瞬时过表达编码药物转运蛋白和/或药物代谢酶的基因的可消耗的低温保存的细胞的制作方法
【专利说明】瞬时过表达编码药物转运蛋白和/或药物代谢酶的基因的 可消耗的低温保存的细胞 发明领域
[0001] 本发明涉及低温保存的重组细胞，所述重组细胞瞬时过表达一种或多种编码药物 转运蛋白和/或药物代谢酶的基因以使得所编码的蛋白的活性在从低温保存中解冻后的 所述细胞群体中是可检测的。
[0002] 发明背景
[0003] 药物开发是昂贵且耗时的尝试，其中药物候选物在获得销售其的监管许可之前必 须满足由政府部门例如美国食品和药物管理局和欧洲药品管理局制定的一定标准。重要 地，进行了测定来筛选药物候选物以确定是否某些是一种或多种药物转运蛋白和/或药物 代谢酶的底物或抑制剂，因为其可对这样的药物的吸收、分布、代谢和消除、它们的毒性以 及药物间相互作用具有显著的作用。
[0004] 虽然稳定表达编码药物转运蛋白或药物代谢酶的基因的细胞系可用于这样的筛 选，但产生和维持其冷冻储备物需要大量的时间和资源。并且，所表达的重组蛋白的水平通 常是可变的（实验室与实验室之间）并且可在这些细胞的传代下随时间过去而降低和/或 变得更加可变。可选择地，可将稳定或瞬时表达编码药物转运蛋白或药物代谢酶的基因的、 新鲜平板接种的细胞用于这样的筛选。然而，新鲜平板接种的细胞具有有限的几天的保存 期限并且难以以维持其活力的方式进行运送。此外，为了产生稳定细胞系，外来转染的基因 实际上被整合至细胞的宿主基因组中并与宿主基因组在细胞分裂周期期间保持在一起。宿 主细胞中的染色体整合将导致宿主基因组的永久修饰，这潜在地导致其它基因的异常表达 从而引起宿主行为的非期望的改变和不可靠的实验结果。因此，需要减少与药物开发相关 的时间和资源投入并且提供可靠结果的、适合用于筛选药物候选物的细胞。
[0005] 发明概述
[0006]本发明提供低温保存的重组细胞，其适合用于筛选药物候选物以确定是否某些是 一种或多种药物转运蛋白和/或药物代谢酶的底物或抑制剂，其提供可靠的结果和现成 的方便性。期望地，低温保存后的重组细胞群中的活性水平与新鲜转染的细胞的活性水 平是相当的。此外，容易将低温保存的重组细胞装入小瓶中并利用干冰或干式运输（dry shipper)进行运送，且在接收后方便地储存在-135°C液氮中，具有数年的保存期限。因此， 这样的细胞为最终用户提供了可消耗的"解冻和使用"产品，其提供进行实验的便利并减少 产生和/或维持用于筛选药物候选物的细胞储备物的时间和资源的投入。
[0007]在一个方面，本发明提供了包含一种或多种瞬时过表达基因的低温保存的重组细 胞，所述基因编码选自药物转运蛋白和药物代谢酶或其组合的蛋白，其中所述药物转运蛋 白或药物代谢酶或组合的活性在从低温保存中解冻后的所述低温保存的重组细胞群体中 是可检测的。
[0008]在另一个方面，本发明提供了制备瞬时转染的重组细胞的方法，所述重组细胞瞬 时过表达一种或多种编码选自药物转运蛋白和药物代谢酶或其组合的蛋白的基因，所述方 法包括用一种或多种编码药物转运蛋白或药物代谢酶的基因瞬时转染细胞和在转染的48 小时内低温保存瞬时转染的重组细胞。
[0009] 本发明的这些和其它特征将通过研宄下文的详细描述而被更好地理解。
[0010] 附图概述
[0011] 图1是针对悬浮生长的FreeStyle?293-F(FS293)细胞和293-F细胞的来自细胞 储备物、电穿孔（EP)后的细胞和从低温保存中解冻后的细胞的活细胞百分比图。
[0012] 图2是从低温保存中解冻后的平板接种之后4小时（A)、24小时⑶和48hrs (C)， 转染的细胞的图像。
[0013] 图3是以（A)0.4x 106个活细胞/孔和（B)0.2x 106个活细胞/孔，平板接种于24 孔聚-D-赖氨酸涂覆的平板中并在平板接种培养基中培养的、用pOATPIBl表达质粒转染的 293-F细胞在平板接种（从低温保存中解冻后）后24小时的图像。
[0014] 图4是以0. 4x 106个活细胞/孔平板接种于24孔聚-D-赖氨酸涂覆的平板中的， 用MATE1、MATE2K 0ATP1B3、长同种型0AT1 (具有563个氨基酸的全长cDNA ;在本文中被称 作"长0AT1"）、短同种型0AT1 (缺失C-末端522-534上的13个氨基酸，具有550个氨基 酸；在本文中被称作"短0AT1")、0AT3和pCMV载体转染的293-F细胞在平板接种（从低温 保存中解冻后）后24小时的图像。
[0015] 图5是用50μg/ml、100μg/ml或200 μg/ml绿色荧光蛋白（GFP)转染的贴壁 HEK293细胞在EP后24小时（A)和48小时⑶的荧光图像。
[0016] 图6是使用不同量DNA对贴壁HEK293细胞进行EP后的活细胞百分比图。
[0017]图 7A 是在 EP 后 48 小时，用不同量的 DNA (即 0、50 y g/ml、100 y g/ml、200 y g/ml 或400 y g/ml的0ATP2/0ATP1B1)转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二 醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸收活性的图。
[0018]图 7B 是在 EP 后 96 小时，用不同量的 DNA (即 0、50 y g/ml、100 y g/ml、200 y g/ml 或400 y g/ml的0ATP2/0ATP1B1)转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二 醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸收活性的图。
[0019]图 8 是在 EP 后 48 小时，用不同量的 DNA(即 0、50y g/ml、100y g/ml、200 y g/ml 或400 y g/ml的0ATP2/0ATP1B1)转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二 醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸收的信噪比图。
[0020]图9是使用小规模EP设备（0C400)用0ATP2/0ATP1B1、使用大规模EP设备（CL2) 用0ATP2/0ATP1B1或用空载体对照转染的贴壁HEK293细胞中，雌二醇-17 0 -葡糖苷酸 (E17 0G)吸收活性的图。
[0021] 图10是使用"对照"（即传统的脂质转染试剂（lipofectamine 2000,可获自 Invitrogen))或STX、MaxCyte可扩展EP设备用0ATP1B1基因转染的贴壁HEK293细胞中， 在不同的温育时间后的雌二醇-17 0-葡糖苷酸（E17 0G)吸收的信噪比的图。
[0022] 图11是用0ATP1B1转染的贴壁HEK293细胞中，在不同的温育时间后的雌二 醇-170-葡糖苷酸（E170G)吸收的信噪比的图，其中所述细胞是新鲜平板接种的或是从 低温保存中解冻后平板接种的。
[0023] 图12是使用MaxCyte可扩展EP设备和按比例放大过程用0ATPlBl*la(基因登录 号 NM_006446. 4)、0ATPlBl*lb (基因登录号 NM_006446. 3)、0ATP1B3、pCMV 载体、长同种型 0AT1 (具有563个氨基酸的全长cDNA)、0AT3、0CT1或0CT2转染的HEK293细胞在低温保存、 解冻、平板接种于聚-D-赖氨酸平板上和在平板接种后温育24小时后的图像。
[0024] 图13A是描述在用3yM浓度的PAH温育不同的时间（即1、2、5、10和15分钟） 后，过表达0AT1或pCMV载体的HEK293细胞中p-氨基马尿酸盐（PAH) (0AT1的原型底物） 吸收的时间依赖性测定的结果的图。
[0025] 图13B是描述其中测量在温育5分钟后，过表达0AT1的HEK293细胞对浓度为3 至200yM的PAH的吸收的动力学测定的结果的图。使用Sigma-plot计算的Km和Vmax在 图中显示为插注。
[0026] 图13C是描述其中使用15 y M浓度的PAH和0-300 y M浓度的丙磺舒（0AT1抑制 剂）温育过表达0AT1的HEK293细胞5分钟的抑制测定的结果的图。使用Sigma-plot计 算的IC50在图中显示为插注。
[0027] 图14A是描述在用lyM浓度的E3S温育不同的时间（即1、2、5、10和15分钟） 后，过表达0AT3或pCMV载体的HEK293细胞中雌酮-3-硫酸盐（E3S) (0AT3的原型底物） 吸收的时间依赖性测定的结果的图。
[0028] 图14B是描述其中测量在温育1分钟后，过表达0AT3的HEK293细胞对浓度为0. 5 至32yM的E3S的吸收的动力学测定的结果的图。使用Sigma-plot计算的Km和Vmax在 图中显示为插注。
[0029] 图14C是描述其中使用4 y M浓度的E3S和0-300 y M浓度的丙磺舒（0AT3抑制 剂）温育过表达0AT3的HEK293细胞5分钟的抑制测定的结果的图。使用Sigma-plot计 算的IC50在图中显示为插注。
[0030] 图15A是描述在用31yM浓度的TEA温育不同的时间（即1、2、5、10和15分钟） 后，过表达0CT1或pCMV载体的HEK293细胞中TEA(0CT1的原型底物）吸收的时间依赖性 测定的结果的图。
[0031] 图15B是描述在用3. 8yM浓度的甲福明温育不同的时间（即1、2、5、10和15分 钟）后，过表达0CT1或pCMV载体的HEK293细胞中甲福明（0CT1的原型底物）吸收的时间 依赖性测定的结果的图。
[0032] 图15C是描述其中测量在温育10分钟后，过表达0CT1或pCMV载体的HEK293细 胞对浓度为1、10和100 yM的TEA的吸收的浓度依赖性测定的结果的图。
[0033] 图15D是描述其中测量在温育10分钟后，过表达0CT1或pCMV载体的HEK293细 胞对浓度为〇. 1、1和10 yM的甲福明的吸收的浓度依赖性测定的结果的图。
[0034] 图15E是描述其中使用TEA和不同浓度（0. 1-500 yM)的0CT1抑制剂（奎那定、 异搏定或decynium-22)温育过表达0CT1的HEK293细胞10分钟的抑制测定的结果的图。
[0035] 图15F是描述其中使用3.8yM浓度的甲福明和不同浓度（4yM-3mM)的0CT1抑 制剂西咪替丁温育过表达0CT1的HEK293细胞10分钟的抑制测定的结果的图。
[0036] 图16A是描述在用31yM浓度的TEA温育不同的时间（即1、2、5、10和15分钟） 后，过表达0CT2或pCMV载体的HEK293细胞中TEA(0CT2的原型底物）吸收的时间依赖性 测定的结果的图。
[0037] 图16B是描述在用3. 8yM浓度的甲福明温育不同的时间（即1、2、5、10和15分 钟）后，过表达0CT2或pCMV载体的HEK293细胞中甲福明（0CT2的原型底物）吸收的时间 依赖性测定的结果的图。
[0038] 图16C是描述其中测量在温育10分钟后，过表达0CT2或pCMV载体的HEK293细 胞对浓度为1、10和100 yM的TEA的吸收的浓度依赖性测定的结果的图。
[0039] 图16D是描述其中测量在温育10分钟后，过表达0CT2或pCMV载体的HEK293细 胞对浓度为〇. 1、1和10 yM的甲福明的吸收的浓度依赖性测定的结果的图。
[0040] 图16E是描述其中使用3. 8 y M浓度的甲福明和4 y M-3mM浓度的0CT2抑制剂西 咪替丁温育过表达0CT2的HEK293细胞10分钟的抑制测定的结果的图。使用Sigma-plot 计算