专利名称：人脐带华通氏胶组织块冻存保护液的制作方法
技术领域：
本发明涉及人脐带华通氏胶组织块的冻存保护液。
背景技术：
人脐带华通氏胶(Wharton's Jelly)内的细胞具有能自我更新和多向分化、增殖能力强等干细胞的特征，我们称之为脐带间充质干细胞(huMSCs)。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，是一种低免疫原性的干细胞，具有支持造血和促进干细胞植入、调控免疫等特点，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的理想种子细胞。脐带间充质干细胞因其来源广泛，易获得，并具有间充质干细胞的所有特性，日益受到人们的关注，越来越多的人开始储存脐带间充质干细胞以为将来不时之需。冻存保护液的配方及冻存的操作方案直接影响储存的脐带华通氏胶中间充质干细胞的质量，对将来的细胞移植效果至关重要。 细胞或者组织的冷冻保存有几个关键性的环节冷冻保护剂的选择和组合，各种冷冻保护剂的配比，冻存的步骤，冻存温度及复苏温度。目前，脐带间充质干细胞的冻存方法多采用传统的细胞冷冻方法，细胞冷冻主要采用含有渗透性冷冻保护剂的冻存保护液，作用是降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻冷冻过程中细胞的损伤。通常情况下，人们选择单一的渗透性冷冻保护剂二甲基亚砜冻存干细胞，冻存后复苏后会有冻存保护液的残留，临床使用残留冻存保护液二甲基亚砜的干细胞，有较高的毒副作用，易造成恶心、呕吐、腹痛等不良反应。
发明内容
本发明的目的是采用由基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂组成的直接对人脐带华通氏胶组织块进行冷冻的冻存保护液，冻存效果好，细胞损伤少，冻存保护液残留低，毒副作用小，临床使用时对人体无伤害。为了达到上述目的，本发明的脐带华通氏胶组织块冻存保护液，IL冻存保护液包括渗透性冷冻保护剂1-1. 4 mol、非渗透性冷冻保护剂0. 1-0. 5mol,余量为基础液，其中
所述基础液包括培养液DMEM/F12、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、含10%胎牛血清的培养液DMEM/F12、自体脐血血清、hvitrogen公司STEMPRO MSC SFM培养液、Stem Cell公司MesenCulte-XF Medium培养液中的一种或几种的组合；
所述渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或几种的组
合；
所述非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或几种的组合。与现有技术相比，本发明的冻存保护液冻存的是包含间充质干细胞的脐带华通氏胶组织块，冻存保护液配方既不是冻存干细胞的含单一冷冻保护剂的冻存保护液，也不是冻存组织块含高浓度冷冻保护剂的玻璃化冻存保护液，而是采用由较低浓度的渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂、基础液组成的冻存保护液。该冻存保护液中采用了包含培养液DMEM/F12、含10%胎牛血清的培养液DMEM/F12、自体脐血血清、磷酸盐缓冲液PBS等的基础液，能够保证细胞内外的渗透平衡，尤其是采用了源于同一个体的自体脐血血清作为基础液为组织块提供养分，自体脐血血清简单易得，临床容易实现，没有外源成分的加入， 最大限度保证了冻存过程中组织块内细胞的环境与体内环境一致，冻存效果好；采用了包含二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油等的渗透性冷冻保护剂，可以透过细胞膜渗透到细胞内，减少冷冻时细胞内冰晶的形成，且浓度都处在较低的水平上，最大限度的降低了对细胞的毒性；采用了包含蔗糖、甘露醇、海藻糖等的非渗透性冷冻保护剂，分子量大，很少的一部分就能大大增加溶液的粘度，缓解细胞冻存时细胞膜内外的渗透压，使细胞脱水，减少冷冻时细胞的冰晶形成，且对组织块内的干细胞无毒性。本发明采用对人脐带华通氏胶组织块直接冻存的保护液，同时考虑了在组织块复苏后降低冻存保护液残留对细胞的毒性，保证组织块冻存复苏后培养出的细胞的质量，能为临床上提供较高质量的脐带间充质干细胞。
图1为经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养出的PO代人脐带间充质干细胞生长状态图2为经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养出的Pl代人脐带间充质干细胞的成脂诱导鉴定图3为经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养出的Pl代人脐带间充质干细胞的成骨诱导鉴定图。
具体实施例方式
通过以下实施例对本发明详细说明，但本发明的保护范围不局限于实施例列出的范围。实例一
取400ml的磷酸盐缓冲液PBS，加入海藻糖0. 5mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的自体脐血血清100ml、4°C预冷的乙二醇lmol、 4°C预冷的二甲基亚砜0. 4mol，补加磷酸盐缓冲液PBS至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。实例二
取400ml的培养液DMEM/F12，加入海藻糖0. Imol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的自体脐血血清200ml、4°C预冷的二甲基亚砜 0. lmol、4°C预冷的乙二醇lmol，补加培养液DMEM/F12至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。实例三
取500ml的磷酸盐缓冲液PBS，加入甘露醇0. 2mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上加入4°C预冷的二甲基亚砜Imol，补加磷酸盐缓冲液PBS至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。实例四
取500ml的含10%胎牛血清的培养液DMEM/F12，加入蔗糖0. 2mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的乙二醇1. lmol、4°C预冷的丙二醇
0.2mol，补加含10%胎牛血清的培养液DMEM/F12至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。实例五
取400ml的份培养液DMEM/F12，加入海藻糖0. 2mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的自体脐血血清100ml、4°C预冷的二甲基亚砜
1.lmol、4°C预冷的甘油0. 2mol，补加培养液DMEM/F12至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。实例六
取400ml的hvitrogen公司的STEMPRO MSC SFM培养液，加入甘露醇0. 3mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的生理盐水100ml、4°C 预冷的乙二醇0. 8mol、4°C预冷的二甲基亚砜0. 3mol，补加hvitrogen公司的STEMPRO MSC SFM培养液至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。实例七
取 200ml 的 hvitrogen 公司 STEMPRO MSC SFM 培养液，加入 400ml Stem Cell 公司MesenCult^-XF Medium培养液，加入海藻糖0. 3mol充分混勻后以0. 22um滤膜的滤器过滤后4°C预冷，冰浴上依次加入4°C预冷的乙二醇lmol、4°C预冷的丙二醇0. 4mol，补加 Invitrogen公司STEMPRCf MSC SFM培养液至IL即为人脐带华通氏胶组织块冻存保护液。经上述方案配制的冻存保护液冻存的人脐带华通氏胶组织块复苏后，细胞生长状况良好，细胞生长曲线无异常，成脂、成骨的诱导分化能力未丧失，表面标记与新鲜的组织块培养出的细胞表面标记无差异。以下是对最佳实例一的冻存保护液冷冻保存脐带华通氏胶效果的测试
经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养15天后，PO代人脐带间充质干细胞总数为1. 74 XlO5/克，PO代的细胞融合至80-90%，将其置于倒置显微镜下拍照， 细胞形状为短梭形，大小均一，排列整齐，如图1所示。经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养出Pl代人脐带间充质干细胞，以lxl04/ml的细胞浓度接种于M孔培养板中，0. 5ml/孔；细胞融合至60_80%， 换成hvitrogen公司的成脂诱导完全培养基，0. 5ml/孔；每3_4天全量更换诱导培养液； 诱导14天后，油红0染色后拍照，可见细胞内有脂滴产生，如图2所示。经此冻存保护液冷冻保存30天的脐带华通氏胶组织块，培养长出的Pl代人脐带间充质干细胞，以IxlOVml的细胞浓度接种于M孔培养板中，0. 5ml/孔；细胞融合至 60-80%,换成hvitrogen公司的成骨诱导完全培养基，0. 5ml/孔；每3_4天全量更换诱导培养液；诱导7天后，茜素红染色后拍照，可见有大量钙结节产生，如图3所示。
权利要求
1. 一种脐带华通氏胶组织块冻存保护液，IL冻存保护液包括渗透性冷冻保护剂1-1. 4 mol、非渗透性冷冻保护剂0. 1-0. 5mol,余量为基础液；所述基础液包括培养液DMEM/F12、磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、含10%胎牛血清的培养液 DMEM/F12、脐血血清、Invitrogen 公司 STEMPRO MSC SFM 培养液、Stem Cell 公司 MesenCulte-XF Medium培养液中的一种或几种的组合；所述渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或几种的组合；所述非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或几种的组合。
全文摘要
本发明公开了人脐带华通氏胶组织块冻存保护液，1L冻存保护液包括渗透性冷冻保护剂1-1.4mol、非渗透性冷冻保护剂0.1-0.5mol，余量为基础液。本发明的冻存保护液同时含有渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，且渗透性冷冻保护剂的浓度较低，既能达到良好的冻存效果，又对细胞的毒性比较小，同时冻存保护液中含有基础液，既可以为脐带华通氏胶组织块提供营养，又降低了冷冻保护剂对华通氏胶组织块内细胞的毒性，通过本冻存保护液冻存的脐带华通氏胶组织块可以制备出高质量的脐带间充质干细胞，细胞损伤少，冻存保护液残留低，毒副作用小，临床使用时对人体无伤害。
文档编号A01N1/02GK102428911SQ20111034342
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者宋云庆, 李伟, 杨兵, 欧阳溪, 胡祥 申请人:江苏省北科生物科技有限公司