专利名称：生产1，6－二磷酸果糖的方法
发明的所属领域本发明涉及生产1，6-二磷酸果糖的方法，特别涉及使用传代驯化并处理的巴斯德毕赤酵母作为生产菌株，经高密度发酵生产1，6-二磷酸果糖的方法。
发明的背景糖酵解是细胞产生和利用能量的最基本的生物学过程。在这个过程中，葡萄糖分子被分解成两分子丙酮酸，并且由不同的酶控制其中所包括的一系列反应。在继后的反应中，如果细胞内存在足够的氧，丙酮酸将通过不同的途径被转化成二氧化碳和水。
1，6-二磷酸果糖(FDP)是一种天然存在的糖-磷酸分子，在糖酵解的一系列反应中，所产生的FDP很快作为中间产物被消耗掉。因此，正常情况下，FDP只以相对低的浓度存在于细胞内。
二磷酸果糖的1，6-异构体含有连接到果糖的第1和6位碳原子上的磷酸基团。本发明所称的FDP即是这种1，6-异构体。
由于FDP在许多代谢过程中所起的重要作用，所以其在医药领域中的价值越来越受到人们的重视。然而，FDP的生产却一直不能适应这种不断增长的客观需求。
目前，商品FDP仍然是使用酵母介导的磷酸化过程生产的，即利用酵母的磷酸化能力，用酵母发酵葡萄糖(右旋糖)使之磷酸化而产生FDP。为了利于产物FDP从胞浆内排出，曾借助胞壁溶解剂如甲苯或去污剂三硝基甲苯(TRITON)处理细胞，或者通过改变温度或造成渗透休克来提高酵母细胞壁的通透性。然而，这些方法也同时带来了细胞壁保留胞浆内容物的能力降低的问题，结果导致许多酵解酶随FD一起通过细胞壁漏出并分散于过滤或离心的含FDP溶液中。
为了解决上述问题，意大利专利19865A/86号描述了使用戊二醛对酵母的糖酵解酶进行细胞内固定，以保留酵母细胞的磷酸化能力的方法。这种方法允许人为地“调整”细胞通透性，从而既可使FDP从细胞内流出，同时又可有效地防止代谢酶的漏出，从而保证FDP生产的连续进行。
另一方面，在磷酸化过程中，由于不断有新生成的FDP透过细胞膜被输出，也致使酵母细胞的酶系统逐渐被耗尽。为了维持FDP的连续产生，有时必须在完成一个磷酸化过程后定时地更换酵母菌。
然而，在许多情况下，由于啤酒酵母的固有特性(细胞壁通透性、细胞酶含量及糖酵解能力等)所决定的，包括上述方法在内的许多方法仍难以克服其作为FDP生产菌的种种缺陷。
发明的目的本发明的一个目的是一种使用酵母菌发酵生产1，6-二磷酸果糖的方法，特征在于所说的酵母菌是经过传代驯化并进行了处理的巴斯德毕赤酵母。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的巴斯德毕赤酵母是野生型巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430-SC5菌株。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的传代是在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中传代培养15-20代。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的传代过程优化了所说的巴斯德毕赤酵母细胞的糖酵解和ATP生成能力。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的处理包括在加入葡萄糖和磷酸之前，于缓慢搅拌下向50％巴斯德毕赤酵母的水悬浮液中加入0.5体积含1.5M葡萄糖和0.8M磷酸钠的高渗溶液，以增加酵母细胞的通透性并允许所产生的1，6-二磷酸果糖从胞浆流出细胞外，然后向增加了通透性的酵母细胞的悬液内加入酵解酶保护剂。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的酵解酶保护剂是50％(V/V)酵母提取物和50％(V/V)由牛血清白蛋白(5-10g/L)，明胶(5-10g/L)，海藻糖(30-50g/L)，谷氨酸钠(5-10g/L)，尿素(5-15g/L)和山梨醇(2-5g/L)组成的溶液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的适于用作酵解酶保护剂成分的酵母提取物是在含有由1.5M葡萄糖和0.6M磷酸钠组成之溶液的玻璃匀浆中经破碎巴斯德毕赤酵母细胞而制成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中加入到增加了通透性的巴斯德毕赤酵母细胞的悬液内的酵解酶保护剂的量为磷酸化混合物体积的15-20％。
发明的详细描述本发明提供了一种生产1，6-二磷酸果糖的方法，特别提供了使用经过传代驯化和体外处理的巴斯德毕赤酵母作为生产菌株，以高密度发酵生产1，6-二磷酸果糖的方法。
毕赤酵母，特别是巴斯德毕赤酵母一种可利用甲醇作为唯一碳源的甲基营养酵母。巴斯德毕赤酵母可以在液体或固体培养基上，利用葡萄糖、甘油、果糖等多种简单碳源良好地生长。在以葡萄糖为碳源的培养基上，其倍增时间约为90分钟，而在甲醇基质上的细胞倍增时间约为6小时。在震荡培养条件下，细胞的生长温度为30℃。巴斯德毕赤酵母特别适于高密度和超高密度发酵。
与其他酵母菌相比，毕赤酵母特别是巴斯德毕赤酵母具有更加旺盛的活力(生长与代谢能力)，因此推测巴斯德毕赤酵母细胞内可能存在有更为丰富的酶体系和磷酸化能力，从而可能更适合以葡萄糖为原料发酵生产1，6-二磷酸果糖。
本发明方法中所使用的优选酵母菌株是巴斯德毕赤酵母菌株NRRLY-11430-SC5。作为野生型巴斯德毕赤酵母，NRRL Y-11430-SC5菌株具有完善和高活力的葡萄糖酵解酶体系，并因而具有很强的能量供应分子三磷酸腺苷(ATP)的生成和输出能力。因此，在发酵生产1，6-二磷酸果糖的实践中，该菌株比常规使用的啤酒酵母具有更大的优越性。经过在葡萄糖培养基中的传代驯化后，本发明所使用的菌株进一步改善了其糖酵解和ATP生成能力。特别是该菌株在经过适当的体外处理后，基本上可以实现FDP生产的连续进行。
根据本发明的方法，首先提供了用于发酵生产1，6-二磷酸果糖的、在含高浓度葡萄糖的培养基中进一步传代驯化的野生型巴斯德毕赤酵母菌株NRRLY-11430-SC5。其中用于传代培养NRRL Y-11430-SC5酵母菌株细胞的培养基是添加了20g/L葡萄糖的BSM培养基(每升含有85％磷酸26ml，硫酸钙0.9g，硫酸钾18g，硫酸镁09g，氢氧钾4g)。细胞培养温度为28-32℃。在此细胞驯化过程中，至少在如上所述的培养基中完成15-20代的细胞传代培养。
根据本发明的方法，为了有利于酵母菌在葡萄糖酵解过程中的磷酸化循环，并使葡萄糖酵解产物1，6-二磷酸果糖顺利地从细胞内流出，我们首先借助改变温度和渗透休克方法处理细胞，以提高酵母细胞的细胞膜通透性。所说的方法包括离心酵母培养物(至少3天)并将细胞重新悬浮在无菌水中以制备酵母细胞的悬浮液。然后，向此细胞悬浮液中加入0.5体积含1.0M葡萄糖和0.5M磷酸钠的高渗溶液并在持续搅拌下将悬液加热到32℃。30分钟后，以甲烯兰染色法检测细胞的通透性。该方法是使用同体积含001％甲烯兰和2％乙酸钠的溶液处理1％酵母细胞悬液，然后在显微镜下检查细胞，细胞出现兰色即证明已增加了通透性。或者，在细胞比较脆弱的情况下，也可以使用Triton X-100或甲苯作为细胞膜通透剂使用。
为了防止在增加了细胞通透性的情况下酵母细胞内糖酵解酶的漏出，并保证磷酸化循环的持续进行，有必要进一步在细胞培养物中加入足够量果糖和磷酸的浓缩溶液和酵解酶保护剂，以在细胞外造成一个反渗透条件并尽可能地防止酶降解。根据本发明的方法，其中所说的酵解酶保护剂包括50％(V/V)酵母提取物和50％(V/V)由牛血清白蛋白(5-10g/L)，明胶(5-10g/L)，海藻糖(30-50g/L)，谷氨酸钠(5-10g/L)，尿素(5-15g/L)和山梨醇(2-5g/L)组成的溶液。
根据本发明的方法，其中所说的适于用作酵解酶保护剂成分的酵母提取物是在含有1.5M葡萄糖和0.6M磷酸钠的溶液中，于4℃下使用玻璃匀浆器破碎巴斯德毕赤酵母细胞而制成的。在这些条件下经三次匀浆后，大约有90％的酵母细胞被破碎。
必要时，也可向细胞悬液中加入二巯基乙醇(约1-2mM)以防止酵解酶分子中的巯基被氧化。
上述处理的全部过程均在30℃和持续搅拌下进行。
实施例实施例1
将50g离心得到的、在含高浓度葡萄糖的BSM培养基中传代(共16代)培养的巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430-SC5菌株的细胞重新悬浮在40ml无菌水中，并向所得到的悬液中加入20ml由1.0M葡萄糖和0.5M磷酸钠组成的营养混合物。然后将此悬液加热到32℃。在缓慢搅拌下，在玻璃匀浆器中(4℃)制备细胞匀浆。然后向所得到的约50ml细胞匀浆中加入25mg二巯基乙醇和20ml上述酵解酶保护剂。放置30分钟后将这些经处理的酵母细胞用于连续的磷酸化循环。
实施例2用实施例1所述的方法处理80g离心得到的新鲜巴斯德毕赤酵母NRRLY-11430-SC5细胞，处理后按下述方法将所得到的细胞悬液用于连续的磷酸化循环。
向如上处理的高密度细胞悬液中再次加入30ml上述营养混合物和20ml上述酵解酶保护剂并于28℃保温8小时。保温后，离心收集含有1，6-二磷酸果糖的上清液并将分离出酵母细胞重新悬浮在无菌水中(总体积约100ml)。向其中假如少量15％氯化镁溶液(2ml)和50ml上述营养混合物，并再次于28℃保温8小时10小时。然后，再次分离上清、收集并重新悬浮细胞，以进行下一轮的磷酸化循环。在完成整个10次循环后系统中仍有二氧化碳产生，表明此时细胞仍然是活的。
权利要求
1，使用酵母菌发酵生产1，6-二磷酸果糖的方法，特征在于所说的酵母菌是传代驯化并经过处理的巴斯德毕赤酵母。
2，根据权利要求1的方法，其中所说的巴斯德毕赤酵母是野生型巴斯德毕赤酵母NRRL Y-11430-SC5菌株。
3，根据权利要求1的方法，其中所说的传代是在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中传代培养15-20代。
4，根据权利要求1的方法，其中所说的传代过程优化了所说的巴斯德毕赤酵母细胞的糖酵解和ATP生成能力。
5，根据权利要求1的方法，其中所说的修饰包括在加入葡萄糖和磷酸之前，于缓慢搅拌下向巴斯德毕赤酵母细胞的50％水悬浮液中加入0.5体积含1.5M葡萄糖和0.8M磷酸钠的高渗溶液，以增加酵母细胞的通透性并允许所产生的1，6-二磷酸果糖从胞浆流出细胞外，然后向增加了通透性的酵母细胞的悬液内加入酵解酶保护剂。
6，根据权利要求1的方法，其中所说的酵解酶保护剂是50％(V/V)酵母提取物和50％(V/V)由牛血清白蛋白(5-10g/L)，明胶(5-10g/L)，海藻糖(30-50g/L)，谷氨酸钠(5-10g/L)，尿素(5-15g/L)和山梨醇(2-5g/L)组成的溶液的混合液。
7，根据权利要求1的方法，其中所说的适于用作酵解酶保护剂成分的酵母提取物是在由1.5M葡萄糖和0.6M磷酸钠组成的溶液中，使用玻璃匀浆器破碎巴斯德毕赤酵母细胞而制成的。
8，根据权利要求1的方法，其中加入到增加了通透性的巴斯德毕赤酵母细胞的悬液内的酵解酶保护剂的量为磷酸化混合物体积的15-20％。
全文摘要
本发明涉及生产1，6－二磷酸果糖的方法，特别涉及使用传代驯化并处理的巴斯德毕赤酵母作为生产菌株，经高密度发酵生产1，6－二磷酸果糖的方法。
文档编号C12P19/02GK1603419SQ03135998
公开日2005年4月6日 申请日期2003年9月29日 优先权日2003年9月29日
发明者颜炜群 申请人:吉林圣元科技有限责任公司