专利名称：大豆疫霉病菌实时荧光pcr检测探针、试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，具体地说，涉及一种对大豆疫病(Phytophthora sojae)的简单、快速、微量的分子检测探针和试剂盒，适合于口岸检验检疫、农业生产、植物保护等部门使用。
背景技术：
大豆是我国的主要农产品，大豆疫病是大豆上的毁灭性病害，该种病菌是我国进境植物禁止进入的一类检疫性有害生物。
大豆疫病首次报导于美国，1957年大豆疫病仅在美国俄亥俄州就达150万美元的损失，1978年大豆疫病在美国第二次大爆发，全国发病面积达到800万公顷，到目前为止，大豆疫病已在美国广泛分布。目前该病已广泛分布于全世界10多个国家。
近年来我国从美国、加拿大和阿根廷进口大豆量极大，2000年、2001年和2002年连续3年达到1000余万吨，2003年也极可能超过1000万吨，我国多个口岸已经从进口大豆中截获了大豆疫霉病菌，说明该病菌传入我国的风险很大。由于我国每年均要从国外大量进口大豆，所以为预防该病菌传入，我们极有必要建立对该病菌的快速检测方法。
对大豆疫病的检测或鉴定，目前国内外主要采取两类方法，即(1)土壤诱集法，土壤诱集法依靠大豆疫霉病菌的寄生专化性，先用感病的大豆叶片从土壤中诱集病原菌，再对诱集的病原菌进行分离、培养以及致病性测定；(2)ELISA方法，ELISA方法依靠抗原与抗体的反应，其缺点在于灵敏度偏低。
目前，我国对大豆疫霉病菌所采用的检测方法主要是对土壤中的病菌进行诱集，之后再进行分离培养和致病性测定。如我国周肇惠、严进等人对该病菌进行了种子带菌与检测研究，彭金火等人对该菌土壤带菌及检测方法进行了研究，建立了对大豆疫霉病菌的土壤诱集和分离培养方法。章桂明用国产大豆品种合丰25号从进口美国大豆所带的土壤中成功诱集到了大豆疫霉病菌。该方法虽然可以得出可靠的检测结果，但是存在如下缺点1)费时较长，从土壤开始培养到分离培养，再到致病性测定一般需要15～20天才能完成整个检测过程，并得出检测结果。2)对于质量监督检验检疫部门，由于在进出境获取的土样极少，土壤中能检测到的卵孢子更少，并且利用感病大豆叶片诱集到的大豆疫病难度大，时间长，不能满足动植物检疫检测部门的需要。3)在农业生产部门，过去对大豆疫病的检测往往采用对病株进行分离培养或从土壤中诱集病原菌的办法，前者采用病组织对大豆疫病的分离难度较大，且时间较长，而采用土壤诱集的方法所遇到的困难与质量监督检验检疫部门所遇到的困难一样。因此，极需要需求新的快速检测方法。
为了快速检测大豆疫霉病菌，国外近几年对该病的检测在应用ELISA方法和分子生物学方法包括PCR方法进行了一些有益探索。
实时荧光PCR检测方法是一种在定性PCR基础上于1996年才发展起来的一种检测方法，该方法因为在PCR的同时加入了一段TaqMan探针，从而可以较有效地避免定性PCR无法避免的非特异性扩增和假阳性现象，该方法在医学上得到较广泛的应用，近几年该方法又应用于转基因产品的定量检测。在国外，实时荧光PCR首次应用于植物真菌病害检测领域是在2000年。在我国，程颖慧、章桂明等人首次于2001年将实时荧光PCR检测方法应用于小麦印度腥黑穗病菌及其近似种的检测中。
TaqMan MGB探针方法是在TaqMan方法之后产生的更新的方法，MGB的全称为Minor Groove Binder，它在2001年才被推出。与TaqMan探针相比，其原理是TaqMan MGB探针一是在探针的3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记；二是探针的3’端另结合了Minor Groove binder结合物，使探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性。该方法具有如下优点1、容易设计；2、探针短；3、提高配对与非配对模板间的Tm值差异；4、高特异性和高精确性；5、杂交的稳定性好；6、低背景，改进了信噪比；7、结果重现性好；8、操作快速；9、结果无需进行凝胶电泳；10、防止污染，进一步降低假阳性率。
但是，将TaqMan MGB探针的实时荧光PCR检测方法应用于病原真菌的检测，无论在国外，还是在国内，还是刚刚起步，需要做更多的探索研究工作。
发明内容
本发明的目的意在克服上述现有技术的不足，提出快速、可靠、灵敏度高、特异性强和价格便宜的检测大豆疫霉病菌的引物、探针、试剂盒及实时荧光PCR检测方法。
实现上述目的的技术方案用于大豆疫霉病菌检测的寡核苷酸引物是寡核苷酸引物5’-CCTGCTCTGTGTGGCTGT-3’(序列号NO.1)；寡核苷酸引物5’-TGGTTTGGGTCCTCCTCGT-3’(序列号NO.2)；寡核苷酸引物5’-TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’(序列号NO.3)；寡核苷酸引物5’-CACCTAAAAAACTTTCCACGTGAA-3’(序列号NO.4)；寡核苷酸引物5’-TGATAGAGCCCGCCACACA-3’(序列号NO.5)；寡核苷酸引物5’-TGTCTAGGCTCGCACATCGA-3’(序列号NO.6)；寡核苷酸引物5’-GATGACTCACTGAATCCTGCAATT-3’(序列号NO.7)。
用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，是检测大豆疫霉病菌的TaqMan MGB探针，其最长探针序列是5’-AGAGCCCGCCACACAGCAGCCAGCCGCCGACTTTGAC-3’，其最短探针序列是5’-ACAGCAGCCAGCC-3’，其优化的探针序列是5’-CACAGCAGCCAGCC-3’(探针编号NO.1)。
用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，是特异性检测大豆疫霉病菌的TaqMan MGB探针，其最长探针序列是5’-CCCACTTTTAAACCCATTCTTAAATACTGAATATACTGTGGGG-3’，其最短探针序列是5’-ATTCTTAAATACT-3’，其优化的探针序列是5’-ACCCATTCTTAAATACTGAA-3’(探针编号NO.2)。
用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，是特异性检测大豆疫霉病菌的TaqMan MGB探针，其最长的探针序列是5’-ACTTTGACGTCGGACAGACAGCCACACAGAGCAGGCCCCCA-3’，其最短的探针序列是5’-CGGACAGACAGCC-3’，其优化的探针序列是5’-ACAGACAGCCACACAG-3’(探针编号NO.3)。
用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，是用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测过程中的质控，其最长的探针序列是5’-AAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCA-3’，其最短的探针序列是5’-ACTGCGATACGTA-3’，其优化的探针序列是5’-CGAACTGCGATACGTAAT-3’(探针编号NO.4)。
所述用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，荧光报告基团标记在5’端，而自身不发光的荧光淬灭基团标记在3’端，在3’端结合了MGB结合物。
所述标记在3’端的其自身不发光的淬灭基团可以用TAMRA所代替，在3’端也不结合MGB结合物。
用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，当在同一个PCR管中同时加入大豆疫霉病菌实时荧光PCR特异性检测探针和大豆疫霉病菌实时荧光PCR质控检测探针，以实现对大豆疫霉病菌同时和同步进行特异性和质控检测时，大豆疫霉病菌实时荧光PCR特异性检测探针所标记的荧光报告基团与用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR质控检测所标记的荧光报告基团种类不同。
用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的试剂盒，是将上述探针制成用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的试剂盒。
大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤(1)先对大豆疫霉病菌及其近似种或相关种进行序列比较分析，找出大豆疫霉病菌不同于其它疫霉病菌或相关种的独有的碱基位点；(2)根据TaqMan MGB探针的设计原理和设计方法，设计大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的TaqManMGB探针；(3)对所设计的探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出特异性探针，优化出合适的反应体系和反应条件；(4)加入上述探针进行大豆疫霉病菌实时荧光PCR反应。
在进入步骤(4)进行PCR反应前，可以先加入扩增真菌核糖体内转录区的1对通用引物5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(ITS4)和5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(ITS5)进行聚合酶链式反应扩增(PCR)，取扩增产物经纯化后再加入上述任意一条探针进行实时荧光PCR反应。
采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于1、设计出了适用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR快速检测的探针和试剂盒。2、适用于利用单个孢子或多个或微量孢子对大豆疫霉病菌进行直接进行TaqMan MGBPCR检测的方法，克服了现有的形态学鉴定方法和PCR检测方法须先获取大量孢子或需要对病菌孢子先进行分离培养才能对大豆疫病进行鉴定或检测的缺点，从而实现对该病在无病新区定殖初期或在田间发病初期或在口岸进口大豆截获土壤中或大豆中所获的单个卵孢子或极微量病菌孢子的情况下就能准确对该病进行检测或鉴定。3、本发明针对大豆疫霉病菌的检测，设计了专门的引物和探针，利用单个或多个或微量孢子直接进行TaqMan MGB PCR检测只需要3-5个小时，检测方法快速、可靠、灵敏度高、特异性强、所需检测材料最低。4、本发明适合土壤传带的大豆疫霉病菌的检测，而且也适合豆杆、豆荚和大豆种子等传带的大豆疫霉病菌的检测。5、由于本发明不需要对真菌进行分离培养，缩短了真菌的检测时间，使过去对需要分离培养的真菌用15～20天才能进行PCR检测，现在直接利用孢子进行PCR检测只需要1天，特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
综上所述，采用本发明，能对实际检疫和田间调查过程中所发现的孢子进行大豆疫霉病菌分子生物学鉴定或检测，其意义特别重大。
具体实施例方式
实施例一一种用于大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)实时荧光PCR检测的探针序列及试剂盒，用于大豆疫霉病菌的特异性检测引物序列5’-CCTGCTCTGTGTGGCTGT-3’5’-TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’探针序列5’-CACAGCAGCCAGCC-3’(探针编号NO.1)；试剂盒应用该探针制成的用于大豆疫霉病菌检测的实时荧光PCR检测试剂盒。
实施例二
一种用于大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)实时荧光PCR检测的探针序列及试剂盒，用于大豆疫霉病菌的特异性检测引物序列5’-TGGTTTGGGTCCTCCTCGT-3’5’-TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’探针序列5’-ACCCATTCTTaAATACTGAA-3’(探针编号NO.2)。
试剂盒应用该探针制成的用于大豆疫霉病菌检测的实时荧光PCR检测试剂盒。
实施例三一种用于大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)实时荧光PCR检测的探针序列及试剂盒，用于大豆疫霉病菌的特异性检测引物序列5’-CACCTAAAAAACTTTCCACGTGAA-3’5’-TGATAGAGCCCGCCACACA-3’探针序列5’-ACAGACAGCCACACAG-3’(探针编号NO.3)试剂盒应用该探针制成的用于大豆疫霉病菌检测的实时荧光PCR检测试剂盒。
实施例四一种用于大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)实时荧光PCR检测的探针序列及试剂盒，用于大豆疫霉病菌检测过程中的质控。
引物序列5’-TGTCTAGGCTCGCACATCGA-3’5’-GATGACTCACTGAATCCTGCAATT-3’探针序列5’-CGAACTGCGATACGTAAT-3’(探针编号NO.4)。
试剂盒应用该探针制成的用于大豆疫霉病菌检测的实时荧光PCR检测试剂盒。
实施例五一种用于大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)实时荧光PCR检测的探针序列及试剂盒，同时用于大豆疫霉病菌特异性检测和质控检测。
引物序列5’-CCTGCTCTGTGTGGCTGT-3’5’-TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’5’-TGTCTAGGCTCGCACATCGA-3’5’-GATGACTCACTGAATCCTGCAATT-3’探针序列5’-CACAGCAGCCAGCC-3’(探针编号NO.1)5’-CGAACTGCGATACGTAAT-3’(探针编号NO.4)。
试剂盒应用该探针制成的用于大豆疫霉病菌检测的实时荧光PCR检测试剂盒。
实施例六一种用于大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)实时荧光PCR检测的探针序列及试剂盒，同时用于大豆疫霉病菌特异性检测和质控检测。
引物序列5’-TGGTTTGGGTCCTCCTCGT-3’5’-TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’5’-TGTCTAGGCTCGCACATCGA-3’5’-GATGACTCACTGAATCCTGCAATT-3’探针序列5’-ACCCATTCTTaAATACTGAA-3’(探针编号NO.2)5’-CGAACTGCGATACGTAAT-3’(探针编号NO.4)。
试剂盒应用该探针制成的用于大豆疫霉病菌检测的实时荧光PCR检测试剂盒。
实施例七一种用于大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)实时荧光PCR检测的探针序列及试剂盒，同时用于大豆疫霉病菌特异性检测和质控检测。
引物序列5’-CACCTAAAAAACTTTCCACGTGAA-3’5’-TGATAGAGCCCGCCACACA-3’5’-TGTCTAGGCTCGCACATCGA-3’5’-GATGACTCACTGAATCCTGCAATT-3’探针序列5’-ACAGACAGCCACACAG-3’(探针编号NO.3)5’-CGAACTGCGATACGTAAT-3’(探针编号NO.4)。
试剂盒应用该探针制成的用于大豆疫霉病菌检测的实时荧光PCR检测试剂盒。
上述各实施例中所述的探针为优化的探针序列，对应于探针编号NO.1的最长探针序列是5’-AGAGCCCGCCACACAGCAGCCAGCCGCCGACTTTGAC-3’，最短探针序列是5’-ACAGCAGCCAGCC-3’；对应于探针编号NO.2的最长探针序列是5’-CCCACTTTTAAACCCATTCTTAAATACTGAATATACTGTGGGG-3’，最短探针序列是5’-ATTCTTAAATACT-3’；对应于探针编号NO.3的最长的探针序列是5’-ACTTTGACGTCGGACAGACAGCCACACAGAGCAGGCCCCCA-3’，最短的探针序列是5’-CGGACAGACAGCC-3’；对应于探针编号NO.4的最长的探针序列是5’-AAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCA-3’，最短的探针序列是5’-ACTGCGATACGTA-3’。
实施例八一种用于大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)实时荧光PCR的检测方法，其引物和探针是上述实施例中的任何一组引物和探针。
其检测反应的体系中各成分分别为实时荧光反应混合液TaqManUniversal PCR Master Mix(ABI)9μl(含Buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶)，1对引物各2.25μ1，探针各0.5μl，去离子水10μl，破壁冬孢子1个或多个或微量，或是DNA 2-20ng。
其检测反应条件见表1表1扩增程序50℃2min95℃10min 其结果判定标准是1)若定量PCR仪检测到以大豆疫霉病菌DNA为模板的阳性对照报告荧光有明显信号增长，质控的报告荧光有明显信号增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光信号有明显增长，则表示所检测的真菌是大豆疫霉病菌；2)若定量PCR仪检测到以大豆疫霉病菌DNA为模板的阳性对照报告荧光没有荧光信号增长，质控的报告荧光有荧光信号的增长，阴性对照和空白对照的报告荧光没有荧光信号增长，而样品的检测结果是报告荧光也没有荧光信号增长，则表示所检测的真菌不是大豆疫霉病菌。
在上述各实施例中，荧光报告基团标记在5’端，而自身不发光的荧光淬灭基团标记在3’端，在3’端结合了MGB结合物。
进一步地，所述标记在3’端的其自身不发光的淬灭基团还可以用TAMRA所代替，在3’端也不结合MGB结合物。
为了对大豆疫霉病菌同时和同步进行特异性和质控检测，可在同一个PCR管中同时加入大豆疫霉病菌实时荧光PCR特异性检测探针和大豆疫霉病菌实时荧光PCR质控检测探针，此时，大豆疫霉病菌实时荧光PCR特异性检测探针所标记的荧光报告基团与用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR质控检测所标记的荧光报告基团种类不同。
权利要求
1.用于大豆疫霉病菌检测的寡核苷酸引物，包括寡核苷酸引物5’-CCTGCTCTGTGTGGCTGT-3’(序列号NO.1)；寡核苷酸引物5’-TGGTTTGGGTCCTCCTCGT-3’(序列号NO.2)；寡核苷酸引物5’-TGTGCGAGCCTAGACATCCA-3’(序列号NO.3)；寡核苷酸引物5’-CACCTAAAAAACTTTCCACGTGAA-3’(序列号NO.4)；寡核苷酸引物5’-TGATAGAGCCCGCCACACA-3’(序列号NO.5)；寡核苷酸引物5’-TGTCTAGGCTCGCACATCGA-3’(序列号NO.6)；寡核苷酸引物5’-GATGACTCACTGAATCCTGCAATT-3’(序列号NO.7)。
2.用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是检测大豆疫霉病菌的TaqMan MGB探针，其最长探针序列是5’-AGAGCCCGCCACACAGCAGCCAGCCGCCGACTTTGAC-3’，其最短探针序列是5’-ACAGCAGCCAGCC-3’，其优化的探针序列是5’-CACAGCAGCCAGCC-3’(探针编号NO.1)。
3.用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是特异性检测大豆疫霉病菌的TaqMan MGB探针，其最长探针序列是5’-CCCACTTTTAAACCCATTCTTAAATACTGAATATACTGTGGGG-3’，其最短探针序列是5’-ATTCTTAAATACT-3’，其优化的探针序列是5’-ACCCATTCTTAAATACTGAA-3’(探针编号NO.2)。
4.用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是特异性检测大豆疫霉病菌的TaqMan MGB探针，其最长的探针序列是5’-ACTTTGACGTCGGACAGACAGCCACACAGAGCAGGCCCCCA-3’，其最短的探针序列是5’-CGGACAGACAGCC-3’，其优化的探针序列是5’-ACAGACAGCCACACAG-3’(探针编号NO.3)。
5.用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征是用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测过程中的质控，其最长的探针序列是5’-AAGAACGCTGCGAACTGCGATACGTAATGCGAATTGCA-3’，其最短的探针序列是5’-ACTGCGATACGTA-3’，其优化的探针序列是5’-CGAACTGCGATACGTAAT-3’(探针编号NO.4)。
6.根据权利要求2至5中任意一项用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征在于荧光报告基团标记在5’端，而自身不发光的荧光淬灭基团标记在3’端，在3’端结合了MGB结合物。
7.根据权利要求2至5中任意一项用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的寡核苷酸探针，其特征在于标记在3’端的其自身不发光的淬灭基团可以用TAMRA所代替，在3’端也不结合MGB结合物。
8.用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的试剂盒，其特征在于用权利要求2、3、4或5的探针制成的用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的试剂盒。
9.大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)先对大豆疫霉病菌及其近似种或相关种进行序列比较分析，找出大豆疫霉病菌不同于其它疫霉病菌或相关种的独有的碱基位点；(2)根据TaqMan MGB探针的设计原理和设计方法，设计大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测的TaqMan MGB探针；(3)对所设计的探针进行筛选及反应体系和反应条件的优化，筛选出优化的特异性探针，并优化出合适的反应体系和反应条件；(4)加入权利要求2、3、4或5所述的探针进行大豆疫霉病菌实时荧光PCR反应。
10.根据权利要求9所述大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于进入步骤(4)实时荧光PCR反应之前，先加入扩增真菌核糖体内转录区的1对通用引物5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(ITS4)和5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(ITS5)进行聚合酶链式反应扩增(PCR)，取扩增产物经纯化后再进入步骤(4)。
11.根据权利要求9所述大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法，其特征在于当在同一个PCR管中同时加入大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测探针和大豆疫霉病菌实时荧光PCR质控检测探针时，大豆疫霉病菌实时荧光PCR特异性检测探针所标记的荧光报告基团与用于大豆疫霉病菌实时荧光PCR质控检测所标记的荧光报告基团种类不同。
全文摘要
本发明提供了多套实时荧光检测大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae)的引物、探针及试剂盒，是专门针对大豆疫霉病菌而建立的一种快速检测方法，检测时间仅用一天，且灵敏度高、特异性强、稳定可靠。该方法克服了现有对大豆疫病进行形态学和致病性鉴定方法、ELISA检测方法须先获取通过诱集或分离培养获取大量孢子才能对大豆疫病进行鉴定或检测的缺点，也克服了常规PCR检测方法难于避免的假阳性。该方法适用于对该病在无病新区定殖初期或在田间发病初期或在口岸进口大豆截获土壤中或大豆种子或豆荚或豆秆中所获的单个卵孢子或单个游动孢子囊或极微量病菌孢子的情况下就能准确对该病进行检测或鉴定，也能适合对经分离培养后的病原菌进行检测或鉴定。特别适用于口岸检疫等时效性要求特别强的场合使用。
文档编号C12P19/34GK1526831SQ0313588
公开日2004年9月8日 申请日期2003年9月19日 优先权日2003年9月19日
发明者章桂明, 程颖慧, 吴际云, 彭金火, 严进, 王颖, 易建平, 杨伟东, 金显忠 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 深圳出入境检验检疫局动植物与食品检