屎肠球菌kq2.6及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种屎肠球菌及其作为益生菌的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 肥胖是人体能量摄入和消耗失衡的结果，即能量摄入大于能量消耗，造成能量在 体内以脂肪的形式储存下来，体重明显增加形成肥胖。在正常情况下，人体能量的摄入与消 耗保持着相对的平衡，人体的体重也保持相对稳定。一旦遭到破坏，摄入的能量多于能量的 消耗，则多余的能量在体内以脂肪的形式贮存起来，日积月累，最终发生肥胖。肥胖的发生 与家庭、个人生活习惯、社会经济发展、文化背景等环境有关以及不良的饮食习惯、运动不 足等因素有关。
[0003] 肥胖症是一种人体的慢性病，它是人类目前面临的最容易被忽视，但发病率却在 急剧上升的一种疾病。在我国，患肥胖症的人数逐年增高。据估计，中国现有肥胖人群约 8000万人。肥胖不仅给人们带来自身形态的烦恼，导致生活质量下降。肥胖症还与糖尿病、 高血压、高脂血症、高尿酸血症、缺血性心脑疾病、癌症、变形性关节炎、月经异常、妊娠和分 娩异常等很多疾病有明显的关系，而且可增加死亡的危险性。肥胖症已成为我国主要致死、 致残的病因。为此，消除肥胖疾病，已经成为医学界刻不容缓的任务。
[0004] 益生菌是一类通过改善宿主体内的微生态平衡进而促进宿主健康的单一或混合 的活的微生物制剂。益生菌对于身体健康，尤其是肠道系统的健康至关重要。益生菌与人 类的关系非常密切，可以讲"如果没有益生菌的存在，人类的健康就难以保证，生存就有困 难"。
[0005] 益生菌大体上可以分成三大类：（1)乳酸杆菌类（如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、詹 氏乳杆菌、拉曼乳杆菌、短乳杆菌、保加利亚乳杆菌等）；（2)双歧杆菌类（如长双歧杆菌、短 双歧杆菌、卵形双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、青春双歧杆菌等）；（3)革兰氏阳性球菌（如粪链 球菌、乳球菌、中介链球菌等）。此外，还有一些酿酒酵母菌、布氏酵母菌、部分霉菌及非致命 性大肠杆菌亦可归入益生菌范畴。益生菌可通过在适当丰富的培养基或选择性培养基上反 复培养的方法，从人和动物的口腔、肠道内容物和粪便中分离得到。近年来随着益生菌研宄 的不断深入，人们已经从各种来源筛选并鉴定了多种益生菌。据报道，我国每年就减肥一项 将花费国人600亿元。为了减少肥胖人群的经济负担和对健康的需求，需要一些能够标本 兼治，经济实惠的减肥产品。因此本课题组从新鲜孔雀排泄物出发，希望可以筛选出具有抑 菌、减肥功效的益生菌，为益生菌相关产品的开发打下基础。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一株新菌株一屎肠球菌（Enterococcus faecium)KQ2. 6,以及 该菌株或其发酵产物作为益生菌的应用。该菌株或其发酵产物除具有抑制金黄色葡萄球 菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、 化脓性链球菌、铜绿假单胞菌、白色念球菌等病源微生物，还具有抑制小鼠体重增加的功 效，可用于制备益生菌制剂或减肥药物。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一株新菌株一屎肠球菌（Enterococcus faecium) KQ 2. 6,保藏于中 国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年05月12日，保藏编号为CCTCC NO :M 2014197， 保藏地址为中国武汉武汉大学，所述屎肠球菌KQ 2. 6具有抵抗环境压力的耐受性，所述耐 受性为抗生素耐受性、酸耐受性、胃蛋白酶、胰蛋白酶耐受性或盐耐受性。
[0009] 本发明还提供一种益生菌制剂，所述益生菌制剂包含药用辅料和所述屎肠球菌KQ 2. 6经发酵培养获得的上清液。
[0010] 进一步，优选所述药用辅料为羧甲基纤维素钠或羧甲基淀粉钠。
[0011] 更进一步，所述的益生菌制剂中屎肠球菌KQ 2. 6的含量为5X IO7?5X10 12CFU/ mL。所述益生菌制剂中药用辅料以质量浓度1 %水溶液的形式加入，更优选益生菌制剂为： 将质量浓度1 %羧甲基纤维素钠水溶液与屎肠球菌KQ 2. 6发酵上清液混合成5X IO7? 5 X 1012CFU/mL 菌悬液（优选 5 X 1012CFU/mL)。
[0012] 本发明所述益生菌制剂的使用量为IO7?10 12CFU/kg体重。
[0013] 本发明所述屎肠球菌KQ 2. 6经发酵培养获得的上清液按如下方法制备：
[0014] ⑴斜面培养
[0015] 将屎肠球菌KQ 2. 6接种至斜面培养基，37°C培养1天，获得斜面菌体；每升斜面培 养基终浓度组成：蛋白胨l〇g，牛肉膏5. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，葡萄糖20g，硫酸镁0. 20g，硫 酸锰0· 050g，酵母浸粉4. 0g，柠檬酸三铵2. 0g，乙酸钠5. 0g，吐温-801. 0g，琼脂20g，蒸馏 水 1000mL，pH 6.2 ;
[0016] ⑵发酵培养
[0017] 从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至发酵培养基，37°C培养12?24小时，获得发 酵培养液，将发酵培养液离心，取上清液，即为屎肠球菌KQ2. 6菌液；所述发酵培养基终浓 度组成为：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏5. 0g/L，磷酸氢二钾2. 0g/L，葡萄糖20g/L，硫酸镁0. 20g/ L，硫酸锰(λ 050g/L，酵母浸粉4 0g/L，柠檬酸三铵2. 0g/L，乙酸钠5. 0g/L，吐温-80L 0g/L， 溶剂为蒸馏水，pH 6. 2。
[0018] 本发明还涉及一种所述屎肠球菌KQ 2. 6在制备减肥药物中的应用，所述的减肥 药物包含可药用辅料和所述屎肠球菌KQ 2. 6经发酵培养获得的上清液或上清液浓缩干燥 后的菌粉。
[0019] 所述可药用辅料包括羧甲基纤维素钠或羧甲基淀粉钠。
[0020] 所述减肥药物中屎肠球菌KQ 2. 6含量为5 X IO7?5 X 10 12CFU/g。
[0021] 本发明优选所述减肥药物为：将屎肠球菌KQ 2. 6经发酵培养获得的上清液减压 浓缩至浓度5. 0 X IO8?5. 0 X 10 13CFUAiL的浓缩液（优选5. 0 X 101(lCFU/ml)，然后将可药用 辅料（优选羧甲基纤维素钠）与浓缩液混合均匀，放入冷冻干燥机中_40°C干燥，制备得到 含菌量 5. OX IO7?5. OX 10 12CFU/g 的减肥药物（优选 5. OX 10nCFU/g)。
[0022] 本发明所述减肥药物的使用量为IO7?10 12CFU/kg体重，每天使用2次，服用60? 90天为一疗程，服用1?2疗程体重减轻3?10kg。
[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：首次从孔雀新鲜排泄物中分离 得到一株新菌株一屎肠球菌KQ 2. 6,该菌株不仅对环境压力具有良好的耐受性，而且该菌 株或其发酵产物对常见病原微生物具有抑制作用。另外，小鼠安全性实验表明该菌株是安 全性的。该菌株还具有抑制小鼠体重增加的功效。本发明显示出该菌株在食品等领域具有 良好的应用前景。 (四）
【附图说明】
[0024] 图1屎肠球菌KQ 2. 6耐酸性。
[0025] 图2屎肠球菌KQ 2. 6高盐耐受性。
[0026] 图3屎肠球菌KQ 2. 6胃蛋白酶耐受性。
[0027] 图4屎肠球菌KQ 2. 6胰蛋白酶耐受性。
[0028] 图5屎肠球菌KQ 2. 6粘附性能。
[0029] 图6屎肠球菌KQ 2. 6发酵上清液对化脓性链球菌的抑菌作用。
[0030] 图7小鼠急毒性试验脏器组织切片：A为肝，B为肾，C为脾。
[0031] 图8小鼠亚急毒性试验脏器组织切片：A为肝，B为肾，C为脾。
[0032] 图9小鼠亚急性毒性试验器官指数。 (五）
【具体实施方式】
[0033] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0034] 实施例1菌株分离纯化及鉴定
[0035] ( -）操作
[0036] 1、菌株分离纯化
[0037] 采用无菌操作，取健康孔雀新鲜排泄物（I. Og)置于无菌生理盐水的试管中，充分 震荡均匀，形成混悬液。取100 μ L混悬液于IOmL胆盐液体培养液中，置于37°C培养24h ; 然后吸取0. 50mL培养液于盛有4. 5mL无菌生理盐水的试管中，此稀释度为ΚΓ1，重复以上 过程做10倍比稀释，至KT5稀释浓度，吸取各稀释度下0. IOmL菌液滴于2. 0% CaCO 3-MRS 固体培养基平板上，涂布均匀后，平板置于37°C培养24h。挑取白色圆形规整的菌落，在MRS 固体培养基上进行划线分离培养，获得初选菌株，置于4°C冰箱保存备用。
[0038] 将初选菌株接种到MRS固体培养基中，37°C培养24h后，进行过氧化氢酶试验。筛 选革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株，并对通过上述试验的菌株进行抵抗外 界压力耐受性评价，筛选得到一株活性最强的菌株，命名为菌株KQ 2. 6。将菌株KQ 2. 6转 接到MRS液体培养基中，放于37°C培养24h后，取600 μ L菌液加入已加有400 μ L、体积浓 度为50%甘油（已灭菌）的冻存管中混合，将冻存管放入-20°C冰箱保存，进行菌种保存。 本发明将重点介绍菌株KQ 2.6的筛选、鉴定及性能评价。
[0039] 在上述筛选的方法中，涉及到培养基如下：
[0040] 每升MRS固体培养基组成：蛋白胨10g，牛肉膏5. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，葡萄 糖20g，硫酸镁0· 20g，硫酸锰0· 050g，酵母浸粉4. 0g，柠檬酸三铵2. 0g，乙酸钠5. 0g，吐 温-801. 0g，琼脂 20g，蒸馏水 lOOOmL，pH 6. 2。
[0041] 每升MRS液体培养基组成：蛋白胨10g，牛肉膏5. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，葡萄 糖20g，硫酸镁0· 20g，硫酸锰0· 050g，酵母浸粉4. 0g，柠檬酸三铵2. 0g，乙酸钠5. 0g，吐 温-801. Og，蒸馏水 lOOOmL，pH 6· 2。
[0042]