专利名称：癌诊断用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌诊断用引物及含有该引物的癌诊断剂。特别地，本发明涉及能够同时检出从MAGE 1到MAGE 6的6个MAGE亚型(MAGE 1-6)或从GAGE 1到GAGE 8的8个GAGE亚型(GAGE 1-8)的共同引物(common primer)，及含有该引物的癌诊断剂。
最近开发的分子生物学诊断方法具有高的癌症诊断特异性及高灵敏度，其大大地促进了癌诊断领域的发展。
分子生物学诊断技术中最广泛使用的方法是聚合酶链反应(PCR)或逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)。在这些各种方法中扩增并检出试样的异常基因或癌抗原基因。
RT-PCR是检出以特定的基因表达的mRNA的方法，其可以用于通过检查癌抗原基因的表达特性来诊断癌症。在RT-PCR法中诊断癌症最重要的事项是选择待检出的癌症诊断用的目标基因(以下称“癌诊断标记”)，一般是检出一种癌诊断标记。
对癌诊断标记的要求是其应在癌中被特异表达，在尽可能多的癌症中大量表达。
MAGE(黑素瘤抗原基因)和GAGE是在多种癌组织中被表达的两种癌关联睾丸抗原，但在除睾丸以外的其他正常组织中没有表达。
自从MAGE最初在黑素瘤中被发现以来，通过多种研究已明确在胃癌(1、2)、食道癌(3)、大肠癌(4)、肺癌(5)、乳腺癌(6、7)、肝癌(8)、白血病(9)、成神经细胞瘤(10)、卵巢癌(11)等多种癌中被表达，有报告说GAGE在黑素瘤、肉瘤、小细胞癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌等中被表达(11、12)。
因此，由于MAGE和GAGE不仅能够检出多种癌症而非单一种类癌，而且与其他癌关联抗原如癌胚抗原等相比，其具有高的癌组织表达特异性，所以可以广泛用作癌诊断标记。
另外，MAGE和GAGE在亚型间具有高的基因同质性，MAGE的大约12种亚型具有约56％至99％的同质性(13)，GAGE的8种亚型具有82％至99％的同质性(13)。因此使用这样的相同碱基序列部位作为引物时由于MAGE或GAGE的许多亚型可以在RT-PCR过程中同时检出，所以癌诊断率可更高。
为实现上述目的，根据本发明的适当实施例，提供一种引物，其特征在于，选自序列号3至序列号10。
根据本发明的其他适当实施例，提供一种共同引物，其特征在于，由选自序列号3至序列号10的两个序列组成。
根据本发明的其他适当实施例，提供一种方法，其特征在于，使用由选自序列号3至序列号10的两个序列组成的共同引物诊断癌症。
根据本发明的其他适当实施例，提供一种癌诊断用试剂盒，其特征在于，含有选自序列号3至序列号10的引物及PCR试剂。
根据本发明的其他适当实施例，提供一种癌诊断用试剂盒，其特征在于，含有由选自序列号3至序列号10的两个序列组成的共同引物及PCR试剂。
本发明提供引物和含有该引物的癌诊断剂，所述的引物通过在RT-PCR中同时扩增MAGE或GAGE的多种亚型并检出这些基因，能够诊断癌症。
为同时检出MAGE及GAGE的多种亚型，通过比较多种亚型的基因序列，制作共同引物。引物的制作过程是获得在GenBank登记的12种MAGE基因和8种GAGE基因信息后，比较各基因的碱基序列，分析DNA的同质性，并选择同质性高的部位。这样制作的共同引物如下表1所示<表1>
表中，S是指有义引物；AS是指反义引物，W是指A或T，R是指A或G。
序列号1/2是对于MAGE的引物，但在实施PCR时呈现假阳性反应。据推测，呈现假阳性反应的原因是，由于这些引物的位置是在一个外显子内，所以来自受污染的基因组DNA的基因被扩增的可能性很高。
序列号3/4和序列号5/6是对于MAGE的引物。序列号3和序列号5是位于两个外显子边界的引物，使用序列号3/4和序列号5/6的PCR和嵌套式PCR上不呈现假阳性反应，这是因为序列号3和序列号5没有结合到基因组DNA上。
序列号7/8和序列号9/10是对于GAGE的引物。序列号7和序列号8或序列号9和序列号10各自位于不同的外显子上，在使用序列号7/8及序列号9/10的实验中没有假阳性反应，这是因为在这些外显子之间被插入了一个长的内含子。
用于诊断癌症的细胞系包括人的胃癌细胞系(SNU484、SNU638、SNU668)、头颈癌细胞系(AMC-HN-3、AMC-HN-4、AMC-HN-7)、子宫颈癌细胞系(HeLa、Caski)、肺癌细胞系(NCI H1703、NCI H522)、大肠癌细胞系(HT29)、转移性前列腺癌细胞系(LN.CAP)、早幼粒细胞性白血病(HL60)及骨肉瘤细胞系(SaOS2)。人体的癌组织和细胞使用了乳腺癌12例、头颈部上皮细胞癌27例、胃癌5例、甲状腺癌3例、淋巴瘤3例、囊腺瘤1例、肉瘤1例、皮肤纤维肉瘤1例、恶性混合肿瘤1例、膀胱癌患者的尿细胞9例、胃癌患者的腹腔细胞15例。作为对照用的阳性癌组织和细胞使用了头颈部阳性癌18例、正常血液的白细胞10例、正常及泌尿器炎症患者的尿细胞10例。
各种癌组织在使用前一直保存在-70℃下，然后向组织中加入RNAzol B(Tel-Test Inc.，U.S.A.)后，用组织粉碎机粉碎组织。
通过在完全除去培养基并用生理盐水清洗后加入RNAzol B，将培养的细胞系溶解。打开腹腔后收集胃癌的腹腔细胞，然后将其与RNAzol B混合。从血液中仅收集有核细胞后，通过加入RNAzol B将正常白血细胞完全溶解。从尿中收集细胞后，加入RNAzol B与尿细胞混合。
从溶解有各种组织及细胞的RNAzol B溶液中分离RNA是按照イムハク等的方法(14)。
通过添加等量的稳定剂(Roche Diagnostics，Mahnheim，Germany)、振摇混合使痰完全液化，并使用mRNA分离试剂(RocheDiagnostics，Mahnheim，Germany)分离mRNA后，将痰用于RT-PCR。
通过使用本发明的共同引物，可以利用PCR诊断癌症。从患者的各种癌组织、痰、血液、尿、腹腔细胞等提取总RNA或mRNA后，实施逆转录反应，生产cDNA。通过对cDNA实施使用本发明的共同引物(序列号1、2或序列号3、4或序列号7、8)的PCR，扩增MAGE1-6或GAGE 1-8，通过对初次PCR产物实施使用本发明共同引物(序列号5、6或序列号9、10)的二次PCR(嵌套式PCR)后，对PCR产物进行电泳，通过检出MAGE 1-6或GAGE 1-8 DNA条带，可以同时诊断多种癌症。
在本发明中，作为扩增或表达MAGE 1-6或GAGE 1-8的方法使用PCR，但是，并不限于本发明书记载的应用，因为实验者通过改变试剂或周期，PCR可能有多种应用，包括使用本发明的共同引物扩增或表达MAGE 1-6或GAGE 1-8的多种方法。
如上所述，在本发明中提供同时含有本发明的共同引物和PCR试剂的癌诊断用试剂盒。
符号说明C1序列号1；C2序列号2；C3序列号3；C4序列号4；C5序列号5；C6序列号6；C7序列号7；C8序列号8；C9序列号9；C10序列号10
获得了在GenBank登记的12种MAGE基因和6种GAGE基因信息后，首先利用DNAsis程序对基因的碱基序列进行比较分析。结果显示，MAGE型的基因(cDNA)的同质性为56-99％，GAGE型的基因(cDNA)的同质性为82％-99％。各亚型的碱基序列相同的部位被指定为引物。
在自动DNA合成器(PerSeptive Biosystem社制造的Expedidite TMNucleic Acid Synthesis System)中装入作为引物合成材料的dATP、dTTP、dCTP、dGTP和合成用柱并输入待合成的序列后，合成结束。经过氨处理过程和精制过程后，通过用紫外分光光度计测定浓度使用合成的引物。
制作的引物如表1所示。
序列号1和序列号2(序列号1/2)、序列号3和序列号4(序列号3/4)作为MAGE引物用于RT-PCR或初次PCR，序列号5和序列号6(序列号5/6)用于二次PCR(嵌套式PCR)。
序列号7和序列号8(序列号7/8)及序列号9和序列号10(序列号9/10)作为用于GAGE检出的引物，序列号7/8用于RT-PCR或初次PCR，序列号9/10用于嵌套式PCR。实施例2<总RNA的分离>
各种癌组织在使用前一直保存在-70℃下。在组织中加入1-2mlRNAzol B(Tel-Test Inc.，U.S.A.)后，用组织粉碎机粉碎组织。在完全除去培养基并用生理盐水清洗一次后，通过加入RNAzol B分离培养的癌细胞系。胃癌的腹腔细胞是通过打开腹腔后，在腹腔下部加入100ml生理盐水并收集腹腔细胞后，以1200rpm的转速离心5分钟而收集的。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞一次后，将细胞沉淀物加到RNAzol B中并混合。分离正常血液的白细胞时，首先在加入了抗凝剂的5ml血液中加入20ml灭菌蒸馏水(DEPC-DW)并放置17秒种后，加入2倍浓度的磷酸盐缓冲液20ml并混合后，以1200rpm(转/分钟)的转速离心5分钟，仅收集有核细胞。在收集的细胞中加入1mlRNAzol B完全溶解细胞。通过收集50ml尿后，进行离心，收集尿细胞。此时，加入磷酸盐缓冲溶液清洗细胞一次后，在细胞中加入1mlRNAzol B并混合。
在溶解有各种组织及细胞的RNAzol B溶液中添加1/10量的氯仿、振摇而混合后，以12000rpm的转速离心15分钟，分离蛋白质层和RNA，边注意分离的上层RNA溶液边收集，并转移到1.5ml试管中。在RNA溶液中添加等量的100％异丙醇并混合后，在-20℃下保存16小时以上，使RNA沉淀。通过以12000rpm的转速离心RNA-异丙醇混合液而使RNA沉淀后，除去上清液，添加1ml70％的冷乙醇清洗RNA沉淀后进行离心，完全除去上层乙醇溶液，将RNA沉淀溶解于灭菌蒸馏水(DEPC-DW)，利用分光光度计测定RNA的浓度和纯度。通过将100μgRNA加到DNase(脱氧核糖核酸酶)溶液(20mMMgCl2，20mM Tris-HCl，0.4U DNase 1，0.8U RNasin)中，将一部分试剂在37℃处理1小时后，再次提取RNA用于前述的RT-PCR或RNAPCR中。
通过添加等量的稳定剂(Roche Diagnostics，Mahnheim，Germany)、振摇混合使痰完全液化后，使用mRNA分离试剂(RocheDiagnostics，Mahnheim，Germany)分离RNA后，将其用于RT-PCR。
收集总RNA并按如下方法实施PCR，以研究基因组MAGE DNA是否被污染。首先通过混合10X PCR缓冲液3μl、25mM MgCl21.8μl、10mM dATP 0.3μl、10mM dGTP 0.3μl、10mM dTTP 0.3μl、10mM dCTP0.3μl、50μM有义和反义引物0.25μl、Taq聚合酶(5U/μl，Promega Co.，U.S.A.)0.25μl，使最终溶液量为25μl，来制作PCR反应液。将PCR反应液加入PCR试管中，在其中添加总RNA溶液(0.1μg/μl)5μl并混合后，滴入一滴矿物油，然后加入PCR器(Cetus 480，Perkin Elmer Co.，U.S.A.)中，在以下条件下实施PCR首先在94℃加热5分钟后，以在94℃下30秒、57℃下45秒、72℃下45秒作为一个周期，反应30-35个周期以扩增DNA，最后在72℃下处理5分钟，结束PCR。在1％琼脂糖凝胶中加入PCR产物进行电泳后，使用UV透照仪观察被扩增的DNA条带。
总RNA溶液在70℃水浴中放置10分钟使其变性后，保存在冰中。首先，将5X RT缓冲液2μl、10mM dATP 0.25μl、10mM dGTP0.25μl、10mM dTTP 0.25μl、10mM dCTP 0.25μl、MMLV逆转录酶(200U/μl)0.25μl、RNase(核糖核酸酶)抑制剂(28U/μl)0.25μl、50μM低聚dT引物0.5μl和灭菌蒸馏水(DEPC-DW)4μl加到PCR试管中，制作RT反应液。在RT反应液中加入在冰中保存的总RNA溶液(1μg/μl)2μl后，滴入一滴矿物油，将全部溶液在室温下放置10分钟。将该试管放入PCR器中，在42℃下热处理60分钟结束逆转录反应，将逆转录反应产物用蒸馏水以1∶1的比例稀释后用于PCR。在上述PCR反应产物25μl中加入逆转录反应产物5μl，混合后，滴入一滴矿物油，将其放入PCR器中在下述条件下实施PCR首先在94℃加热5分钟后，以在94℃下30秒、57℃下45秒、72℃下45秒作为一个周期，反应18-35个周期以扩增DNA，最后在72℃处理5分钟，结束PCR。
用蒸馏水将PCR或RT-PCR产物稀释10倍后，取2μl。在其中添加上述的PCR试剂后，实施二次PCR。
从培养的胃癌细胞系(SNU484、SNU638、SNU668)、头颈癌细胞系(AMC-HN-3、AMC-HN-4、AMC-HN-7)、子宫颈癌细胞系(HeLa、Caski)、肺癌细胞系(NCI H1703、NCI H522)、大肠癌细胞系(HT29)、转移性前列腺癌细胞系(LN.CAP)、早幼粒细胞性白血病(HL60)及骨肉瘤(SaOS2)细胞系中提取总RNA后，实施用于检出MAGE的PCR和RT-PCR(
图1)。
图1的A是以总RNA为对象，使用序列号1/2进行PCR的结果，B是将DNase处理到总RNA中后，使用序列号1/2进行PCR的结果。C是以总RNA为对象，使用序列号3/4进行PCR的结果，D是以总RNA为对象，使用序列号3/4进行PCR后，使用序列号5/6进行嵌套式PCR的结果。结论是，为使用序列号1/2，需要进行DNase处理，但是序列号3/4或序列号5/6不进行DNase处理也可检出MAGE，通过扩增基因组DNA，没有显示假阳性反应。序列号3/4和序列号5/6能够检出从MAGE-1至MAGE-6的至少6种MAGE亚型(MAGE 1-6)。
<使用序列号3/4、序列号5/6的RT-PCR法的癌诊断特异性评价>
为研究使用序列号3/4、序列号5/6的RT-PCR法的癌诊断特异性，提取SNU484细胞系和正常血液的白细胞实施RT-PCR及嵌套式PCR，结果显示，在SNU484中，MAGE 1-6只能在RT-PCR和嵌套式PCR中检出，当实施PCR和嵌套式PCR时DNA没有扩增(图2A)。在正常的白细胞中没有检出MAGE 1-6(图2B)。
以14种癌细胞系为对象，测定了MAGE的各亚型和MAGE 1-6。以具有MAGE特异性的序列号3为引物，通过RT-PCR测定MAGE的各亚型，使用序列号3/4及序列号5/6实施RT-PCR及嵌套式PCR，测定MAGE 1-6。与各亚型的测定结果相比，MAGE 1-6的测定实验显示更高的阳性率(78.6％)(图3)。
以乳腺癌患者的癌组织为对象，测定了MAGE的各亚型和MAGE1-6。通过以序列号3/4为引物的RT-PCR和使用具有MAGE特异性的序列号5引物的嵌套式PCR，测定MAGE的各亚型，但使用序列号3/4及序列号5/6实施RT-PCR及嵌套式PCR，测定MAGE 1-6。结果显示，与各亚型的测定相比，MAGE 1-6测定的阳性率(91.2％)更高(图4)。
测定了头颈癌和头颈阳性瘤中的MAGE 1-6。使用序列号3/4及序列号5/6通过RT-PCR及嵌套式PCR测定了MAGE 1-6。27例癌中19例呈阳性(70.3％)，阳性瘤中没有检出一个(图5，图5中的M是尺寸标记，-是没有加入cDNA的PCR结果)。实施例11<头颈癌中的MAGE亚型的测定>
在头颈癌样本中，被检出MAGE 1-6的样本中MAGE的各亚型和MAGE 1-6被测定。通过以序列号3/4为引物的RT-PCR和使用具有MAGE特异性的序列号5引物的嵌套式PCR，测定MAGE的各亚型，使用序列号3/4及序列号5/6通过RT-PCR及嵌套式PCR测定MAGE 1-6。各亚型的测定方法的效率比MAGE 1-6的检出方法低(图6)。
测定了其他癌组织和腹腔及尿细胞中的MAGE 1-6。使用序列号3/4及序列号5/6通过RT-PCR及嵌套式PCR测定MAGE 1-6。测定的对象是甲状腺癌(A)、淋巴瘤(B)、囊腺瘤(C)、肉瘤(D)、皮肤纤维肉瘤(E)、恶性混合瘤(F)、胃癌患者的腹腔细胞(G)、膀胱癌患者的尿(H)、其他患者的尿(I)。(图7，图7中M为尺寸标记，-是没有加入cDNA的PCR结果)。
在甲状腺癌中没有检出MAGE 1-6，但在其他癌和胃癌患者的腹腔细胞及膀胱癌患者的尿细胞中，检出了多种MAGE。
以14种各种癌细胞系为对象，测定了GAGE 1-8。通过使用序列号7/8的RT-PCR或PCR及使用序列号9/10的嵌套式PCR测定了GAGE 1-8。
不进行逆转录反应进行PCR及嵌套式PCR时，全部没有检出GAGE，逆转录后进行PCR及嵌套式PCR时，在14个反应中有13个呈阳性(92.9％)(图8)。在胃癌中80％呈阳性，乳腺癌中为85.7％，膀胱癌的尿细胞中为55.6％，没有患癌症的患者的尿中没有一例呈现阳性反应(图9)。
以肺癌组织8例、肺癌患者的痰14例、没患肺癌的住院患者的痰16例为对象，测定了MAGE 1-6。使用序列号3/4及序列号5/6实施RT-PCR及嵌套式PCR，进行测定。肺癌组织8例中的7例、肺癌患者的痰14例中的4例中检出了MAGE 1-6，没患肺癌的住院患者的痰16例中全部没有检出MAGE(图10)。
以癌患者血液20例和正常血液15例为对象，测定了MAGE。使用序列号3/4及序列号5/6实施RT-PCR及嵌套式PCR，进行测定。癌患者血液20例中的3例中检出了MAGE 1-6，在正常人的血液中全部没有检出MAGE(图11，图11中+为在正常人的血液5ml中添加了5个SNU484细胞(MAGE 1-6阳性细胞)的样品)。
以上根据本发明的适当实施形式进行了说明，但在不脱离本发明权利要求的范围的情况下，实验者可以进行多种改变。发明效果同时检出从MAGE-1至MAGE-6的引物序列号3/4和序列号5/6、同时检出从GAGE-1至GAGE-8的序列号7/8、序列号9/10与分别测定各亚型的方法相比，可以用作特异性及癌诊断率高的癌诊断剂。
另外，它们不仅由于在各种正常细胞及阳性肿瘤中均不呈现阳性而具有非常高的癌诊断特异性，而且通过使用这些共同引物也可以检出尿细胞中的MAGE，因此其也可以用作以非组织的非侵入性试样为对象的癌诊断剂。另外，通过同时测定MAGE或GAGE的多种亚型，本发明可以减少时间及花费。
参考文献1)Li J，Yang Y，Fujie Y，Tanaka F，Mimori K，Haraguchi M，Ueo H，Mori M，Akiyoshi T.“人类胃癌中MAGE基因家族的表达”(Expressionof the MAGE gene family in human gastric carcinoma)，抗癌研究(Anticancer Res.)173559-3563，1997.
2)Inoue H，Li J，Honda M.“胃癌中MAGE-1 mRNA表达”(MAGE-1 mRNA expression in gastric carcinoma)，胃肠病学(Gastroenterol)1091522-1525，1995.
3)Inoue H，Mori M，Honda M.“常用于表达MAGE基因的肿瘤排斥抗原的人类食道癌”(Human esophageal carcinomas frequentlyexpress the tumor-rejection antigens of MAGE genes)，国际癌杂志(IntJ Cancer)63523-526，1995.
4)Mori M，Inoue H，Mimori K.“人类结肠直肠癌中MAGE基因的表达”(Expression of MAGE genes in human colorectal carcinoma)，外科学年鉴(Ann Surg)224183-188，1996.
5)Weynants P，Lethe B，Brasseur F，Marchand M，Boon T.“由非小细胞肺癌表达MAGE基因”(Expression of MAGE genes by non-smallcelllung carcinomas)，Int J Cancer 56826-829，1994.
6)Russo M，Traversari C，Verrecchia A.“原发性和转移性人类乳腺癌中MAGE基因家族的表达肿瘤特异性免疫疗法的暗示”(Expres sion of MAGE gene family in primary and metastatic humanbreast cancerimplications for tumor-specific immunotherapy)，Int JCancer 64216-221，1995.
7)Fujie T，Mori M，Ueo H，Sugimachi K，Akiyoshi T.“日本乳腺癌中MAGE和BAGE基因的表达”(Expression of MAGE and BAGEgenes in Japanese breast cancer)，肿瘤学年鉴(Ann Oncol)8369-372，1997.
8)Yamashita N，Ishibashi H，Hayashida K，Kudo J，Takenaka K，ItohK，Niho Y.“肝细胞癌中MAGE-1基因表达的高频率”(High frequencyof the MAGE-1 gene expression in hepatocellular carcinoma)，肝脏病学(Hepatology)241437-1440，1996.
9)Shichijo S，Tsunosue R，Masuoka K，Natori H，Tamai M，MiyajimaJ，Sagawa K，Itoh K.“人类淋巴细胞性白血病中MAGE基因家族的表达”(Expression of the MAGE gene family in human lymphocyticleukemia)，癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol Immunother)4190-103，1995.
10)Corrias MV，Scaruffi P，Occhino M，De Bernardi B，Tonini GP，Pistoia V.“成神经细胞瘤中MAGE-1、MAGE-3和MART-1基因的表达”(Expression of MAGE-1，MAGE-3 and MART-1 genes inneuroblastoma)，Int J Cancer 69403-407，1995.
11)Russo V，Dalerba P，Ricci A，Bonazzi C，Leone BE，Mangioni C，Allavena P，Bordignon C，Traversari C.“新鲜上皮卵巢癌中MAGE、BAGE和GAGE基因的表达”(MAGE，BAGE and GAGE genesexpression in fresh epithelial ovarian carcinomas)，Int J Cancer 67457-460，1996.
12)Van den Eynde B，Peeters O，DeBacker B，Gaugler S，Lucas，Boon T.“由人类黑素瘤上的自体细胞溶解T淋巴细胞识别的抗原用的新一族基因编码(A new family of genes coding for an antigen recognizedby autologous cytolytic T lymphocytes on a human melanoma)，实验医学杂志(J Exp Med)182689，1995.
13)パク ジョン ウク、キム イン ホ、 キム ュ サMAGE等型或GAGE等型的DNA及蛋白质同质性(MAGE isotypesまたはGAGE isotypes の DNA及び蛋白質同質性)，启明大论文集(啓明大論文集)18475-483，1999.
14)イム ハク、ュン ス ジョン、パク ジョン ウク肾小球膜细胞中脂多糖衍生的趋化因子基因表达(メサンジウム細胞でlipopolysaccharide によつて誘導されゐchemokine遺伝子発现)，大韩肾脏学会志(大韓腎臓学会誌)18847-855，1999.
15)Mori M，Mimori K，Tanaka F，Ueo H，Sugimachi K，Akiyoshi T.“使用MAGE基因分析对循环癌细胞的分子诊断”(MolecularDiagnosis of circulating cancer cells using MAGE gene assay)，JAMA278476-477，1997.序列表<110>朴钟旭(PARK，Jong Wook)；株式会社iC&G(iC&G Co.，LTd.)<120>癌诊断用的多MAGE或多GAGE等型识别引物的开发(Development of Multi-MAGE or-GAGE Isotypes Recognizing Primer for Cancer Detection)<130>C1<160>10<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向MAGE1-6的引物；有义引物型<400>1ggtcacaaag gcagaaatgc t 21<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向MAGE1-6的引物；反义引物型<400>2gcccttggac cccacaggaa ctc 23<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向MAGE1-6的引物；有义引物型<400>3ctgaaggaga agatctgcc 19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向MAGE1-6的引物；反义引物型<400>4ctccaggtag ttttcctgca c 21<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向MAGE1-6的引物；有义引物型<400>5ctgaaggaga agatctgccw gtg 23<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向MAGE1-6的引物；反义引物型<400>6ccagcatttc tgcctttgtg a21<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向GAGE1-6的引物；有义引物型<400>7agttggcgag gaagatcgac 20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向GAGE1-6的引物；反义引物型<400>8cttcttttaa cactgtgatt gc 22<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向GAGE1-6的引物；有义引物型<400>9agcctcctga artgattgg 19<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶向GAGE1-6的引物；反义引物型<400>10gcgttttcac ctcctctgga t2权利要求
1.一种引物，其特征在于，选自序列号3至序列号10。
2.一种共同引物，其特征在于，由选自序列号3至序列号10的两个序列组成。
3.如权利要求2所述的共同引物，其特征在于，所述的共同引物选自序列号3和序列号4、序列号5和序列号6、序列号7和序列号8以及序列号9和序列号10。
4.一种癌诊断剂，其特征在于，以选自权利要求1至权利要求3所述的共同引物作为主成分。
5.一种方法，其特征在于，使用选自序列号3至序列号10的引物诊断癌症。
6.一种方法，其特征在于，使用由选自序列号3至序列号10的两个序列组成的共同引物诊断癌症。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，使用选自序列号3和序列号4、序列号5和序列号6、序列号7和序列号8及序列号9和序列号10的共同引物诊断癌症。
8.如权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，同时诊断一种以上的癌。
9.如权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，实施PCR诊断癌症。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，实施RT-PCR及嵌套式PCR的二次PCR诊断癌症。
11.一种癌诊断用试剂盒，其特征在于，含有选自序列号3至序列号10的引物和PCR试剂。
12.一种癌诊断用试剂盒，其特征在于，含有由选自序列号3至序列号10的两个序列组成的共同引物和PCR试剂。
13.如权利要求12所述的癌诊断用试剂盒，其特征在于，含有选自序列号3和序列号4、序列号5和序列号6、序列号7和序列号8及序列号9和序列号10的共同引物和PCR试剂。
全文摘要
本发明提供癌诊断率和癌诊断特异性高的共同引物，选择MAGE或GAGE作为癌诊断标记，所述共同引物能够通过RT－PCR同时检出这些癌诊断标记的多种亚型。该引物选自序列号3至序列号10、优选由选自序列号3至序列号10的两个序列组成。另外，通过使用选自序列号3至序列号10的引物，优选选自序列号3至序列号10的两个序列组成的共同引物，诊断癌症。此外，癌诊断用试剂盒含有选自序列号3至序列号10的引物和PCR试剂，优选由选自序列号3至序列号10的两个序列组成的共同引物和PCR试剂。
文档编号C12N15/09GK1425067SQ01808372
公开日2003年6月18日 申请日期2001年4月24日 优先权日2000年4月25日
发明者朴钟旭, 全昌镐 申请人:株式会社iC&G