一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及蛋白活性检测领域，特别涉及一种非诊断目的检测ApoA5生物学活性的方法及试剂盒。该方法包括：将细胞与放射性核素标记的ApoA5孵育，去除细胞膜上结合的ApoA5，裂解细胞，检测细胞裂解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第一放射活性；将细胞与LRP1小干扰RNA混合，获得沉默LRP1表达的细胞；将沉默LRP1表达的细胞与放射性核素标记的ApoA5孵育，去除细胞膜上结合的ApoA5，裂解细胞，检测细胞裂解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第二放射活性；比较第一放射活性与第二放射活性。本发明提供的检测方法通过观察HL-1心肌细胞对ApoA5的摄取情况可准确检测ApoA5的生物学活性。
【专利说明】-种非诊断目的检测AP〇A5生物学活性的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白活性检测领域，特别涉及一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性 的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着现代生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖的发生率越来越高，同时肥胖 所伴随的脂质增加，异位沉积增多使得肥胖相关的疾病发病率逐年增高。因此，有效的降低 肥胖伴随的脂质沉积是当今医学面临的重要挑战。
[0003] 肥胖是由于能量摄入与能量消耗不平衡导致脂肪细胞储存过多甘油三酯（TG)，细 胞体积异常增大的结果，其根源是脂代谢异常。而脂代谢异常的实质是指脂蛋白和载脂蛋 白的异常，载脂蛋白作为脂蛋白中的蛋白质部分，不仅在结合和转运脂质、稳定脂蛋白的结 构上发挥重要作用，而且还具有调节脂蛋白代谢关键酶的活性，参与脂蛋白受体的识别的 作用，它参与了人体脂类代谢的全过程。目前已发现多个与脂代谢中有重要作用的载脂蛋 白，如 ApoAl、ApoA2、ApoA4、ApoB48、ApoBlOO、ApoCl、ApoC2、ApoC3 和 ApoE 等。
[0004] Ap〇A5是2001年发现的一种载脂蛋白，目前的研究证实其与肥胖及代谢综合征的 发生有着密切的关系。已有的研究证实，Ap 〇A5能显著降低血液中TG，同时Ap〇A5能够被脂 肪细胞摄取，滞留于脂滴表面，并降低脂肪细胞中的TG，因此，Ap 〇A5被认为是能够有效调 节脂质沉积的载脂蛋白，未来有可能运用于肥胖患者，达到降低血液中的脂质的目的。而目 前Ap 〇A5主要是通过质粒转染来获得，因此检测合成的Ap〇A5的生物学活性至关重要，可为 进一步研究Ap 〇A5对脂质的调控奠定基础，为其将来运用于临床有重要的意义。
[0005] 目前，检测Ap〇A5生物学活性的方法较少。因此，提供一种检测Ap〇A5生物学活性 的方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法及试剂 盒。该检测方法通过检测LRPl沉默后HL-I心肌细胞/脂肪细胞对Ap 〇A5的摄取情况可准 确检测ApoA5的生物学活性。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法，包括如下步骤：
[0009] 将细胞与放射性核素标记的Ap〇A5孵育，去除细胞膜上结合的Ap〇A5,裂解细胞， 检测细胞裂解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第一放射活性；
[0010] 将细胞与LRPl小干扰RNA混合，获得沉默LRPl表达的细胞；将沉默LRPl表达的 细胞与放射性核素标记的Ap 〇A5孵育，去除细胞膜上结合的Ap〇A5,裂解细胞，检测细胞裂 解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第二放射活性；
[0011] 比较第一放射活性与第二放射活性，获得Ap〇A5生物学活性。
[0012] 研究发现HL-I心肌细胞对ApoA5的摄取主要通过细胞膜上的受体介导来完成， 其中低密度脂蛋白受体相关蛋白I(LRPl)在摄取Ap〇A5的过程中起主要作用。本发明通 过放射性同位素 125I标记ApoA5,同时用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术 沉默HL-I心肌细胞/脂肪细胞LRPl受体的表达，并与对照组比较，观察LRPl沉默后HL-I 心肌细胞/脂肪细胞摄取Ap〇A5的变化情况。若LRPl沉默后HL-I心肌细胞/脂肪细胞内 125I-Ap 〇A5的含量较对照组减少，说明HL-I心肌细胞/脂肪细胞部分通过LRPl介导来摄取 ApoA5,同时也印证了 ApoA5具有生物学活性。
[0013] 为了使HL-I心肌细胞/脂肪细胞摄取具有生物学活性的Ap〇A5,需将细胞与 Ap〇A5进行孵育。在本发明提供的一些实施例中，孵育的时间为1?5小时，温度为37°C。
[0014] 作为优选，孵育的时间为2小时，温度为37°C。
[0015] 为了获得细胞摄取Ap〇A5的情况，需将Ap〇A5进行放射性核素标记。在本发明提 供的一些实施例中，放射性核素为 1251。
[0016] 在本发明提供的一些实施例中，LRPl小干扰RNA的浓度为1?10nmol/L。
[0017] 作为优选，LRPl小干扰RNA的浓度为5nmol/L。
[0018] 在本发明中将LRPl小干扰RNA与细胞进行混合，使得LRPl小干扰RNA沉默细胞 膜上LRPl的表达。在本发明提供的一些实施例中，混合的时间为4?8小时。
[0019] 作为优选，混合的时间为6小时。
[0020] 细胞膜上LRPl会结合Ap〇A5,为了消除这部分的干扰因素需要去除细胞膜上结合 的ApoA5。在本发明提供的一些实施例中，去除细胞膜上结合的ApoA5具体为：加入肝素溶 液孵育1?5分钟后,去除肝素溶液。
[0021] 在本发明提供的一些实施例中，裂解采用的试剂为氢氧化钠。
[0022] 在本发明提供的一些实施例中，细胞为HL-I心肌细胞或脂肪细胞。
[0023] 本发明还提供了一种检测Ap〇A5生物学活性的试剂盒，包括HL-I心肌细胞、 ApoA5、Na4125K LRPl小干扰RNA、肝素和氢氧化钠。
[0024] 本发明还提供了一种检测Ap〇A5生物学活性的试剂盒，包括3T3-L1前体脂肪细 胞、ApoA5、Na 4125K LRPl小干扰RNA、肝素和氢氧化钠。
[0025] 本发明提供了一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法及试剂盒。该方法包 括：将细胞与放射性核素标记的Ap 〇A5孵育，去除细胞膜上结合的Ap〇A5,裂解细胞，检测细 胞裂解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第一放射活性；将细胞与LRPl小干扰RNA混合， 获得沉默LRPl表达的细胞；将沉默LRPl表达的细胞与放射性核素标记的Ap 〇A5孵育，去除 细胞膜上结合的Ap〇A5,裂解细胞，检测细胞裂解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第二 放射活性；比较第一放射活性与第二放射活性，获得Ap 〇A5生物学活性。通过检测实例可 知，本发明提供的检测方法通过检测LRPl沉默后HL-I心肌细胞/脂肪细胞对Ap 〇A5的摄 取情况可准确检测Ap〇A5的生物学活性。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1示实施例1中放射活性柱状图；
[0027] 图2示实施例2中放射活性柱状图；
[0028] 图3示实施例4中放射活性柱状图。
【具体实施方式】
[0029] 本发明公开了一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法及试剂盒，本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及 应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围 内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0030] 本发明提供的非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法及试剂盒中所用试剂均 可由市场购得。Ap 〇A5的来源为湖南远泰生物生物技术有限公司。
[0031] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0032] 实施例I ApoA5生物学活性的检测
[0033] 125I_ApoA5 的制备：米用 Iodogen 法，用 Na4I 来标记 ApoA5,用 Sophohdex G200 柱 淋洗游离1251，制得用125I标记的Ap〇A5蛋白。
[0034] 将HL-I心肌细胞接种于12孔板，以I X IOfVcm2的密度种板，待细胞达到90 %融 合后，换液饥饿12小时，进行以下实验分组：①对照组：加入含1 %血清claycomb培养基； ②LRPl沉默组：加入含5nmol/L LRPl小干扰RNA的1 %血清claycomb培养基，以沉默HL-I 细胞膜上LRPl的表达。6小时后吸去培养基，加入完全claycomb培养基。
[0035] 48小时后，在上述培养基中加入125I-ApoA5(约2X IO6Cpm/孔），共同孵育2小时。 吸出培基，用预冷的PBS液洗3遍。再加入肝素溶液（10mg/ml)在室温下孵育3分钟，将结 合于细胞膜上的Ap 〇A5释放于溶液中，吸出肝素溶液，再用PBS液洗3遍。用0. lmol/L NaOH 裂解细胞，Y射线计数仪检测细胞裂解液中的放射活性，同时用BCA法检测细胞蛋白浓度。 根据式I计算放射活性，结果见表1、图1。
[0036] 放射活性（cpm/mg)=细胞裂解液的放射强度/细胞蛋白浓度式I
[0037] 表1放射活性检测结果
【权利要求】
1. 一种非诊断目的检测Ap〇A5生物学活性的方法，其特征在于，包括如下步骤： 将细胞与放射性核素标记的Ap〇A5孵育，去除细胞膜上结合的Ap〇A5,裂解细胞，检测 细胞裂解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第一放射活性； 将细胞与LRP1小干扰RNA混合，获得沉默LRP1表达的细胞；将所述沉默LRP1表达的 细胞与放射性核素标记的Ap〇A5孵育，去除细胞膜上结合的Ap〇A5,裂解细胞，检测细胞裂 解液的放射强度和细胞蛋白浓度，获得第二放射活性； 比较所述第一放射活性与所述第二放射活性，获得Ap〇A5生物学活性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间为1?5小时，温度为 37。。。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述放射性核素为1251。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LRP1小干扰RNA的浓度为1? 10nmol/L〇
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合的时间为4?8小时。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去除细胞膜上结合的Ap〇A5具体为： 加入肝素溶液孵育1?5分钟后，去除肝素溶液。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解采用的试剂为氢氧化钠。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞为HL-1心肌细胞或脂肪细胞。
9. 一种检测ApoA5生物学活性的试剂盒，其特征在于，包括HL-1心肌细胞、ApoA5、 Na4125I、LRP1小干扰RNA、肝素和氢氧化钠。
10. -种检测Ap〇A5生物学活性的试剂盒，其特征在于，包括3T3-L1前体脂肪细胞、 ApoA5、Na4125I、LRP1小干扰RNA、肝素和氢氧化钠。
【文档编号】G01N23/00GK104480185SQ201510002639
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2015年1月5日 优先权日:2015年1月5日
【发明者】赵水平, 罗俊, 郑小燕, 聂赛, 赵旺 申请人:中南大学湘雅二医院