专利名称：一种屎肠球菌制剂及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种屎肠球菌制剂及其生产工艺。
背景技术：
饲料中添加抗生素对集约化畜牧业发展做出重大贡献的同时，其产生的副作用如内源性感染和二重感染、耐药性的产生、肠道正常菌群的破坏和畜产品及环境中的残留等对养殖业、动物以及人类食品安全带来严重威胁。益生素就是以活的微生物为主，动物摄入一定量后，在胃肠道特定部位有一定数量的菌株能够粘附、定植和生长，主要通过调节肠道微生物菌群结构和平衡，对动物生长和健康起到有益作用的制剂，是一种良好的的替代抗生素的新型绿色安全添加剂。屎肠球菌(Enterococcus Faecium)广泛存在于自然界和畜禽胃肠道内，是一种有益微生物，普通的屎肠球菌因其耐酸、耐高温等特性较差，未能在饲料添加剂中广泛应用。 因此，根据目前畜牧业的需求，筛选一株耐酸耐高温具有益生特性的屎肠球菌具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种屎肠球菌制剂。本发明提供的制剂，其活性成分为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058。本发明的另一个目的是提供一种制备上述制剂的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)发酵屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康 80 CGMCC No. 5058，离心收集沉淀， 得到菌泥；2)将步骤1)得到的菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、无菌水混勻乳化，即得到屎肠球菌制剂。在上述方法中，步骤1)中，所述发酵的温度为所述发酵的温度为15°C -45°c，所述发酵的时间为10小时-18小时，所述发酵所需的PH值为4. 5-8. 6，所述发酵的压力为 0.OlMpa-O. 03Mpa ；上述发酵的温度具体为15°C、37°C或45°C，所述发酵的时间为10小时、12小时或 18小时，所述发酵所需的pH值具体为6. 4-6. 6 ；上述发酵的搅拌速度为80rpm/min-120rpm/min，具体可为 80rpm/min、IOOrpm/ min 或 120rpm/min ；在上述方法中，步骤2)中，所述菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水的配比为 3X10ncfu-8X10ncfu 0. 5g_2. 5g 0. Ig-Ig 0. Ig-Ig IOg ；上述菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水的配比具体为3 X IO11Cfu, 5X IO11Cfu 或 8X IO11Cfu 0.58、18或2.58 0. lg、0.5g 或 Ig 0. lg、0.3g 或 Ig IOgo
在上述方法中，步骤1)中，所述发酵采用的培养基按照如下方法制备将蔗糖、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4, KH2PO4 · 3H20、MnSO4, MgSO4 · 7H20和水混勻，得到培养基，所述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度为35g/L-45g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度为5g/ L-15g/L，所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度为15g/L-25g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度为lg/L-5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述发酵培养基中的浓度为0. 5g/ L-1. 5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度为0. 01g/L-0. 03g/L，所述MgSO4 ·7Η20在所述发酵培养基中的浓度为0. lg/L-0. 6g/L。在本发明的实施例中，上述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度具体为35g/L、40g/L 或45g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度具体为5g/L、10g/L或15g/L，所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度具体为15g/L、20g/L或25g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度具体为lg/L、4g/L或5g/L，所述KH2PO4 · 3H20在所述发酵培养基中的浓度具体为 0. 5g/L、lg/L或1. 5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度具体为0. 01g/L、0. 02g/L或 0. 03g/L，所述MgSO4 · 7H20在所述发酵培养基中的浓度具体为0. Ig/L、0. 4g/L或0. 6g/L ；上述方法中，所述离心力为1800g_2200g，所述离心力具体为1800g、2000g或 2200g ；所述离心的时间为5min-10min，所述离心的时间具体为5min、8min或IOmin ；在上述方法中，步骤2)中，所述乳化的温度为25°C 48°C，所述乳化的时间为 25min_45min ；在上述方法中，所述乳化的温度具体为251、271或观1，所述乳化的时间为 25min、30min 或 45min。在上述方法中，在所述步骤2~)后，在所述乳化后还包括将乳化产物干燥得到屎肠球菌制剂的步骤，其中干燥采用低温真空干燥箱在低温温度27-50°C，真空度-0. 096Mpa条件下进行。由上述的方法制备的屎肠球菌制剂也是本发明保护的范围。上述的屎肠球菌制剂在作为动物饲料添加物中的应用也是本发明保护的范围。上述的屎肠球菌制剂在制备动物饲料中的应用也是本发明保护的范围。上述的屎肠球菌制剂在促进动物生长中的应用也是本发明保护的范围。在上述应用中，所述促进动物生长为如下1)或2)1)提高猪平均日增重、提高猪平均日采食量、提高猪皮毛指数、降低猪料肉比和/ 或降低猪腹泻率；2)提高鸡平均日增重和/或提高平均日采食量；在上述应用中，所述动物为猪或鸡。本发明的实验证明，本发明通过分离、鉴定、筛选，得到屎肠球菌康80，其抗逆性强、抗杂菌能力强、具有益生特性，本发明将其进行乳化制备得到屎肠球菌制剂，可以作为添加剂用于制备动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等各种动物。该饲料具有与抗生素饲料类似的功能，但无抗生素饲料的副作用。本发明的屎肠球菌主要作为动物饲料的添加剂，可替代现有动物日粮中的抗生素，调节动物肠内微生态平衡，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物生长和提高饲料转化率、提高断奶仔猪以及生长育肥猪的生产性能。本发明的屎肠球菌对防治动物消化系统疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，所以将之作为饲料添加剂应用在饲料中能起到抗病促生长的作用。同时， 本发明的屎肠球菌无耐药性和药物在动物产品中残留，不会对人类的健康产生潜在的危害，是一种有前途的绿色饲料添加剂。上述提到的菌株康80于2011年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5058，其分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)。
图1为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80的生长曲线图2为饲料样品中乳酸菌16S rRNA基因序列系统发育树图3为屎肠球菌发酵生产流程图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的培养基如无特殊说明配方如下1、MRS肉汤培养基蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三氨2g，七水硫酸镁0. 2g，四水硫酸锰0. 05g,酵母粉4g，用蒸馏水定容至1L。2、MRS琼脂培养基IL MRS肉汤培养基中加琼脂15g。3、麦康凯培养基月示胨3g，猪胆盐5g，中性红0. 025g，蛋白胨17g，乳糖10g，结晶紫0. OOlg，氯化钠5g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L。4、Ml7 培养基大豆蛋白胨5. Og,酵母提取物5. Og,酪蛋白胨5g，抗坏血酸0. 5g，牛肉浸膏2. 5g， β -甘油磷酸二钠19g，MgS04 · 7H20 0. 25g，琼脂15g，用蒸馏水定容至IL0实施例1、屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80的分离及鉴定本发明的屎肠球菌是从饲料样品中提取、分离、筛选、纯化得到的。(一 )屎肠球菌康80 (NFER-5)的分离与纯化1. 1菌株的分离培养取Ig健康断奶仔猪粪便于装有9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡器震荡混勻，即为1 10稀释液，再取稀释液进行十倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各ImL涂布于含有IOppm放线菌酮的MRS琼脂培养基及M17琼脂培养基，37°C厌氧培养48 72h，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的特征单菌落于MRS液体培养基中，进行划线分离纯化。 观察肉汤是否变浑浊，有浑浊的放置4°C冰箱贮藏备用。1.2革兰氏染色用无菌注射器吸取少量MRS肉汤培养物，滴在载玻片上，在酒精灯火焰上轻轻烘
6干固定。滴加结晶紫染色液，染lmin，水洗；滴加革兰氏碘液媒染，作用lmin，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮95%乙醇=3 7)脱色30s，水洗；滴加沙黄染色液复染ImindK 洗，待干，在普通光学显微镜上观察，菌体呈红色为阴性，紫色的为阳性。呈革兰氏阳性形态一致的杆菌，进一步进行接触酶试验。1. 3接触酶试验做MRS斜面培养基，取培养物约0. 2mL注入装有MRS琼脂培养基斜面，5 % C02培养箱，37°C培养Mh，长出菌落后，将3%过氧化氢溶液滴加到菌落上，若没有气泡产生说明是阴性，若有气泡产生说明是阳性。通过MRS培养基厌氧培养的培养物经革兰氏染色阳性和接触酶试验阴性可初步认为是乳酸菌属(Lactobacillus)。3份饲料样品经分离纯化，结合革兰氏染色和接触酶试验，共分离出5株乳酸菌， 其中杆菌3株，球菌2株，并分别命名为NFER-1、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5。( 二 )、抗逆性选育与生物学特性研究1. 1耐热性能选育将上述筛选的5 株待测菌株 NFER-I、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5 按 2 % (ν/ ν)的接种量接种到MRS液体培养基中，分别于60°C、70°C、80°C水浴锅内处理IOmin后测定其活菌数，37°C恒温培养24h后观察结果，比较其在各温度下处理前与处理后的活菌数。存活率的计算公式为S 热=Ii1Ai0;S热为分别经过60°C、70°C、8(rC处理后的屎肠球菌存活率；Iitl为加热处理前每毫升活菌数；叫为加热处理IOmin后每毫升活菌数。结果如表1所示，从表1中可以看出，NFER-2，NFER-4，NFER-5在70°C热处理IOmin 后还有一定活菌数，且NFER-5浓度高达1. 72X 105,且NFER-5在80°C处理IOmin后仍有较高活菌数，浓度为1. OOX 104。而NFER-l，NFER-3在70°C处理IOmin之后无活菌，证明该两株菌株不耐热。一般仔猪饲料的制粒温度为70°C 85°C之间，耐高温之后存活率低也是乳酸菌作为饲料添加剂的主要限制性因素之一。从耐热存活率看，本试验选育的发酵乳酸杆菌可以耐受制粒时的高温，作为饲料添加剂将会有较好的前途。选取NFER-2，NFER-4，NFER-5 进行下一步筛选。表1耐热试验结果
权利要求
1.一种屎肠球菌制剂，其活性成分为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058。
2.一种制备权利要求1所述的制剂的方法，包括如下步骤1)发酵屎肠球菌(EnterococcusFaecium)康80 CGMCC No. 5058，离心收集沉淀，得到菌泥；2)将步骤1)得到的菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水混勻乳化，即得到屎肠球菌制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述发酵的温度为15°C _45°C，所述发酵的时间为10小时-18小时，所述发酵所需的PH值为4. 5-8. 6，所述发酵的压力为0. OlMpa-O. 03Mpa ；所述发酵的温度具体为15°C、37°C或45°C，所述发酵的时间为10小时、12小时或18小时，所述发酵所需的PH值具体为6. 4-6. 6 ；步骤2)中，所述菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水的配比为SxiO11Cfu-Sx IO11c fu 0. 5g-2. 5g 0. Ig-Ig 0. Ig-Ig IOg ；所述菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水的配比具体为SxiollCfiuSxio11Cfu或 8 X IO11Cfu 0. 5g、lg 或 2. 5g 0. lg、0. 5g 或 Ig 0. lg、0. 3g 或 Ig 10g。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述发酵采用的培养基按照如下方法制备将蔗糖、蛋白胨、酵母粉、 K2HPO4^KH2PO4 -3H20,MnS04,MgSO4 ·7Η20和水混勻，得到培养基，所述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度为35g/L-45g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度为5g/L-15g/L，所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度为15g/L-25g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度为lg/L-5g/L，所述KH2PO4 ·3Η20在所述发酵培养基中的浓度为0. 5g/L_l. 5g/L，所述MnSO4 在所述发酵培养基中的浓度为0. 01g/L-0. 03g/L，所述MgSO4 · 7H20在所述发酵培养基中的浓度为 0. lg/L-0. 6g/L。所述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度具体为35g/L、40g/L或45g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度具体为5g/L、10g/L或15g/L，所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度具体为15g/L、20g/L或25g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度具体为lg/L、4g/ L或5g/L，所述KH2PO4 ·3Η20在所述发酵培养基中的浓度具体为0. 5g/L、lg/L或1. 5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度具体为0. 01g/L、0. 02g/L或0. 03g/L，所述MgSO4 ·7Η20 在所述发酵培养基中的浓度具体为0. Ig/L、0. 4g/L或0. 6g/L ；所述离心力为1800g-2200g，所述离心力具体为1800g、2000g或2200g ；所述离心的时间为5min-10min，所述离心的时间具体为5min、8min或IOmin ；步骤2)中，所述乳化的温度为25°C 48°C，所述乳化的时间为25min-45min ； 所述乳化的温度具体为25°C、27°C或^°C，所述乳化的时间为25min、30min或45min。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于在所述步骤2、后，在所述乳化后还包括将乳化产物干燥得到屎肠球菌制剂的步骤。
6.由权利要求2-5中任一所述的方法制备的屎肠球菌制剂。
7.权利要求1屎肠球菌制剂或权利要求6所述的屎肠球菌制剂在作为动物饲料添加物中的应用。
8.权利要求1屎肠球菌制剂或权利要求6所述的屎肠球菌制剂在制备动物饲料中的应用。
9.权利要求1屎肠球菌制剂或权利要求6所述的屎肠球菌制剂在促进动物生长中的应用。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于 所述动物为猪或鸡。
全文摘要
本发明公开了一种屎肠球菌制剂及其生产工艺。本发明提供的制剂，其活性成分为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80 CGMCC No.5058。本发明的实验证明，本发明通过分离、鉴定、筛选，得到屎肠球菌康80，其抗逆性强、抗杂菌能力强、具有益生特性，本发明将其进行乳化制备得到屎肠球菌制剂，可以作为添加剂用于制备动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等各种动物。
文档编号A23K1/16GK102391962SQ20111034425
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者丁修良, 宋青龙, 王劲松, 谯仕彦 申请人:北京龙科方舟生物工程技术中心