经成功 地使用两种调节元件获得了重组蛋白的高表达。另一元件为来自于大豆黄萎病双生病毒 (BeYDV)的DNA扩增元件，其可以整合到我们的植物表达载体。它已经对于一些候选者引起 蛋白表达的极大增加。因此，在用或不用DNA扩增元件的情况下，我们每个基因构建体克隆 在表达载体中。表1呈现了为这个项目配置的植物表达盒。
[0122]
【主权项】
1. 在植物中产生小核糖核酸病毒样颗粒（PVLP)的方法，包括： a) 将第一核酸引入所述植物、所述植物的部分或植物细胞，所述第一核酸包含在所述 植物中有活性的第一调节区，所述第一调节区与编码一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白的 核苷酸序列可操作地连接； b) 将第二核酸引入所述植物、所述植物的部分或植物细胞，所述第二核酸包含在所述 植物中有活性的第二调节区，所述第二调节区与编码一种或多种蛋白酶的第二核苷酸序列 可操作地连接； c) 在允许第一和第二核酸表达的条件下培养所述植物、所述植物的部分或植物细胞， 从而产生PVLP。
2. 如权利要求1中所述的方法，其中第一核酸相对于第二核酸的引入量的比为20:1至 0. 5:1 〇
3. 如权利要求1中所述的方法，其中所述一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白为P1。
4. 如权利要求1中所述的方法，其中所述一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白包含结构 蛋白VP0、VP1、VP2、VP3、VP4或它们的组合。
5. 如权利要求1中所述的方法，其中所述小核糖核酸病毒选自口蹄疫病毒 (Aphthovirus)、禽肝炎病毒（Avihepatovirus)、心脏病毒（Cardiovirus)、肠病毒 (Enterovirus)、马鼻病毒（Erbovirus)、肝病毒（Hepatovirus)、嵴病毒（Kobuvirus)、副肠 孤病毒（Parechovirus)、萨佩洛病毒（Sapelovirus)、塞尼卡病毒（Senecavirus)、捷申病 毒（Teschovirus)和震颜病毒（Tremovirus)。
6. 如权利要求1中所述的方法，其中所述小核糖核酸病毒为肠病毒71或脊髓灰质炎病 毒。
7. 如权利要求1中所述的方法，其中所述蛋白酶为小核糖核酸病毒蛋白酶。
8. 如权利要求7中所述的方法，其中所述蛋白酶为3CD蛋白酶。
9. 如权利要求1中所述的方法，其中在引入步骤（步骤a)中，所述核酸在所述植物中 瞬时表达。
10. 如权利要求1中所述的方法，其中在引入步骤（步骤a)中，所述核酸在所述植物中 稳定表达。
11. 如权利要求1中所述的方法，还包括收获所述植物和纯化PVLP的步骤。
12. 在植物、植物的部分或植物细胞中产生小核糖核酸病毒样颗粒（PVLP)的方法，包 括： a) 提供植物、植物的部分或植物细胞，所述植物、植物的部分或植物细胞包含第一核酸 和第二核酸，所述第一核酸包含在所述植物中有活性的第一调节区，所述第一调节区与编 码一种或多种小核糖核酸病毒多蛋白的第一核苷酸序列可操作地连接，所述第二核酸包含 在所述植物中有活性的第二调节区，所述第二调节区与编码一种或多种蛋白酶的第二核苷 酸序列可操作地连接； b) 在允许所述核酸表达的条件下，培养所述植物、植物的部分或植物细胞，从而产生 PVLP0
13. 权利要求12中所述的方法，还包括收获所述植物和纯化PVLP的步骤。
14. 通过权利要求1中所述的方法产生的PVLP。
15. 组合物，其包含用于诱导个体中免疫应答的治疗有效量的权利要求14中所述的 PVLP和药学上可接受的载体。
16. 诱导个体中对小核糖核酸病毒感染的免疫力的方法，包括给予权利要求14中所述 的 PVLP0
17. 如权利要求16中所述的方法，其中通过口服、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或 皮下的方式将PVLP给予个体。
18. 利用权利要求14中所述的PVLP制备的多克隆抗体。
19. 如权利要求1或12中所述的方法，其中所述第一核酸序列包含与一种或多种豇豆 花叶病毒（comovirus)增强子、编码所述多蛋白的核苷酸序列和一种或多种扩增元件可操 作地连接的第一调节区，并且编码复制酶的第三核酸被引入所述植物或植物的部分。
20. 如权利要求1或12中所述的方法，其中所述第二核酸不包含一种或多种扩增元件 或一种或多种5工豆花叶病毒增强子。
【专利摘要】提供了在植物中产生小核糖核酸病毒样颗粒(PVLP)的方法。该方法包括将第一核酸和第二核酸引入植物、植物的部分或植物细胞。第一核酸包含植物中有活性的第一调节区，第一调节区与编码picornavims多肽的核苷酸序列可操作地连接。第二核酸包含植物中有活性的第二调节区，第二调节区与编码一种或多种picornavims蛋白酶的核苷酸序列可操作地连接。在允许核酸表达的条件下培养植物、植物的部分或植物细胞，从而产生PVLP。也提供了包含多肽的PVLP。
【IPC分类】C07K16-10, C12N15-41, A01H5-00, C07K14-085, C12N7-01, C12N15-82, C12N7-04
【公开号】CN104755614
【申请号】CN201380055096
【发明人】马克-安德烈·蒂奥斯特, 皮埃尔-奥利维耶·拉瓦伊, 曼侬·库特里, 露西·鲍林, 路易斯-菲利普·维泽纳
【申请人】莫迪卡戈公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年8月29日
【公告号】CA2884073A1, EP2893007A1, US20150225462, WO2014036645A1