在均相体系中大规模培养t－淋巴细胞的方法

专利名称：在均相体系中大规模培养t－淋巴细胞的方法
技术领域：
本发明领域涉及体外细胞培养和分离的人细胞的大规模扩增。
现有技术一种抗肿瘤治疗方法，是以利用来自体内分离的细胞系或被赋予细胞毒活性的细胞为基础的。
90年代初，从患有称作TALL的急性T细胞淋巴母细胞白血病的儿童体内，分离出多种T-淋巴细胞系。正如O’Connor等人(Blood，1991，771534-1545)和Cesano and Santoli(In Vitro Cell.Dev.Biol.，1992，28648-656)所描述的，它们包括T细胞系TALL-104、TALL-107、TALL-103/2。它们呈现出如此引人注意的特征，使其现已成功用于动物模型和人的肿瘤治疗(Cesano等人，Blood 1991，87393-403；Cesano等人，Cancer Res.，1996，563021-3029、US5,272,082；US5,683,690；US5,702,702)。
TALL细胞系被赋予特异的抗肿瘤细胞毒活性，并且有效对抗不同类型的肿瘤这些细胞的主要特征在于它们是MHC非限制性的(Cesano等人，J.Immunol.，1993，1512943-2957)因而可对任何患者给药，不受组织相容性抗原表型的限制。而且，不同于某些类型的细胞毒淋巴细胞，例如TIL和LAK，体内给药后TALL细胞系不需要淋巴因子的伴随治疗。这是该细胞的另一优点，因为淋巴因子的同时给药具有若干缺点。
另外，TALL淋巴细胞已在多种肿瘤中试验成功。这正是它们为什么被认为是一种值得关注的治疗选择的原因。但是，正如Cesano等人Cancer Res.，1996 564444-4452和Visonneau等人，Clin.CancerRes.，1997，31789-1797所描述，迄今所用的细胞扩增体系受到限制的，因为为过继性免疫疗法制备的细胞来自生长于单个摇瓶的培养物，尽管用于制备单克隆抗体和重组体蛋白质那样的大规模细胞培养装置已长期使用。因此，非常希望有适合这种细胞的大规模培养体系。
发明概述本发明的一个目的在于提供一种方法，该方法以使用均相培养体系为基础，用于TALL淋巴细胞的大规模扩增和培养。“大规模数量的TALL淋巴细胞”代表至少1×109个细胞。
具体而言，本发明方法使用的发酵罐或均相体系为细胞工厂，优选由数十个小室组成。可用本发明方法扩增的淋巴细胞选自由TALL-104、TALL-107、TALL-103/2组成的组，可任选经过遗传修饰。
根据另一个实施方案，本发明涉及一种细胞采样方法，该方法对袋子装填夹头进行密封，从而生成至少一个采样小室，其中含有足够采样数目的细胞。
附图简要说明

图1为生长于摇瓶中的TALL细胞的葡萄糖水平和细胞浓度说明图。
用15个摇瓶的TALL测定了以下参数细胞数/毫升(-◆-)和葡萄糖水平(深色线条)。
发明详细说明本发明涉及TALL淋巴细胞的大规模扩增方法，其中在优选由单个发酵装置组成的均相体系中培养至少1×109个细胞。
TALL(急性T细胞淋巴母细胞性白血病)淋巴细胞是细胞毒性T淋巴细胞，来自类淋巴母细胞白血病儿科患者，包括TALL-104、TALL-107、TALL-103/2细胞系，正如O’Connor等人在Blood，1991，771534-1545和Cesano和Santoli在In Vitro Cell.Dev.Biol.，1992，28648-656所描述。优选的细胞系为TALL-104。TALL细胞还可以是经过遗传修饰的。
目前它们在单个摇瓶中扩增所能达到的最大值仅为约1×108个细胞/T175摇瓶。
因此，迄今制备含有治疗有效量的细胞袋，其包含细胞数为105～1012，优选1×107～1×1010，更优选1×108～2.5×109，涉及大量单个摇瓶的同时扩增。
根据本发明定义，由于每个摇瓶的培养微环境不同，所以单个摇瓶中的培养代表不均一培养体系。因此，根据FDA指南美国卫生部的“工业指南用于人体细胞治疗和基因治疗指南”(CBER，March 1998，PointIII)—建议对由独立体系制备的每批细胞混合物应分别控制—所以用现有技术方法制备的来源于单个摇瓶的细胞代表不同的批次，因而应独立控制。因此，开发治疗用细胞，特别是TALL细胞的均相培养体系，对批次控制同样具有巨大的优势。
此外，在大量单个摇瓶组成的多相体系中扩增，由于操作者重复进行手工操作，可能导致较高的污染风险。
TALL细胞通常悬浮生长，但令人惊奇的是，在已知用于这种细胞的工业放大体系中，例如旋转摇瓶或miniPERM，其不能被放大或扩增。由于最大的商品化摇瓶(T175)最多只能容许获得1.5～2×108的TALL细胞，当生产细胞数目超过109，例如生产至少2.5×109治疗剂量的细胞时，细胞的分步-扩增变得极为复杂。
申请人意外地发现，在均相体系中，例如通常用于贴壁依赖性细胞的细胞工厂中，可有效培养和扩增该细胞。相反地，传统用于大规模培养悬浮细胞，如具有与TALL细胞相似生长特性的杂交瘤细胞的旋转摇瓶或其它发酵罐却不适合。
“大规模生产”是指在均相体系中生产至少1×109个TALL细胞。
在本发明方法中，涉及细胞数目的数据存在约5％的容许误差，代表在Burker’s槽内测定细胞计数时的可能误差。例如，1×106个细胞事实上指的是0.95×106～1.05×106的细胞数目。测量误差是可变的，取决于采用的测量方法。
根据本发明方法，在细胞工厂中的TALL扩增优选先进行预扩增，由在同一摇瓶中的一系列体积扩增组成(其中摇瓶用作细胞培养容器)，通过向培养物中连续加入新鲜的完全培养基，将全部培养物转入具有更大体积的摇瓶中，最终转至具有最大体积和最大表面积的商品化摇瓶，例如T175摇瓶中。
根据本发明的优选特征，进行预扩增直至获得总数约3～4×108细胞，其中约2～2.5×108细胞用于各细胞工厂的接种，约1～1.5×108细胞用于在T175培养瓶中的并行维持。
将细胞培养物分开，使细胞浓度值恢复至最佳接种值，即0.7～1×108细胞/毫升，在此称为″传代″。在此浓度下，细胞将迅速达到约2.5×109细胞/毫升的浓度。
预扩增优选在完全培养基中进行，更优选IMDM，其含有2mM谷氨酰胺、浓度为2～20％，优选5％的胎牛血清(FBS)和细胞因子，优选白细胞介素，更优选IL-2或IL-15。优选，每隔48～72小时加入100IU/ml的IL-2。在均相体系中，扩增阶段用的培养基与预扩增阶段相同，但至少部分地将胎牛血清替换成人AB血清。该替换也可在细胞转入均相细胞培养体系之前，例如在预扩增阶段的最后一代进行。可用其它的培养基替代IMDM，例如RPMI、Ham’s-F12等等。优选无抗生素培养基。
优选含2mM谷氨酰胺无抗生素的IMDM培养基，此处称为“完全培养基”；可向其中补充FBS或人血清。
白细胞介素，优选IL-2或IL-15，每隔48～72小时加入细胞培养基中，至终浓度为50～150 IU/ml，更优选100 IU/ml。
细胞优选在包含5～12％CO2，优选10％CO2的空气混合物中，于37℃孵育。所有传代出现的细胞或培养基的手工操作均在无菌条件进行，例如Biohazard垂直层流罩超静台(class 100)。
根据特别优选的实施方案，预扩增培养物始于冷冻MCB[主细胞库(Master Cell Bank)]的培养管或小瓶，含有1×107～2×107细胞/管/毫升，其保存于液氮中，在37℃恒温水浴中解冻。
在层流罩超静台内，向培养小瓶内加入8-10倍体积的解冻溶液(含20％FBS的完全IMDM)。离心细胞(1500转/分，10分钟)。吸出上清液，向细胞沉淀中加入10毫升完全培养基，将重悬细胞转入T25摇瓶内。加入用完全培养基稀释至终浓度约为100IU/ml的IL-2。在倒置显微镜下观察，当所得细胞浓度达到该细胞占据整个摇瓶表面时，使细胞培养物在两倍体积的培养基中扩增(在两个T25摇瓶中扩增)。为此，加入等体积的新鲜培养基，将培养物分成相等的两瓶，使其恢复至最佳细胞浓度(接种细胞浓度)，通常为0.7～1×106细胞/毫升，其中每个摇瓶的体积与初始体积相当。
为保持培养基中最佳的气体交换，在T25摇瓶中最佳的细胞培养基体积为7～12毫升，优选10毫升；在T75摇瓶中为20～60毫升，优选40毫升；在T175摇瓶中为40～200毫升。上述体积为近似值，并被称为最佳细胞浓度条件。解冻后，通常3～7天，优选5天后，达到最佳细胞浓度。大约3天后，将细胞从T25摇瓶传至2个T75摇瓶中；如果T75摇瓶中还有剩余细胞，将其收集起来；根据上述指示浓度加入IL-2至新鲜的培养中。
大约3天后，将细胞从2个T75摇瓶传至2个T175摇瓶中。如果T75摇瓶中有剩余的细胞，用完全培养基冲洗收集，至终体积为40ml，并按比例加入IL-2。2-3天后，将细胞从2个T175摇瓶传至4个20ml的T175摇瓶，立即向其中加入相同体积的完全培养基和成比例的IL-2。大约2天后，将细胞从4个T175摇瓶传至8个T175摇瓶中。向每个T175摇瓶中加入约20毫升的完全培养基和成比例的IL-2。大约2天后，向8个T175摇瓶中加入约40毫升含2％～10％，优选4％～6％，更优选5％人血清的完全培养基和成比例的IL-2。2天后，向8个T175摇瓶中加入约80毫升含有成比例的IL-2的完全培养基。
最终的T175摇瓶收获体积通常为140-180毫升。预扩增阶段在约15天后结束，培养基中细胞数为0.9×109～1.1×109(该值通常相当于8个各含160毫升细胞悬液的T175摇瓶)，培养基含人血清终浓度为2％～5％，优选3％～4％；任选的，终浓度为0～5％，优选1.5％～3％的胎牛血清(FBS)。
从含FBS的培养基向含人血清培养基的传代，优选在摇瓶预扩增阶段的最后两代期间进行，优选T175，优选使用含人血清的新鲜培养基连续稀释含FBS的培养物。
向细胞工厂中接种细胞数为1.5～2.5×107/室，体积为细胞工厂最终容积的1/6～1/10，优选1/8。接种至最终容积为2升的10-室细胞工厂时，接种1.5～2.5×108于体积为200～330ml的培养基中，优选230～270毫升，立即加入同体积的新鲜完全培养基，其最多含10％，优选5％的人血清和细胞因子，优选白细胞介素，更优选IL-2或IL-15，最优选IL-2，终浓度80～120IU/ml，优选100IU/ml。
每隔3-5天，优选每隔4天，通常为细胞复制期间，加入完全培养基，体积相当于细胞工厂内所含有的培养基，使细胞继续扩增和生长，直至达最大终体积2升/10-室细胞工厂，细胞数为1.5～2.5×109。在细胞工厂中扩增TALL细胞需要加入最多含有10％，优选3～7％，更优选4～6％，最优选5％人血清的新鲜培养基。因此，在根据本发明的均相培养体系扩增阶段，优选不使用或较少使用胎牛血清。如果有痕量的FBS，其可能出现在本发明方法的末期，是用含有人血清的培养基连续稀释含有FBS培养基的结果。
简言之，根据一般方案方法，无论是在摇瓶中的预扩增阶段还是在均相体系中的扩增阶段，接种液中的细胞浓度均不低于0.7×106细胞/毫升(该值相当于每隔48～72小时将细胞培养物分成2份或3份所达到的值)，优选0.75×106/毫升。相反，在收获细胞前不久的最后培养阶段，细胞浓度不超过2×106，优选1.5×106/毫升。
根据本发明方法，在40-室细胞工厂中进行接种，其最大培养容积为8升，可供总数约8～10×109细胞生长于单一均相体系中，按比例计算出接种细胞的体积和数目。
根据本发明方法，由均相培养体系至少可生产一个含有最高治疗剂量，即2.5×109细胞的TALL细胞袋子(含1×108～2.5×109细胞的袋子)。因此，根据本发明另一个实施例，该方法还包括制备数目至少为1×109TALL淋巴细胞的冷冻袋，其特征在于所述TALL细胞由均相培养体系扩增。所用袋子具有可变的体积，因此可含有不同治疗剂量的细胞。优选使用冷冻和输注袋，更优选Baxter Cryocyte’s袋。
为制备治疗用细胞袋，将收获自细胞工厂的细胞置于50毫升无菌试管中，按照本领域已知方法，在β粒子加速器(电子回旋加速器)中照射。已经证实该方法可提供与传统来源如Cs137相同的粒子量。本方法使用电子回旋加速器具有下列优点即，它不是放射性的，并能对溶液产生均匀照射。照射后立刻离心细胞(1500转/分10分钟)。此时抽取细胞样品用于质量测试。
照射的细胞与最终的悬浮组份及无菌袋一起，置于层流罩超静台内。细胞重悬于冷冻液中，冷冻液由8～30毫升含Rimso 50(50％DMSO)(20％)和5％人白蛋白(80％)的培养基组成，更优选在10～25毫升完全培养基中包含TALL细胞剂量为1×108～2.5×109。优选地，袋中细胞浓度为106～108细胞/毫升。冷冻前照射细胞可于4℃贮存至多24小时。
通过在显微镜下Burker’s槽内计数，或其它本领域技术人员熟知方法，估计细胞浓度。在无菌条件下装袋。
袋子装满后立即封口，例如通过热封口，使装袋夹头转变成两个，优选三个部分，产生一个或优选两个含有细胞的小室，其中所述细胞称为本发明目的的″可信样品″。两个袋子的夹头部分含有的细胞等份是分开的，但来自相同的培养批次。
根据本发明一个优选实施例，夹头小室含有细胞悬液的体积为0.1～1毫升，优选0.3毫升，且细胞数目/小室至少可满足一系列的质量和/或无菌控制。可从小室内容易地抽取相当于可信样品的细胞，而无需打开整个袋子。
本发明的其它目的包括，含“可信样品”的小室、封接袋子夹头成为一个或多个部分的方法、可信样品袋的形成方法。
用于冷冻和输注的袋子于-80℃冷冻。
本发明的另一目的是提供制备数目至少为1×109的TALL淋巴细胞冷冻袋的方法，其中所述数目来自单一的均相培养体系。根据本发明方法扩增的细胞，可在从均相培养体系收获自的细胞冷冻之前进行质量控制，意在检查性质稳定性，例如免疫标记物的百分数和TALL细胞成品的生物学活性。根据本发明生产的细胞在冷冻后同样是稳定的。
优选按照本领域公知方法进行质量控制，包括以下测定-存活力，优选采用台盼蓝排除试验测定；必须是80％min；-生物学活性，优选采用细胞毒性试验测定(腺苷酸激酶测定)，尽管也可使用替代试验；以10/1的比率，靶细胞K562的裂解必须高于60％；-内毒素水平，优选采用Lymulus阿米巴状细胞裂解物比色试验测定；必须≤0.5 EU/mL；-免疫标记物表型，优选采用免疫荧光(FACS)进行测定，标记物即CD3+、CD8+、CD56+的给出值至少必须为90％；-增殖，优选采用3H-TdR掺入试验进行测定，72小时后测定的增殖必须至少等于背景值的两倍或更高。
根据本发明方法，均相体系培养细胞的测量参数例如免疫标记物百分率、生物学活性，以及代谢标记物活性例如细胞培养基中的葡萄糖水平，与多相体系培养细胞的测量参数相比，变化较少。
事实上，在细胞工厂均相培养体系中，TALL细胞表达的免疫标记物的百分比，对于CD3+和CD56+至少为90％，更优选至少95％，最优选至少98％；对于CD8+至少为90％，更优选至少93％，比摇瓶中培养的细胞低。表达CD56+标记物的值，其结果优选至少95％min，优选至少97％，在本发明方法过程中高于多相摇瓶体系培养的细胞。同时通过细胞毒性试验，测定了对靶细胞通常优选K562的生物学活性，其高于验收限度，且始终高于对照的70％，其中对照由适当数目裂解诱导完全的细胞组成。根据本发明另外的实施例，本发明包含TALL淋巴细胞，优选TALL-104，可根据本发明方法获得。
测定的葡萄糖水平也证明，相对于摇瓶培养的细胞，根据本发明方法在细胞工厂中培养的细胞代谢条件更均匀(图1)事实上，在摇瓶中测定的葡萄糖浓度为300～400mg/dl，在细胞工厂的测定值为350～380mg/dl。
根据一个简化的实施例，本发明方法包括按照本领域公知方法进行的任一TALL细胞培养物的预扩增阶段，包括接种2×107细胞/室于细胞工厂中，初始体积为细胞工厂最终容积的1/10～1/6，和细胞工厂中的细胞扩增阶段，优选10-室的细胞工厂(最终容积约2L)，共约2×108细胞接种于约250毫升中。
在本方法采用的条件下，优化了细胞工厂大规模扩增阶段最小接种浓度与扩增循环结束时最大收获浓度的比值。事实上，根据本发明方法，在扩增循环结束时细胞数目约增大10倍(从1.5～2.5×108细胞至1.5～2.5×109细胞)，而体积仅增大8倍。均相培养体系的更多优势在于1)消除细胞生长的多相性条件；2)减少手工操作次数因而减少污染可能性；3)减少工时和人员消耗。
根据本发明方法的另一优点在于，使用无抗生素培养基，其相对于多个摇瓶培养体系，减少了污染风险。
根据本发明方法另外的优点，是使用优选最大浓度为10％的人血清。因此，根据本发明方法，通过使用优选浓度为4～6％的人血清可获得良好的细胞扩增。
从而，通过施行细胞工厂的扩增阶段，治疗用TALL细胞袋的整个制备方法得以优化，并适合于大规模应用。
根据本发明TALL扩增方法的优点可概括如下i)质量控制减少至单个采样装置，其对应于单个生产装置(细胞工厂)；相反地，采用数目多很多的单个发酵装置在不同时间工作进行扩增容易增加污染风险，如此达到的扩增污染可能性增加；ii)使用有限数目的生物反应器结果节省大约30％时间，并降低25％成本。
应当指出，根据本领域已知的扩增这类细胞的方法，可由35个T175和体积为2.8L完全培养基，得到2.5×109数目的细胞，相当于约25个108细胞袋或1个2.5×109细胞袋。由此可见，采用根据本发明方法，可节约原材料(人血清外，培养基，细胞因子)高达约30％。
另一个优点来自对成品批次的控制数目，在本领域已知的多相体系中成品批次，最多含有1×108细胞，而在本发明描述的均相体系中生产的成品批次细胞数目多10倍。在实践中，这意味着控制数目低10倍。
实验实施例1.材料摇瓶Falcon，Beckton Dikinson；细胞工厂产品目录号164327或170009，Nunc A/S，丹麦；www.nuncbrand.com；培养基Iscove’s Modified Dulbecco Medium，Biowhittaker 12-722，补充谷氨酰胺；含谷氨酰胺和血清的CM(完全培养基)；胎牛血清Biowhittaker，美国；人血清，AB型，Biowhittaker；IL-2 Proleukin 1，Chiron；生理盐水磷酸盐缓冲液，Biowhittaker；
人白蛋白(5％)，Farma Biagini；RIMSO 50，Baxter；用于冷冻和输注的袋子，Cryocyte Baxter。
2.方法所有细胞培养均在Biohazard’s层流罩超静台内无菌的环境中进行。每次加入或抽取，均用异丙醇或火焰消毒管口入口。
2.1.培养基制备每批血清在56℃恒温浴中去补体1h。去补体的血清瓶保存于4℃，并在去补体后一个月内使用。
2.2.用于预扩增阶段的完全培养基500毫升的IMDM瓶中加入去补体的FBS(50毫升)；标明瓶子的批次。完全培养基保存于4℃，使用前加热至室温。该完全培养基在制备后一个月内使用。
2.3.用于在细胞-工厂中放大的完全培养基500毫升IMDM瓶中加入25毫升去补体的人血清AB。该培养基保存于4℃，使用前加热至室温。该完全培养基在制备后一个月内使用。
2.4.IL-2的制备白细胞介素(18×106IU/vial)重悬于20毫升PBS中，得到约9×105IU/ml。所得溶液用0.22um过滤器过滤，分成1毫升的等份装入小瓶。各等份保存于-80℃。
该溶液(1毫升)用完全培养基稀释得到104IU/ml的溶液，相应于2.2.节的培养基用于预扩增阶段，相应于2.3.节的培养基用于扩增阶段。将该溶液加入同样经培养基稀释(1/100)的细胞悬液中。
2.5.方法控制生物负载测定用于培养TALL细胞系的完全培养基中(IMDM+补充血清)的微生物污染。所得培养基经孔径0.45um的膜过滤，用无菌小刀移去滤膜并放入适当的培养基中，用于显示微生物污染(所用培养基为胰酶消化的大豆琼脂)。将滤膜置于培养皿中。于20-25℃孵育至少3天后，可检出霉菌的存在，30-35℃再孵育至少3天，可检出细菌的存在。肉眼观察培养皿，检查微生物的生长(最多100CFU)。
微生物的监控控制用于TALL处理的层流罩超静台，检查在操作过程中微生物(如果有)是否出现。在操作者处理细胞(倾倒、装袋)时，将TSB琼脂培养皿暴露于层流罩超静台内，操作完成后盖上盖子，并于20-25℃孵育至少3天，以检测霉菌的存在，于30-35℃孵育至少3天以检测细菌的存在。在摇瓶手工操作过程中两例采样发现有微生物，而在细胞工厂手工操作过程中没有检测到污染。
实施例1实验室规模的解冻和扩增制备解冻溶液，由补充有20％FBS的IMDM培养基组成，使用前保存于4℃。
从液氮罐中取出含冷冻细胞的安瓿，适当解冻，然后用解冻培养基稀释(1∶10)。以低转速离心细胞10分钟。沉淀重悬于10毫升完全培养基中，转入T25摇瓶，并加入IL-2至浓度为100IU/ml。
细胞在含10％CO2的环境中，于37℃孵育5天。
孵育5天后，将细胞分入(1∶2)含相同浓度白细胞介素2的新鲜培养基中，维持2天使其长至汇合。从摇瓶中轻轻地移出细胞，转入含相同浓度(100IU/ml)IL-2、终体积为20ml培养基的T75摇瓶中。约2-3天达到汇合后，使细胞再保持2天，然后在含IL-2、终体积为40ml培养基的T175摇瓶扩增。两天后，再加入40毫升白细胞介素完全培养基；使细胞再生长2天，将其分入(1∶2)另2个T175摇瓶中，终体积为80ml/T175。
在显微镜下观察细胞形态和浓度。然后将细胞加入5％完全培养基(含人AB血清的IMDM)中至终体积为150ml/摇瓶，按比例加入IL-2。将细胞分入(1∶2)数目相同的T175摇瓶中，终体积为150毫升。
实施例2.TALL细胞在miniPERM发酵罐和自旋摇瓶中的动态生长解冻细胞，在T25中培养扩增至数目为7×105cells/ml，接种于0.5L的自旋摇瓶或miniPERM中。
在T75摇瓶中进行对生长参数设置有意义的测定当细胞浓度达到至少1×106/ml时分开细胞。为维持较高的细胞存活力(90％min)和较高的细胞分裂速度，稀释的细胞不低于7×105细胞/毫升，细胞生长量不超过2×106/ml。在细胞浓度最大时，葡萄糖水平约320～380mg/ml。在T175中，终体积为80毫升时，得到浓度为1.25×106细胞/毫升，相当于总共约100×106细胞/摇瓶。要在冻/融期间具有较高生命力，估计细胞/管的最小值需高于1.2×107。还观察到，在对数生长期冷冻的细胞，解冻后9-10天内依次到达对数生长期，而冷冻于其它生长周期阶段的细胞呈现较长时间的滞后(10-12天)。
旋转摇瓶0.5L的旋转摇瓶具有300毫升的工作体积。接种1.5×107细胞；旋转设定为3转/分；48小时后测定细胞存活力等于50％。120小时后，所有细胞死亡。
此外，在MiniPERM(相对体积而言具有较高的表面积，用于扩增悬浮细胞如杂交瘤细胞的理想生物反应器)中，使用10％CO2，并采用以下特定条件进行了3个扩增试验
-在30ml培养基中接种7×107细胞，10转/分。48小时后细胞的存活力下降，4天后所有细胞死亡。在第二个试验中，旋转速度减少至5转/分。培养第3天，该细胞存活力是52％；第6天所有细胞死亡。在第三个试验中，接种量降低至3×107细胞，旋转速度减少至4转/分。虽然在培养第5天所有细胞死亡，但第2天的细胞存活力仍较高(80％)；这表明了旋转对于细胞存活的重要性。
初步的发酵试验均表明，在传统通常用于悬浮或无贴壁依赖性细胞的大规模生长条件下，TALL细胞不能生长。
实施例3.TALL在细胞工厂中的大规模扩增按照实施例1 T175中培养物中得到的细胞悬液(250ml)，约含0.8×106细胞/毫升，接种至10-室细胞工厂中；加入等量的完全培养基。4天后，加入完全培养基(500ml×3次)至总体积为2L。排空细胞工厂，转入250毫升的无菌管中，离心并用无菌PBS冲洗；再次离心回收管中细胞。接种8天后，从细胞工厂中回收的细胞约2.35×109。
在10-室细胞工厂典型的生产周期内，从单个MCB(主细胞库)的冻存管进行了72次接种和扩增。
总时间120天，细胞培养物总量144升。获得的细胞大约为1.44×1011。
表1表示分别由10-室细胞工厂和40-室细胞工厂发酵所获得的数据。
表1 10-室细胞工厂和40-室细胞工厂的产量
细胞工厂中的细胞与一个50毫升的无菌管相连，并在已知的β粒子加速器(电子回旋加速器)中进行照射。已经证实该方法可提供与传统来源如Cs137相同的粒子数。该方法使用电子回旋加速器具有下列优点即，它不是放射性的，并能对溶液产生均匀照射。
细胞袋的制备照射后立刻离心细胞(1500转/分10分钟)。于冷冻前抽取细胞样品用于质量试验，保存于4℃。
照射细胞与最终的悬浮组份及无菌袋一起，置于层流罩超静台内。根据治疗剂量所需的细胞数，将细胞重悬于冷冻液中，冷冻液由Rimso 50(50％DMSO)(20％)和5％人白蛋白(80％)组成。于显微镜下在Burker’s槽中进行细胞计数，在无菌条件下将袋子装至适当体积。袋子装满后，立刻将装袋夹头封接成三个部分；这样每个袋子形成一个可信样品。
从细胞工厂＞照射＞装袋，重复足够多次以获得该批次需要的细胞数目。
无菌控制在培养基上和层流罩超静台内连续进行生物负载无菌控制、微生物监控和支原体监控。
实施例4.成品控制以及实验室规模与大规模培养之间的比较葡萄糖水平的测定对收获细胞用于袋子制备的15个摇瓶(从35个摇瓶中选出，相当于细胞-工厂中的细胞数)样品中的葡萄糖水平进行了测定。如图1所示，葡萄糖浓度和细胞数目变化很大；相反地，在10-室细胞工厂中，采集后(6-10天后)葡萄糖呈现相同的值(约380mg/dl)，具有相同的细胞浓度(2×109/ml)。在摇瓶中得到的不同葡萄糖水平和不同细胞浓度，指示多相的代谢条件事实上，培养基中高水平的葡萄糖与细胞培养物较低的代谢活动有关，而低水平的葡萄糖对应于细胞培养物较高的代谢活动。
成品质量控制对照射细胞的控制列于表2中。右侧一栏反映该值的容许范围。
表2
存活力试验装袋前用100μl台盼蓝溶液稀释100μl细胞悬液进行测定。经适当稀释，通过在显微镜下Burker’s槽内对染色细胞计数进行控制。
生物学活性使用试剂盒ToxilightTM(BioWhittaker LT07-217)，对装袋前的细胞悬液进行细胞毒性测定。该方法以腺苷酸激酶的生物荧光测定为基础。当失去膜完整性时细胞释放出腺苷酸-激酶，在Mg++存在情况下，将底物ADP转变成ATP，从而容许其测定。通过向多孔微孔板内接种105K562靶细胞进行测定；加入根据发明方法制备的细胞，数量为106、5×105和2.5×105，至T/K(或效应细胞或/靶细胞)比值分别等于l0.5和2.5。
靶细胞孵育过夜后，根据本发明方法制备的细胞导致的K562裂解％，始终大于或等于含105超声裂解的K562细胞样品的最大值的70％。
内毒素在中性pH，使用LAL生色试验试剂盒，应用European Pharmacopoeia，第4版，2002，pp.140-145中描述的方法，对用上述用夹头制备的样品进行内毒素含量测定。
表型使用获自Molmed’s质量控制实验室的适当免疫标记物(CD3+、CD8+、CD56+)，通过免疫荧光法(FACS)对装袋前的细胞标记物进行表型测定。
表3-培养于摇瓶和细胞工厂的TALL细胞的收获细胞表型标记物
pre照射前；post照射后；avg平均值。
增殖试验通过测量氚化胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入确定没有TALL增殖。装袋前取出细胞悬液样品，在含有不同浓度完全培养基(IMDM+血清+IL-2)的微孔板内孵育4天。加入3H-TdR(2μCi/ml，50μl/孔)。于37℃孵育3hr后，测定放射活性。相应于TALL细胞的cpm必须小于或等于背景值的两倍。
表3显示分别培养于摇瓶和细胞工厂的细胞批次的有关增殖数据。
表4反映了(对不同的制备物)培养物照射后出现的免疫标记物、细胞存活力，无菌性和支原体污染(如果有)的有关测定数据。
表4.照射后TALL细胞标记物的测定
权利要求
1.一种用于TALL淋巴细胞扩增的扩增方法，其中在均相培养体系中培养至少1×109个细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述均相体系为细胞工厂。
3.权利要求2所述的方法，其中在均相体系中进行扩增之前，先在摇瓶中进行预扩增过程直至获得细胞数0.7～1×108。
4.权利要求3所述的方法，其中接种细胞浓度至少0.7×106细胞/毫升，优选0.75×106细胞/毫升，收获时浓度低于2×106细胞/毫升，优选低于1×106。
5.权利要求2所述的方法，其中均相体系为10-室装置。
6.权利要求1所述的方法，其中TALL淋巴细胞选自由选择性遗传改变的TALL-104、TALL-107、TALL-103/2细胞系组成的组。
7.权利要求所述6的方法，其中TALL为TALL-104淋巴细胞。
8.权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中细胞工厂扩增阶段的完全培养基含有最多10％，优选4～6％，更优选5％的人血清，可任选浓度为0～10％的胎牛血清，以及浓度为100/IU的白细胞介素。
9.权利要求8所述的方法，其中每隔48～90小时向细胞培养物中加入白细胞介素-2。
10.权利要求8所述的方法，其中均相体系中的细胞培养在无抗生素培养基中进行。
11.一种用于制备细胞数目至少为1×109的TALL淋巴细胞冷冻袋的方法，其特征在于其包含根据权利要求1-10所述的方法。
12.权利要求11所述的方法，其中沿装填夹头密封将袋子横向封接为至少两个部分，生成至少一个含体积为0.1～1毫升细胞培养物的取样小室，与袋中含有的培养物在空间上分隔开来，用于质量控制。
13.一种在均相培养体系中制备至少1×109治疗剂量的TALL淋巴细胞的方法，其中淋巴细胞的特征在于，CD3+和CD8+免疫标记物的表达为98％，优选≥99％，CD56+标记物表达至少为95％，优选≥97％。
14.权利要求13所述的方法，其中淋巴细胞为TALL-104。
15.权利要求13所述的方法，其中所述淋巴细胞的特征在于，通过在适当靶细胞中的细胞毒性试验，测定其生物学活性至少等于对照的70％。
16.权利要求1-10任意一项所述方法可获得的TALL淋巴细胞。
全文摘要
本发明涉及治疗用人淋巴细胞系的大规模扩增方法，由均相培养体系组成。本发明还涉及治疗剂量的均相培养淋巴细胞的制备。
文档编号A61K35/12GK1703506SQ200380100954
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月6日 优先权日2002年10月4日
发明者西尔维娅·特拉夏蒂, 玛丽亚·路易莎·诺利, 路易吉·卡韦纳吉, 纳迪娅·德贝纳尔迪 申请人:埃比奥吉恩药物股份公司