专利名称：一种人脐带华通氏胶组织块冻存保护液的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人脐带华通氏胶组织块的冻存保护液。
背景技术：
人脐带华通氏胶(Wharton's Jelly)内的细胞具有能自我更新和多向分化、增殖能力强等干细胞的特征，我们称之为脐带间充质干细胞(huMSCs)。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，是一种低免疫原性的干细胞，具有支持造血和促进干细胞植入、调控免疫等特点，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的理想种子细胞。脐带间充质干细胞因其来源广泛，易获得，并具有间充质干细胞的所有特性，日益受到人们的关注，越来越多的人开始储存脐带间充质干细胞以为将来不时之需。冻存保护液的配方及冻存的操作方案直接影响储存的脐带华通氏胶中脐带间充质干细胞的质量，对将来的细胞移植效果至关重要。细胞或者组织的冷冻保存有几个关键性的环节冷冻保护剂的选择和组合，各种冷冻保护剂的配比，冻存的步骤，冻存温度及复苏温度。目前，脐带间充质干细胞的冻存方法多采用传统的细胞冷冻方法，细胞冷冻主要采用含有渗透性冷冻保护剂的冻存保护液，作用是降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻冷冻过程中细胞的损伤。通常情况下，人们选择单一的渗透性冷冻保护剂二甲基亚砜冻存干细胞，冻存后复苏后会有冻存保护液的残留，临床使用残留冻存保护液二甲基亚砜的干细胞，有较高的毒副作用，易造成恶心、呕吐、腹痛等不良反应。
发明内容
本发明的目的是采用一种由基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂组成的直接对人脐带华通氏胶组织块进行长期安全冷冻储存的冻存保护液，冻存效果好，细胞损伤少，冻存保护液残留低，毒副作用小，临床使用时对人体无伤害。为了达到上述目的，本发明的一种人脐带华通氏胶组织块冻存保护液，IL的体积中包含乙二醇0.8-1. 2mol、二甲基亚砜0.4-0. 6 mol、蔗糖0. 1-0. 3 mol、自体脐血血清 100-200ml、余量为培养液 DMEM/F12。进一步地，一种人脐带华通氏胶组织块冻存保护液，IL的体积中优选包含乙二醇 0.9-1. 1 mol、二甲基亚砜 0. 4-0. 5 mol、蔗糖 0. 1-0.2 mol、自体脐血血清 100_150ml、余量为培养液DMEM/F12。本发明采用自体脐血血清、培养液DMEM/F12作为基础液，能够保证组织内细胞的渗透平衡，尤其是采用了源于同一个体的自体脐血血清作为基础液为组织块提供养分，自体脐血血清简单易得，临床容易实现，最大限度保证了冻存过程中组织块内的细胞环境与体内环境一致，冻存效果好；采用乙二醇、二甲基亚砜作为渗透性冷冻保护剂，可以透过细胞膜渗透到细胞内，减少冷冻时细胞内冰晶的形成，其浓度都处在较低的水平上，最大限度降低了冻存保护液的毒性；采用蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂，其价格便宜，较为常见，分子量大不能渗透到细胞内，很少的一部分就能大大增加溶液的粘度，使细胞脱水，缓解细胞冻存时细胞膜内外的渗透压，减少冷冻时细胞的冰晶形成，且对干细胞无毒性。本发明改变传统含单一冷冻保护剂的冻存保护液，采用对人脐带华通氏胶组织块直接冻存的含多种冷冻保护剂的冻存保护液，冻存效果好，细胞损伤少，最大限度降低冻存保护液在组织块复苏后细胞内的残留，毒副作用小，临床使用时对人体无伤害，能为临床上提供较高质量的脐带间充质干细胞。
图1为经此冻存保护液冷冻保存148天的脐带华通氏胶组织块，培养出的Pl代人脐带间充质干细胞生长状态图2为经此冻存保护液冷冻保存148天的脐带华通氏胶组织块，培养出的Pl代人脐带间充质干细胞的生长曲线图3为经此冻存保护液冷冻保存148天的脐带华通氏胶组织块，培养出的Pl代人脐带间充质干细胞的成脂诱导鉴定图4为经此冻存保护液冷冻保存148天的脐带华通氏胶组织块，培养出的Pl代人脐带间充质干细胞的成骨诱导鉴定图。
具体实施例方式通过以下实施例对本发明详细说明，但本发明的保护范围不局限于实施例列出的范围。实例一
取500ml的培养液DMEM/F12加入蔗糖0.1 mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的自体脐血血清IOOml，4°C预冷的乙二醇0. 8mo 1,4°C 预冷的二甲基亚砜0. 4mol，补加培养液DMEM/F12至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。实例二
取500ml的培养液DMEM/F12，加入蔗糖0. 3mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的自体脐血血清200ml，4°C预冷的乙二醇1. 2mol，4°C 预冷的二甲基亚砜0. 6mol，补加培养液DMEM/F12至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。实例三
取500ml的培养液DMEM/F12，加入蔗糖0. 2mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的自体脐血血清150ml，4°C预冷的乙二醇1 mol，4°C 预冷的二甲基亚砜0. 5mol，补加培养液DMEM/F12至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。以下是对最佳实例一的冻存保护液冷冻保存脐带华通氏胶效果的测试
经此冻存保护液冷冻保存148天的脐带华通氏胶组织块，培养15天后，PO代细胞总数为2. 58 XlO5/克，Pl代人脐带间充质干细胞融合至80-90%，将其置于倒置显微镜下拍照， 细胞形状为短梭形，大小均一，排列整齐，如图1所示。实验组以此冻存保护液常规冷冻保存脐带华通氏胶组织块148天，对照组以含 10%DMS0的培养液DMEM/F12作为冷冻保护液，采用同样方法进行冷冻保存，经冷冻保存的脐带华通氏胶组织块培养出Pl代人脐带间充质干细胞，以MTT方法绘制生长曲线，生长曲线显示在培养同样的时间下，实验组培养出的细胞的OD值高于对照组培养出的细胞，即实验组培养出的细胞增殖能力优于对照组培养出的细胞，如图2所示。经此冻存保护液冷冻保存148天的脐带华通氏胶组织块，培养出Pl代人脐带间充质干细胞，以lxl04/ml的细胞浓度接种于M孔培养板中，0. 5ml/孔；细胞融合至60_80%， 换成hvitrogen公司的成脂诱导完全培养基，0. 5ml/孔；每3_4天全量更换诱导培养液； 诱导14天后，油红0染色后拍照，可见细胞内有脂滴产生，如图3所示。经此冻存保护液冷冻保存148天的脐带华通氏胶组织块，培养出Pl代人脐带间充质干细胞，以lxl04/ml的细胞浓度接种于M孔培养板中，0. 5ml/孔；细胞融合至60_80%， 换成hvitrogen公司的成骨诱导完全培养基，0. 5ml/孔；每3_4天全量更换诱导培养液； 诱导7天后，茜素红染色后拍照，可见有大量钙结节产生，如图4所示。
权利要求
1.一种人脐带华通氏胶组织块冻存保护液，IL的体积中包含 乙二醇0. 8-1. 2mol二甲基亚砜0.4-0. 6mol脐血血清100-200ml蔗糖0. 1-0. 3mol余量为培养液DMEM/F12。
2.根据权利人要求1所述的一种人脐带华通氏胶组织块冻存保护液，IL的体积中优选包含乙二醇0. 9-1. Imol二甲基亚砜0.4-0. 5mol脐血血清100-150ml蔗糖0. 1-0. 2mol余量为培养液DMEM/F12。
全文摘要
本发明公开了一种人脐带华通氏胶组织块冻存保护液，1L的体积中包含乙二醇0.8-1.2mol、二甲基亚砜0.4-0.6mol、蔗糖0.1-0.3mol、自体脐血血清100-200ml、余量为培养液DMEM/F12。本发明采用自体脐血血清、培养液DMEM/F12作为基础液为组织块提供养分，保证细胞内外的渗透平衡，保证组织块内的细胞的环境与体内环境相近，冻存效果好；采用低浓度的乙二醇、二甲基亚砜作为渗透性冷冻保护剂，使冻存保护液对细胞的毒性减小；采用蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂，增加溶液粘度，缓解细胞冻存时细胞膜内外的渗透压。本冻存保护液直接对人脐带华通氏胶组织块冻存，冻存效果好，细胞损伤少，能够为临床提供较高质量的脐带间充质干细胞。
文档编号A01N1/02GK102428910SQ20111034342
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者宋云庆, 李伟, 杨兵, 欧阳溪, 胡祥 申请人:江苏省北科生物科技有限公司