专利名称：结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备及其应用，它属于医学分子生物学诊断技术领域，具体是关于结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备及其在结核病诊断中的应用。
背景技术：
在全世界结核病依然是危害人类健康的主要传染病之一，1985年以来艾滋病的流行、结核感染的移民和部分人群生活贫困等原因使美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核菌耐药问题和非结核分枝杆菌病的发病率逐年上升使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每年新增结核病人800～1000万，每年死亡人数约300万。1993年世界卫生组织(WHO)史无前例地宣布“全球结核病紧急状态”，1998年又重申遏制结核病的行动刻不容缓。
我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，是全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查初步结果表明，我国有5.5亿人感染了结核菌；现有肺结核病人451万，其中传染性肺结核病人196万；每年死亡人数约13万，结核病死亡在我国各种死亡原因中居第9位，在传染病中居第一位；耐药结核病人多，总耐药率为27.8％，耐多药率为10.7％，初始耐药率为18.6％，获得性耐药率为46.5％，WHO最近公布的世界38个国家和地区的结核病耐药监测资料中，中国被列为“特别引起警示的国家和地区”之一。面对这种严峻的形势，结核病的预防和治疗已引起国内外学者的高度重视。
目前已阐明了部分结核分枝杆菌耐药的分子机制，认为结核分枝杆菌耐利福平(RFP)是由于其作用靶分子RNA聚合酶的β亚单位的编码基因(rpoB)突变所致；耐异烟肼(INH)与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因(katG)或烯酰基还原酶编码基因(inhA)操纵子或烷基过氧化氢酶编码基因(ahpC)操纵子或β-酰基酮酰基载体蛋白合成酶编码基因(kas A)改变有关；耐乙胺丁醇(EMB)与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子突变有关；耐链霉素(SM)是由于其核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)和16SrRNA编码基因(rrs)突变所致。因此，应用各种基因突变检测技术分析这些耐药基因突变位点，即可检出耐药的结核分枝杆菌。
在建立的分子药敏试验方法中，PCR-SSCP技术虽简便，但只能判断基因有无突变，不能检测出突变的部位和性质，某些耐药基因位点呈天然多态性或某些基因突变与耐药无关，因此PCR-SSCP检测可能出现假阳性；PCR-RFLP技术是通过PCR扩增含有特定酶切位点的DNA片段，该片段经限制性内切酶消化后电泳可显示两条较小的片段；若基因发生突变，酶切位点消失，该片段经酶消化后电泳仍显示一条PCR扩增片段，其优点是具有较高的特异性，但只能用于分析已知序列特定位点的基因点突变；PCR-直接序列法是指耐药基因PCR扩增产物纯化后，直接用于DNA序列分析，该方法不仅能够检测出基因突变，而且能够确定突变的部位与性质，可发现新的突变位点，是检测基因突变的决定性方法，但技术要求高，需专门的技术人员，所需的测序仪器昂贵，成本高，难以在临床实验室常规开展；PCR-基因芯片分析法是应用基因芯片技术同时分析结核分枝杆菌多个耐药基因，该方法简便、快速，可大规模地开展工作，但该技术要求高，所需的点样系统和荧光分析系统昂贵，而难以推广应用；单链探针反向杂交试验(reversehybridization-based line probe assay，简称LiPA)的原理是应用生物素修饰的特异引物扩增DNA，使PCR产物带有生物素标记物，将PCR产物变性后与固定在一张膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法显示结果。比利时Innogenetics公司根据该原理推出了INNO-LiPA Rif.结核分枝杆菌检测试剂盒及配套的自动检测仪(Auto-LiPA)，它含有5个针对野生型rpoB基因序列的探针和4个针对特定位点突变的探针，只用于检测结核分枝杆菌耐RFP基因型，其简便、快速，易于推广，但检测的基因突变的种类有限。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测临床标本或临床分离株中结核分枝杆菌五种抗结核药物耐药基因突变的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒；本发明的另一目的是提供上述试剂盒的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案达到的一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，含有结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和结核分枝杆菌耐药基因PCR扩增试剂，其特征在于所述结核分枝杆菌耐药基因检测膜片是在硝酸纤维膜上固定2个针对分枝杆菌属和结核分枝杆菌复合群16S核糖体核糖核酸(简称rRNA)而设计的寡聚核苷酸探针，以及一系列针对结核分枝杆菌耐药基因rpoB、katG、embB、rpsL和rrs而设计的寡聚核苷酸探针，在3’末端加有80-110个脱氧核糖核酸(简称dT)；所述的结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂包括5-10倍PCR缓冲液(包括50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl、1.5mM MgCl2和0.01％明胶)，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶；所述结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂各组分的终浓度如下1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度各为0.2mmol/L，5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物的终浓度各为0.2-1.0umol/L，TaqDNA聚合酶2-5U/100μl。
一种优选技术方案，其特征在于所述寡聚核苷酸探针的特异性核苷酸序列为15-18个碱基。
一种优选技术方案，其特征在于所述寡聚核苷酸探针序列如下表所示。
一种优选技术方案，其特征在于所述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物序列如下
一种优选技术方案，其特征在于所述的结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增是将5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB和katG基因的上游引物和不带标记的下游引物混合在一起扩增，而将5’端带生物素标记的结核分枝杆菌embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物混合在一起扩增。
一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤1.结核分枝杆菌耐药基因检测膜片的制备方法如下(1)根据现有技术合成上述寡核苷酸探针；(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为2-6pmol/μl；(3)将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10-30min，晾干或42℃以下烘干；(4)取0.6-1μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，60-80℃烘烤1-2小时或紫外灯下照射10-20分钟，用水简单漂洗，晾干备用；2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下(1)根据现有技术合成上述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物，用1mMTris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释合成的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物，使其浓度为2.5-12.5μmol/L；(2)取5-10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂装入一容器。
一种优选技术方案，其特征在于所述寡聚核苷酸探针的特异性核苷酸序列为15-18个碱基。
一种优选技术方案，其特征在于所述寡聚核苷酸探针序列如下表所示。
一种优选技术方案，其特征在于所述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物序列如下
本发明的结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法，根据不同分枝杆菌属和结核分枝杆菌复合群16S核糖体核糖核酸(简称rRNA)而设计、合成相应的寡核苷酸探针，通过点样法将寡核苷酸探针按一定的顺序点在经预处理的硝酸纤维膜上，制成耐药基因检测鉴定膜片，与带生物素标记的PCR扩增产物杂交，根据探针杂交的蓝紫色信号强弱用肉眼判读结果，可用于检测临床标本或临床分离株中结核分枝杆菌五种抗结核药物耐药基因。
下面通过附图和具体实施方式
对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
图1-1为采用直接测序鉴定法测定的rpoB 531位密码子突变型；图1-2为采用直接测序鉴定法测定的katG 315位密码子野生型；图1-3为采用直接测序鉴定法测定的embB306位密码子野生型；图1-4为采用直接测序鉴定法测定的rpsL43位密码子野生型；图1-5为采用直接测序鉴定法测定的rrs 513位突变型；图2为应用本发明耐药基因检测膜片测定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.2084的结果；图3-1为采用直接测序鉴定法测定的rpoB 526位密码子突变型；图3-2为采用直接测序鉴定法测定的katG 315位密码子野生型；图3-3为采用直接测序鉴定法测定的embB306位密码子突变型；图3-4为采用直接测序鉴定法测定rpsL43位密码子突变型；图3-5为采用直接测序鉴定法测定rrs 513位碱基野生型；图4为应用本发明耐药基因检测膜片测定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.99-41的结果；图5-1为采用直接测序鉴定法测定的rpoB 511位密码子野生型；图5-2为采用直接测序鉴定法测定的rpoB 513位密码子野生型；图5-3为采用直接测序鉴定法测定的rpoB 516位密码子野生型；图5-4为采用直接测序鉴定法测定的rpoB 526位密码子野生型；图5-5为采用直接测序鉴定法测定的rpoB 531位密码子野生型；图5-6为采用直接测序鉴定法测定的rpoB 533位密码子野生型；图5-7为采用直接测序鉴定法测定的katG 315位密码子突变型；图5-8为采用直接测序鉴定法测定的embB306位密码子突变型；图5-9为采用直接测序鉴定法测定的rpsL43位密码子野生型；图5-10为采用直接测序鉴定法测定的rrs 513位突变型；图6为应用本发明耐药基因检测膜片测定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.816的结果。
具体实施例方式
对比例1采用PCR-直接测序鉴定法鉴定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.2084。
1.样品处理及DNA提取将来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.2084灭活后，提取DNA；2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下(1)根据现有技术合成下述结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物及下游引物
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释，使其浓度为3.75μmol/L；(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及5U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；浓度各为3.75μmol/L的结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和下游引物分别装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂的保存将结核分枝杆菌耐药基因检测试剂保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
4.PCR扩增①反应体系总体积各100μl。
②在5个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂试剂I加样顺序 体积(μl)水 157.010×PCR缓冲液 210.03.75μmol/L rpoB上游引物38.03.75μmol/L rpoB下游引物48.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 58.0和dTTPDNA样品 68.0总计 99.0试剂II 加样顺序 体积(μl)水 157.010×PCR缓冲液 210.03.75μmol/L katG上游引物38.03.75μmol/L katG下游引物48.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 58.0和dTTPDNA样品 68.0总计 99.0
试剂III 加样顺序 体积(μl)水 1 57.010×PCR缓冲液 2 10.03.75μmol/L embB上游引物3 8.03.75μmol/L embB下游引物4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计 99.0试剂IV 加样顺序体积(μl)水 1 57.010×PCR缓冲液 2 10.03.75μmol/L rpsL上游引物3 8.03.75μmol/L rpsL下游引物4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计 99.0试剂V 加样顺序 体积(μl)水 1 57.010×PCR缓冲液 2 10.03.75μmol/L rrs上游引物 3 8.03.75μmol/L rrs下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计 99.0③混匀后，分别于95℃变性8min。
④稍冷却后，分别加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混匀，分别加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
⑥分别取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果分别可见一条240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接测序鉴定法分别将剩余的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下游引物一起送上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。
6.测序结果如图1-1至图1-5所示，用生物分析软件GENEDOC分析显示结核分枝杆菌临床分离株No.2084的rpoB基因531位密码子(TTG)与结核分枝杆菌标准株rpoB基因531位密码子(TCG)不同，说明该分离株rpoB531位密码子发生点突变；rrs基因513位碱基(C)与结核分枝杆菌标准株rrs基因513位碱基(A)不同，说明该分离株rrs基因513位密码子发生点突变；katG、embB和rpsL基因序列与结核分枝杆菌标准株的完全相同，说明该分离株katG、embB和rpsL基因未发生突变，为野生型。
实施例1一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤1.结核分枝杆菌耐药基因检测膜片的制备方法如下(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针
所有的寡聚核苷酸探针在3’末端加有100个dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为6pmol/μl；(3)20×SSC溶液的配制氯化钠175.3g，柠檬酸钠88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用10M氢氧化钠调pH至7.0，然后定容至1000ml，高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液，将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min，置37℃温箱烘干；(4)取0.8μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，在紫外灯下照射10分钟，用水简单漂洗，晾干备用；2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释，使其浓度各为3.75μmol/L；(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及1U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；浓度各为3.75μmol/L的5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物I)装入一无菌的塑料管中备用；浓度各为3.75μmol/L的5’端带生物素标记的结核分枝杆菌embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物II)装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配及保存将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片密封后和结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂装入一纸盒容器，保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的应用(1)样品处理及DNA提取将来自于解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.2084灭活后，提取DNA；(2)PCR扩增①反应体系总体积各100μl。
②在2个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂试剂I 加样顺序 体积(μl)水 1 65.010×PCR缓冲液2 10.03.75μmol/L混合引物I 3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0和dTTPDNA样品 5 8.0总计 99.0试剂II加样顺序 体积(μl)水 1 65.010×PCR缓冲液2 10.03.75μmol/L混合引物II3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0和dTTPDNA样品 5 8.0总计 99.0③混匀后，分别于95℃变性8min。
④稍冷却后，分别加Taq DNA聚合酶1μl(含5U)，混匀，分别加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
分别取5μl试剂I和试剂II的PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果分别可见二条240bp和273-280bp以及二条258bp、215-200bp的片段。
(3)预杂交液配制6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液10ml20×SSC溶液 30ml10SDS溶液 5ml10mg/ml小牛胸腺DNA 1ml加水定容至 100ml(4)预杂交将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和4ml预杂交液装入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；(5)杂交将试剂I和试剂II的PCR扩增产物40μl分别置98℃变性10min，置冰浴中冷却5min后，加入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min；
(7)加酶将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中，与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min，用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min；(9)显色将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图2。
(10)结果判定如图2所示，根据探针杂交的蓝紫色信号强弱，可见M探针和a探针杂交阳性，其余探针杂交阴性，从而可判定该细菌属于分枝杆菌属，并可鉴定为结核分枝杆菌复合群；结核分枝杆菌rpoB 531位突变型探针No.1b的杂交信号远远强于野生型探针No.1，说明rpoB 531位密码子由TCG突变为TTG；而katG 315位野生型探针K1的杂交信号远远强于突变型探针K1b和K1c，说明katG 315位密码子未发生突变；embB306位野生型探针E1的杂交信号远远强于突变型探针E1b、E1c、E1d和E1e，说明embB306位密码子未发生突变；rpsL43位野生型探针S1的杂交信号远远强于突变型探针S1b，说明rpsL43位密码子未发生突变；rrs 513位碱基突变型探针rrs1b远远强于野生型探针rrs1和突变型探针rrs1c的杂交信号，说明rrs 513位碱基A突变为C。
对比例2采用PCR-直接测序鉴定法鉴定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.99-41。
1.样品处理及DNA提取将来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.99-41灭活后，提取DNA；2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下(1)根据现有技术合成下述结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物及下游引物
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释，使其浓度各为2.5μmol/L；(2)取5倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L 的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及1U/μlTaq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；浓度各为2.5μmol/L的结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和下游引物分别装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂的保存将结核分枝杆菌耐药基因检测试剂保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
4.PCR扩增①反应体系总体积各100μl。
②在5个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂试剂I 加样顺序 体积(μl)水 1 43.05×PCR缓冲液 2 20.02.5μmol/L rpoB上游引物 3 8.02.5μmol/L rpoB下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计 95.0试剂II加样顺序 体积(μl)水 1 43.05×PCR缓冲液 2 20.02.5μmol/L katG上游引物 3 8.02.5μmol/L katG下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计 95.0试剂III 加样顺序 体积(μl)水 1 43.015×PCR缓冲液2 20.02.5μmol/L embB上游引物 3 8.02.5μmol/L embB下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计 95.0试剂IV加样顺序 体积(μl)水 1 43.05×PCR缓冲液 2 20.02.5μmol/L rpsL上游引物 3 8.02.5μmol/L rpsL下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计 95.0
试剂V加样顺序 体积(μl)水 1 43.05×PCR缓冲液 2 20.02.5μmol/L rrs上游引物 3 8.02.5μmol/L rrs下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计95.0③混匀后，分别于95℃变性8min。
④稍冷却后，分别加Taq DNA聚合酶5μl(含5U)，混匀，分别加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
⑥分别取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果分别可见一条240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接测序鉴定法分别将剩余的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下游引物一起送上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。
6.测序结果如图2-1至图2-5所示，用生物分析软件GENEDOC分析显示结核分枝杆菌临床分离株No.99-41的rpoB基因526位密码子(GAC)与结核分枝杆菌标准株rpoB基因526位密码子(CAC)不同，说明该分离株rpoB526位密码子发生点突变；embB基因306位密码子(GTG)与结核分枝杆菌标准株embB基因306位密码子(ATG)不同，说明该分离株embB306位密码子发生点突变；rpsL基因43位密码子(AGG)与结核分枝杆菌标准株rpsL基因43位密码子(AAG)不同，说明该分离株rpsL43位密码子发生点突变；katG和rrs基因序列与结核分枝杆菌标准株的完全相同，说明该分离株katG和rrs基因未发生突变，为野生型。
实施例2一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤1.结核分枝杆菌耐药基因检测膜片的制备方法如下(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针
所有的寡聚核苷酸探针在3’末端加有90个dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为4pmol/μl；(3)20×SSC溶液的配制氯化钠175.3g，柠檬酸钠88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用10M氢氧化钠调pH至7.0，然后定容至1000ml，高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液，将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min，置37℃温箱烘干；(4)取0.6μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，60℃烘烤1小时，用水简单漂洗，晾干备用；2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物
本发明产品成品后，要达到以下标准(A)外观
(B)性能
2.5μmol/L混合引物II 3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 4 8.0和dTTPDNA样品 5 8.0总计95.0③混匀后，分别于95℃变性8min。
④稍冷却后，分别加Taq DNA聚合酶5μl(含5U)，混匀，分别加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
分别取5μl试剂I和试剂II的PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果分别可见二条240bp和273-280bp以及二条258bp、215-200bp的片段。
(3)预杂交液配制6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml20×SSC溶液 30ml10SDS溶液5ml10mg/ml小牛胸腺DNA 1ml加水定容至 100ml(4)预杂交将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和4ml预杂交液装入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；(5)杂交将试剂I和试剂II的PCR扩增产物40μl分别置98℃变性10min，置冰浴中冷却5min后，加入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min；(7)加酶将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中，与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min，用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min；(9)显色将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图4。
(10)如图4所示，为应用本发明耐药基因检测膜片测定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.99-41的结果。根据探针杂交的蓝紫色信号强弱，可见M探针和a探针杂交阳性，其余探针杂交阴性，从而可判定该细菌属于分枝杆菌属，并可鉴定为结核分枝杆菌复合群；结核分枝杆菌rpoB 526位突变型探针No.2c的杂交信号远远强于野生型探针No.2，说明rpoB 526位密码子由CAC突变为GAC；而katG 315位野生型探针K1的杂交信号远远强于突变型探针K1b和K1c，说明katG 315位密码子未发生突变；embB306位突变型探针E1b的杂交信号远远强于野生型探针E1，说明embB306位密码子由ATG突变为GTG；rpsL43位突变型探针S1b的杂交信号远远强于野生型探针S1，说明rpsL43位密码子由AAG突变为AGG；rrs 513位碱基野生型探针rrs1的杂交信号远远强于突变型探针rrs1b和rrs1c，说明rrs 513位碱基未发生突变。
对比例3采用PCR-直接测序鉴定法鉴定来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.816。
1.样品处理及DNA提取将来自于解放军309医院的结核分枝杆菌临床分离株No.816灭活后，提取DNA；2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下(1)根据现有技术合成下述结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物及下游引物
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释，使其浓度为12.5μmol/L；(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；浓度各为12.5μmol/L的结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和下游引物分别装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂的保存将结核分枝杆菌耐药基因检测试剂保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
4.PCR扩增①反应体系总体积各100μl。
②在5个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂试剂I 加样顺序体积(μl)水 1 57.510×PCR缓冲液2 10.012.5μmol/L rpoB上游引物 3 8.012.5μmol/L rpoB下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计99.5试剂II 加样顺序 体积(μl)水 1 57.510×PCR缓冲液2 10.0
12.5μmol/L katG上游引物 3 8.012.5μmol/L katG下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计99.5试剂III加样顺序 体积(μl)水1 57.510×PCR缓冲液 2 10.012.5μmol/L embB上游引物 3 8.012.5μmol/L embB下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计99.5试剂IV加样顺序体积(μl)水1 57.510×PCR缓冲液 2 10.012.5μmol/L rpsL上游引物 3 8.012.5μmol/L rpsL下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计99.5试剂V 加样顺序 体积(μl)水1 57.510×PCR缓冲液 2 10.012.5μmol/L rrs上游引物 3 8.012.5μmol/L rrs下游引物 4 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP 5 8.0和dTTPDNA样品 6 8.0总计99.5③混匀后，分别于95℃变性8min。
④稍冷却后，分别加Taq DNA聚合酶0.5μl(含5U)，混匀，分别加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
⑥分别取5μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果分别可见一条240bp、273bp、258bp、215bp、200bp的片段。
5.直接测序鉴定法分别将剩余的95μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的PCR扩增产物和20μl rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因下游引物一起送上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。
6.测序结果如图5-1至图5-10所示，用生物分析软件GENEDOC分析显示结核分枝杆菌临床分离株No.816的rpoB基因序列与结核分枝杆菌标准株的完全相同，说明该分离株rpoB基因未发生突变，为野生型；katG 315位密码子(ACC)与结核分枝杆菌标准株315位密码子(AGC)不同，说明该分离株katG 315位密码子发生点突变；embB基因306位密码子(ATA)与结核分枝杆菌标准株embB基因306位密码子(ATG)不同，说明该分离株embB306位密码子发生点突变；rrs基因513位碱基(T)与结核分枝杆菌标准株rrs基因513位碱基(A)不同，说明该分离株rrs基因513位密码子发生点突变；rpsL序列与结核分枝杆菌标准株的完全相同，说明该分离株rpsL基因未发生突变，为野生型。
实施例3一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤1.结核分枝杆菌耐药基因检测膜片的制备方法如下(1)根据现有技术合成下述寡核苷酸探针
所有的寡聚核苷酸探针在3’末端加有80个dT。
(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为2pmol/μl；(3)20×SSC溶液的配制氯化钠175.3g，柠檬酸钠88.2g，溶于800ml蒸馏水中，用10M氢氧化钠调pH至7.0，然后定容至1000ml，高压灭菌。取20×SSC溶液用蒸馏水稀释10倍成2×SSC溶液，将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10min，置37℃温箱烘干；(4)取1μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，在紫外灯下照射20分钟，用水简单漂洗，晾干备用；2.结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下(1)根据现有技术合成下述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物
用1mM Tris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释，使其浓度为12.5μmol/L；(2)取10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP及10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；浓度各为12.5μmol/L的5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物I)装入一无菌的塑料管中备用；浓度各为12.5μmol/L的5’端带生物素标记的结核分枝杆菌embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物混合(简称混合引物II)装入一无菌的塑料管中备用。
3.结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配及保存将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片密封后和结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂装入一容器，保存于-20℃冰箱中，不要保存在无霜型冰箱的冷冻室，若保存得当，可保持活性一年。
结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的应用(1)样品处理及DNA提取将来自于解放军309医院的分枝杆菌临床分离株No.816灭活后，提取DNA；(2)PCR扩增①反应体系总体积各100μl。
②在2个0.5ml塑料离心管中分别加入下列试剂试剂I 加样顺序 体积(μl)水 1 65.510×PCR缓冲液 2 10.012.5μmol/L混合引物I 3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP4 8.0和dTTPDNA样品5 8.0总计 99.5试剂II 加样顺序体积(μl)水 1 65.510×PCR缓冲液 2 10.012.5μmol/L混合引物II 3 8.02.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP4 8.0和dTTPDNA样品5 8.0总计 99.5③混匀后，分别于95℃变性8min。
④稍冷却后，分别加Taq DNA聚合酶0.5μl(含5U)，混匀，分别加液体石蜡40μl，以防扩增过程中水份蒸发，离心5秒使之分层良好。
⑤置珀金埃尔默公司生产的PCR扩增仪中，于94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，循环35次。最后72℃延伸5分钟。
分别取5μl试剂I和试剂II的PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳检测，结果分别可见二条240bp和273-280bp以及二条258bp、215-200bp的片段。
(3)预杂交液配制6×SSC溶液，5×Denharts溶液，0.1mg/ml小牛胸腺DNA，0.5十二烷基硫酸钠(简称SDS)溶液。
50×Denharts溶液 10ml20×SSC溶液 30ml10SDS溶液 5ml
10mg/ml小牛胸腺DNA1ml加水定容至100ml(4)预杂交将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和4ml预杂交液装入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；(5)杂交将试剂I和试剂II的PCR扩增产物40μl分别置98℃变性10min，置冰浴中冷却5min后，加入杂交袋中，于37℃水浴孵育30min；(6)洗膜用洗液I2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min，再用洗液II0.2×SSC-0.1％SDS于室温洗膜10min；(7)加酶将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中，与1∶1000的链亲和素-碱性磷酸酶(SA-AP)于37℃水浴反应30min；(8)洗膜用洗液III(100M Tris-HCl-150mM NaCl-2mMMgCl2-0.05％TritonX-100(pH7.5))于室温洗膜10min，用洗液IV(100M Tris-HCl-150mMNaCl-1mM MgCl2(pH9.5))于室温洗膜10min；(9)显色将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片转入新的杂交袋中，在5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(简称BCIP)和硝基蓝四氮唑(简称NBT)底物中闭光显色10min。结果见图6。
(10)结果判定如图6所示，根据探针杂交的蓝紫色信号强弱，可见M探针和a探针杂交阳性，其余探针杂交阴性，从而可判定该细菌属于分枝杆菌属，并可鉴定为结核分枝杆菌复合群；结核分枝杆菌rpoB 531、526、516、533、513、511位野生型探针No.1、2、3、4、5、6的杂交信号远远强于突变型探针No.1b、No.1c No.1d、No.2b、No.2c、No.2d、No.2e、No.3b、No.4b、No.5b、No.6b，说明rpoB基因未发生突变；katG 315位突变型探针K1b的杂交信号远远强于野生型探针K1和突变型探针K1c，说明katG 315位密码子由AGC突变为ACC；embB306位突变型探针E1d的杂交信号远远强于野生型探针E1，说明embB306位密码子由ATG突变为ATA；rrs 513位碱基突变型探针rrs1c远远强于野生型探针rrs1和突变型探针rrs1b的杂交信号，说明rrs 513位碱基A突变为T；rpsL43位密码子野生型探针S1的杂交信号远远强于突变型探针S1b，说明rpsL43位密码子未发生突变。
权利要求
1.一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，含有结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和结核分枝杆菌耐药基因PCR扩增试剂，其特征在于所述结核分枝杆菌耐药基因检测膜片是在硝酸纤维膜上固定2个针对分枝杆菌属和结核分枝杆菌复合群16S核糖体核糖核酸而设计的寡聚核苷酸探针，以及一系列针对结核分枝杆菌耐药基因rpoB、katG、embB、rpsL和rrs而设计的寡聚核苷酸探针，在3’末端加有80-110个脱氧核糖核酸；所述的结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂包括5-10倍PCR缓冲液，浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP，浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶；所述结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂各组分的终浓度如下1倍PCR缓冲液，dGTP、dCTP、dATP和dTTP的终浓度各为0.2mmol/L，5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物的终浓度各为0.2-1.0umol/L，TaqDNA聚合酶2-5U/100μl。
2.根据权利要求1所述的耐药基因检测试剂盒，其特征在于所述PCR缓冲液包括50mM KCl、pH8.3的10mM Tris.HCl、1.5mM MgCl2和0.01％明胶。
3.根据权利要求1所述的耐药基因检测试剂盒，其特征在于所述寡聚核苷酸探针的特异性核苷酸序列为15-18个碱基。
4.根据权利要求1所述的耐药基因检测试剂盒，其特征在于所述寡聚核苷酸探针序列如下表所示。
5.根据权利要求1所述的耐药基因检测试剂盒，其特征在于所述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物序如下表所示。
6.根据权利要求1所述的耐药基因检测试剂盒，其特征在于所述的结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增是将5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB和katG基因的上游引物和不带标记的下游引物混合在一起扩增，而将5’端带生物素标记的结核分枝杆菌embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物混合在一起扩增。
7.一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤[1].结核分枝杆菌耐药基因检测膜片的制备方法如下(1)根据现有技术合成上述寡核苷酸探针；(2)用10mM Tris.HCl-1mM EDTA缓冲液稀释合成的寡核苷酸探针，使其浓度为2-6pmol/μl；(3)将硝酸纤维膜浸入2×SSC溶液中预处理10-30min，晾干或42℃以下烘干；(4)取0.6-1μl寡核苷酸探针点于预处理后的硝酸纤维膜上，60-80℃烘烤1-2小时或紫外灯下照射10-20分钟，用水简单漂洗，晾干备用；[2].结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂的配制方法如下(1)根据现有技术合成上述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物，用1mMTris.HCl-0.1mM EDTA缓冲液稀释合成的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物，使其浓度为2.5-12.5μmol/L；(2)取5-10倍PCR缓冲液、浓度各为2.5mmol/L的dGTP、dCTP、dATP和dTTP、浓度各为2.5-12.5μmol/L的5’端带生物素标记的上游引物和不带标记的下游引物以及1-10U/μl Taq DNA聚合酶各装入一无菌的塑料管中备用；[3].结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒的装配将结核分枝杆菌耐药基因检测膜片和结核分枝杆菌耐药基因多重PCR扩增试剂装入一容器。
8.根据权利要求7所述的耐药基因检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述寡聚核苷酸探针的特异性核苷酸序列为15-18个碱基。
9.根据权利要求7所述的耐药基因检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述寡聚核苷酸探针序列如下表所示。
10.根据权利要求7所述的耐药基因检测试剂盒的制备方法，其特征在于所述5’端带生物素标记的分枝杆菌16S rRNA、结核分枝杆菌rpoB、katG、embB、rpsL和rrs基因的上游引物和不带标记的下游引物序列如下表如示。
全文摘要
本发明涉及一种结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒及其制备方法，根据不同分枝杆菌属和结核分枝杆菌复合群16S核糖体核糖核酸(简称rRNA)而设计、合成相应的寡核苷酸探针，通过点样法将寡核苷酸探针按一定的顺序点在经预处理的硝酸纤维膜上，制成耐药基因检测鉴定膜片，与带生物素标记的PCR扩增产物杂交。利用本发明，根据探针杂交的蓝紫色信号强弱用肉眼判读结果，可用于检测临床标本或临床分离株中结核分枝杆菌五种抗结核药物耐药基因。
文档编号C12Q1/18GK1635159SQ20041008382
公开日2005年7月6日 申请日期2004年10月19日 优先权日2004年10月19日
发明者吴国琼, 梁建琴, 张俊仙, 李洪敏 申请人:中国人民解放军第三0九医院