专利名称：一种自然组合饲用复合酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及饲料领域，具体地，本发明涉及一种自然组合饲用复合酶。
背景技术：
饲用复合酶是一类新型的活性饲料添加剂，其应用在国外始于20世纪70年代，国 内自20世纪80年代以来开始应用于畜禽养殖中。目前，饲料工业应用单一酶制剂较少，大多是复合酶制剂产品。复合酶即多种酶的 均勻的混合体系。饲用复合酶的生产主要通过以下3条途径(1)单一酶种复配；(2)产单 酶的多菌种混合发酵；C3)产多种酶的单一菌种发酵。三种产复合酶方式优缺点分别为单 一酶复配的复合酶酶种仅限于复配的几种酶，并不能完全满足复杂的饲料日粮成分，而且 可能是完全不同来源酶种的混合，各酶种间可能存在拮抗作用，相互协同作用就会大大削 弱，甚至可能完全失去协同作用，体系稳定性及酶活稳定性都将大大受影响；优点是可以根 据需要任意配制各种配方，复配灵活方便。产多种酶的单一菌种发酵一般会只突出某一两 种酶，而其它相关酶活性会较低；优点是在生产发酵方面较多菌种发酵更简单易操作及控 制，发酵成功技术难度小。多菌种混合发酵的各菌种生长产酶过程相对复杂；优点是所产酶 系更全面，来源于同一体系产生的复合酶，酶体系更稳定，各酶种间协同促进作用更强，能 更好针对饲料原料复杂成分发挥酶制剂最大功效。混合发酵具有多菌共生，酶系互补，省工节能、简化工艺设备，克服中间生成物浓 度过大的特点。宜于针对饲料日粮复杂成分的要求生产出酶种全面的复合酶系。
发明内容
本发明的目的是提供一种以多菌种混合发酵技术制备的自然组合饲用复合酶。本发明的再一目的是提供以多菌种混合发酵固体发酵生产饲用复合酶的方法，即 在以麦麸豆粕为主的固体培养基上，按一定的原则接种不同微生物菌种，经固体发酵产生 高效复合酶，可直接应用于畜、禽、水产动物饲料中，消除饲料中的抗营养因子，提高饲料利 用率。本发明的发明人首先改造现有技术中的木霉、宇佐美曲霉、和黑曲霉，以公司保藏 菌株Cx-28、By-31、M-17作为出发菌株，经紫外诱变、紫外亚硝酸诱变、紫外线亚硝基胍复 合诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到高产酶性 能菌株分别为木霉Cx631其保藏编号为CGMCC NO. 4观8，宇佐美曲霉ByM7其保藏编号为 CGMCC NO.似90，黑曲霉M-163其保藏编号为CGMCC NO. 4289 根据本发明的复合酶为上述木霉、宇佐美曲霉和黑曲霉的复合发酵产物的主要酶 种组成为木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、α -半乳糖苷酶。将本发明的木霉、宇佐美曲霉、黑曲霉的孢子按不同比例同时接种培养，各菌间 无明显拮抗作用，可以任意比例混合生长，只是生长快慢不同(黑曲霉>宇佐美曲霉>木 霉)。因此，可通过接种比例来控制混合发酵各菌体的生长。为简化三菌种配比的复杂变
3化，本发明先确定两两菌种组合的混合发酵的适宜比例后，再作综合。如图1所示，木霉与 宇佐美曲霉合适的接种比例为2. 5-2.0 1 ；根据图2所示，宇佐美曲霉与黑曲霉的合适的 接种比例为1 1-0. 6;根据图3所示，木霉与黑曲霉适宜的接种比例2. 5-1. 5 1。综合 确定木霉、宇佐美曲霉和黑曲霉混菌发酵的接种比例为2.0 2. 5 1 0.6 1.0。根据本发明的复合酶，其中，所述木霉、宇佐美曲霉和黑曲霉的复合发酵培养基 配方为麦麸70% -80%，豆粕10% -15%，稻草粉5-10%，硫酸铵2-3%，磷酸氢二钠 1-1. 5%，硫酸镁 0. 2%，料水比 1 1.2-1.5。根据本发明的自然组合饲用复合酶，其中，发酵工艺为采用曲房多层固体发 酵方法，将孢子悬浮液喷洒至固体发酵培养基中，搅拌均勻，于30-32°C下控制相对湿度 80% -95%的条件下培养84-96h，然后于45_50°C下低温干燥。根据本发明的复合酶，各酶种间具有协同增效作用，即在相同条件下应用于体外 酶解饲料原料，较单酶组合的复合酶具有更好的酶解效果(以净还原糖为指标)。根据本发明的制备上述自然组合饲用复合酶的方法，包括以下步骤1)制备木霉、宇佐美曲霉和黑曲霉的孢子液，所述三种霉菌菌种的孢子悬浮液的 制备方法为将木霉、宇佐美曲霉和黑曲霉三种保藏种分别接入麦芽汁琼脂斜面培养基中， 在30-32°C下培养84-%h，无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液。将种子培养基质量的5%的 孢子悬浮液接种，搅拌均勻，于30-32°C下培养72-8他，然后用无菌水洗下孢子，制成孢子 悬浮液；2)配制固体发酵培养基，培养基配方为麦麸70% -80%，豆粕10% _15%，稻草 粉5-10%，硫酸铵2-3%，磷酸氢二钠1-1. 5%，硫酸镁0. 2%，料水比1 1. 2-1. 5，121 °C灭 菌 30min ；3)固体发酵采用曲房多层固体发酵方法，将不同孢子悬浮液按一定比例喷洒 至固体发酵培养基中，搅拌均勻，于30-32°C下控制相对湿度80% -95%的条件下培养 84-%h，然后于45-50°C下低温干燥，粉碎得到本发明的饲用复合酶。所述复合酶产品包括的主要酶种为木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、α-半乳 糖苷酶等。本发明具有的有益的效果是1.从大量菌种中筛选得到具有高产不同酶种的菌种；2.通过多菌种混合发酵技术，各菌种在固体发酵培养基中可协同产多种酶，组成 酶系全面酶活高的自然组合复合酶制剂；3.该自然组合复合酶来源同一发酵体系，各酶种间无拮抗作用，相互协同作用效 果更强，作为禽、畜、水产的养殖动物的饲料添加剂，使用范围广；4.以植物性原料麦麸、豆粕等为主要培养基成分，采用多菌种一次性固体发酵，生 产过程不产生废水废渣，无二次环境污染，设备简单，生产成本低。
图1木霉与宇佐美曲霉接种比例对产酶的影响。图2宇佐美曲霉与黑曲霉接种比例对产酶的影响。图3木霉与黑曲霉接种比例对产酶的影响。
木霉(trichoderma sp. Cx631)于2010年11月01日保存于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学 院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号是CGMCC No. 4288。宇佐美曲霉(Aspergillus usamii By247)，于2010年11月01日保存于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC NO. 4290黑曲霉(Aspergillus niger M-163)，于2010年11月01日保存于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中 国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC NO. 4289
具体实施例方式实施例1、菌株诱变、筛选1、出发菌株木霉公司保藏菌株CxIS (湖南张张家界森林公园土壤采样分筛得到)，主要产 纤维素酶等；宇佐美曲霉公司保藏菌株By_31(重庆永川瑞特魔芋制品厂周围土壤分筛得 到)，主产甘露聚糖酶、α -半乳糖苷酶等；黑曲霉公司保藏菌株Μ_17(陕西山阳县常兴面粉加工厂麸皮堆积周围土壤采积 分筛得到)，主产木聚糖酶。2出发菌株的复合诱变选育紫外诱变将紫外灯打开预热20min，调整孢子悬液IO6 IO7个/ml，取5ml置于 无菌的培养皿中。再将上述培养皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离30cm、功率为 20w的紫外灯下照射lOmin，稀释涂布PDA平板。60Co Y射线辐射诱变选出经紫外线诱变后酶活大幅提高菌株，涂布培养后，封住 皿口，照射剂量30千拉德。紫外亚硝酸诱变吸取经紫外线照射处理的菌悬液1ml，加入pH4. 5醋酸缓冲液 2ml及0. lmol/L亚硝酸钠溶液lml。紫外照射剂量120S，亚硝酶处理时间30S、60S、90S、 120S。稀释涂布PDA平板。紫外线亚硝基胍复合诱变吸取经紫外线照射处理的菌悬液1ml，加入亚硝基胍 溶液Iml继续处理。紫外照射剂量120S，亚硝基胍处理时间30S、60S、90S、120S。稀释涂 布PDA平板。技术路线出发菌株斜面一同步培养一单细胞或孢子悬液的制备诱变处 理(诱变处理预备试验)一平板分离一初筛一复筛一再复筛一扩大实验(发酵性能测定)。按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选， 得到高产酶性能菌株分别为木霉Cx631，产纤维素酶活为3068U/g，比原菌株Cx-观产酶提 高了 125. 7%;宇佐美曲霉ByM7，产甘露聚糖酶活为10180U/g，产α -半乳糖苷酶492U/g， 分别比原菌株By-31产酶提高了 207. 6%和184. 5% ；黑曲霉M-163，产木聚糖酶活为
g，比原菌株M-17产酶提高了 84. 2% ο以下实施例中
菌种为发明人筛选保藏，本发明经筛选所用菌种为黑曲霉、宇佐美曲霉、木霉；菌 种制备分一级菌种和二级菌种制备。一级菌种培养基为麦芽斜面，将保藏菌种黑曲霉、宇佐美曲霉、木霉分别划线接 种，30-32°C下培养84-%h，无菌水洗下，分别转移至装有玻璃珠无菌三角瓶中，震荡打散， 制成孢子悬浮液待用。二级菌种以麦麸80% -90%，豆粕10% _20 %，硫酸铵2_3 %，磷酸二氢钠 1-1. 5%，每300mL三角瓶装干料20g，料水比1 1. 0-1. 2，加水混勻，121°C灭菌30min，冷 却，分别接种一种一级种子悬液1. OmL，搅拌均勻，于30-32°C下培养约72-86h，然后，用无 菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液备用。二、发酵生产1、发酵方式采用曲房多层固体发酵方法，物料厚度3-5cm，控温、控湿、保持通气。2、固体发酵培养基配制培养基干料组成为麦麸70% -80%，豆粕10% -16%, 稻草粉10-14%，硫酸铵2-3%，磷酸二氢钠1-1. 5%，硫酸镁0. 2%，料水比1 1. 2-1. 5，加 水混勻，121 °C灭菌30min ；3、发酵培养将二级种子的木霉种悬液、佐美曲霉种子悬液、黑曲霉种子悬液按一 定的比例接入发酵培养基中，搅拌均勻后进行发酵，发酵过程控制发酵温度30-32°C，相对 湿度80% -95%，发酵培养时间84-%h。4、干燥将发酵结束固体基质，在45-50°C下低温气流干燥，粉碎得到本发明的饲 用复合酶。实施例2将冰箱保藏的宇佐美曲霉、木霉、黑曲霉分别接种新鲜的麦芽汁斜面上，置于恒温 培养箱中，30°C培养76h-82h，待斜面长满菌丝并长满孢子后，加入适量的无菌水分别洗下 孢子，制成孢子悬液(一级种)。在300mL三角瓶中装入20g固体发酵培养基，其中包括麦 麸17g，豆粕3g，硫酸铵0. 5g，磷酸二氢钠0. 2g，水25mL, 121°C灭菌30min，冷却后，分别接 种木霉、黑曲霉、宇佐美曲霉孢子悬液l.OmL，搅拌均勻，于30°C微生物恒温培养箱中进行 培养，8 后待发酵培养基表面长满孢子，用无菌水洗下孢子，分别制成宇佐美曲霉、木霉、 黑曲霉孢子悬液(二级种)。配制50kg干料发酵培养基(麦麸3^(g，豆粕8Kg，稻草粉7Kg，硫酸铵lKg，磷酸氢 二钠0. 5Kg%，硫酸镁0. IKg)，力口自来水6^(g，混合机搅拌均勻，121°C灭菌30min，冷却，按 2.5 1 1比例将木霉种子悬液、宇佐美曲霉种子悬液、黑曲霉种子悬液共3.2L均勻喷 洒发酵培养基中，搅拌均勻，装多层曲盘，每个曲盘厚度34cm，控制温度30-32°C，相对湿 度为90%，20h后翻一次，整个过程保持温度和相对湿度，再培养64h，发酵结束。将发酵料 低于50°C气流干燥至含水量8-10%，送入粉碎机粉碎，检验合格后，装IKg锡纸袋包装成成
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ΡΠ O经测定，所得产品中木聚糖酶M13U/g，甘露聚糖酶12347U/g，纤维素酶33^U/g， 果胶酶3612U/g，α -半乳糖苷酶647U/g。实施例3将冰箱保藏的宇佐美曲霉、木霉、黑曲霉分别接种新鲜的麦芽汁斜面上，置于恒温培养箱中，30°C培养86h，待斜面长满菌丝并长满孢子后，加入适量的无菌水分别洗下孢子， 制成一级种孢子悬液。在300mL三角瓶中装入20g固体发酵培养基，其中包括麦麸17g，豆 粕3g，硫酸铵0. 5g，磷酸二氢钠0. 2g，水25mL，121°C灭菌30min，冷却后，分别接种一级种木 霉、黑曲霉、宇佐美曲霉孢子悬液1. OmL，搅拌均勻，于30°C微生物恒温培养箱中进行培养， 8 后接种，待发酵培养基表面长满孢子，用无菌水洗下孢子，分别制成二级种宇佐美曲霉、 木霉、黑曲霉孢子悬液。配制50kg干料发酵培养基(麦麸38Kg，豆粕6Kg，稻草粉6Kg，硫酸铵lKg，磷酸 二氢钠0. ^(g，硫酸镁0. IKg)，加自来水70Kg，混合机搅拌均勻，121°C灭菌30min，冷却，按 2:1: 0.6比例将木霉种子悬液、宇佐美曲霉种子悬液、黑曲霉种子悬液共3. 6L均勻喷 洒发酵培养基中，搅拌均勻，装多层曲盘，每个曲盘厚度34cm，控制温度30-32°C，相对湿 度为90%，20h后翻一次，整个过程保持温度和相对湿度，再培养68h，发酵结束。将发酵料 低于50°C气流干燥至含水量8-10%，送入粉碎机粉碎，检验合格后，装IKg锡纸袋包装成成
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ΡΠ O经测定，所得产品中木聚糖酶2374U/g，甘露聚糖酶12^1U/g，纤维素酶3408U/g， 果胶酶3542U/g，α -半乳糖苷酶632U/g。实施例4将冰箱保藏的宇佐美曲霉、木霉、黑曲霉分别接种新鲜的麦芽汁斜面上，置于恒温 培养箱中，30°C培养86h，待斜面长满菌丝并长满孢子后，加入适量的无菌水分别洗下孢子， 制成一级种孢子悬液。在300mL三角瓶中装入20g固体发酵培养基，其中包括麦麸17g，豆 粕3g，硫酸铵0. 5g，磷酸二氢钠0. 2g，水25mL，121°C灭菌30min，冷却后，分别接种木霉、黑 曲霉、宇佐美曲霉孢子悬液1. 5mL，搅拌均勻，于30°C微生物恒温培养箱中进行培养，8 后 接种，待发酵培养基表面长满孢子，用无菌水洗下孢子，分别制成二级种宇佐美曲霉、木霉、 黑曲霉孢子悬液。配制50kg干料发酵培养基(麦麸40Kg，豆粕^(g，稻草粉^(g，硫酸铵1. 5Kg,磷酸 二氢钠0. 5Kg%，硫酸镁0. IKg)，加自来水7^(g，混合机搅拌均勻，121°C灭菌30min，冷却， 按2.2 1 0.8比例将木霉种子悬液、宇佐美曲霉种子悬液、黑曲霉种子悬液共4. OL均 勻喷洒发酵培养基中，搅拌均勻，装多层曲盘，每个曲盘厚度3-km，控制温度30-32°C，相 对湿度为90%，20h后翻一次，整个过程保持温度和相对湿度，再培养72h，发酵结束。将发 酵料低于50°C气流干燥至含水量8-10%，送入粉碎机粉碎，检验合格后，装IKg锡纸袋包装 成成品。经测定，所得产品中木聚糖酶2568U/g，甘露聚糖酶12176U/g，纤维素酶3117U/g， 果胶酶3497U/g，α-半乳糖苷酶681U/g。实施例5发酵复合酶与单酶组合酶对饲料原料体外酶解比较根据本发明的复合酶，各酶种间具有协同增效作用，即在相同条件下应用于体外 酶解饲料原料，较单酶组合的复合酶具有更好的酶解效果(以净还原糖为指标)。结果见附 表1。体外酶处理饲料及其原料方法称饲料或饲料原料IOg于250ml碘量瓶，按料水比 1 10加入pH5. 0乙酸缓冲液50mL，加酶量为饲料原料的0. 02%，于39°C恒温震荡酶解证 后，加入5ml三氯乙酸处理5min，酶解液于4000r/min离心lOmin，收集清液，DNS法测定还
7原糖。表1发酵复合酶与单酶组合酶对饲料原料体外酶解比较结果
权利要求
1.一种木霉Cx631，其保藏编号为CGMCC NO. 4288
2.一种宇佐美曲霉ByM7，其保藏编号为CGMCC NO. 4290
3.一种黑曲霉M-163，其保藏编号为CGMCC NO. 4289
4.一种自然组合饲用复合酶，其特征在于，所述复合酶为权利要求1所述木霉、权利要 求2所述宇佐美曲霉、和权利要求3所述黑曲霉的复合发酵产物。
5.根据权利要求4所述的自然组合饲用复合酶，其特征在于，所述木霉、宇佐美曲霉和 黑曲霉的复合发酵培养基配方为麦麸70% -80%，豆粕10% -15%，稻草粉5-10%，硫酸 铵2-3%，磷酸氢二钠1-1.5%，硫酸镁0.2%，料水比1 1.2-1.5。
6.根据权利要求4所述的自然组合饲用复合酶，其特征在于，其中木霉、宇佐美曲霉和 黑曲霉的比例为2. 0 2. 5 1 0.6 1.0。
7.根据权利要求4所述的自然组合饲用复合酶，其特征在于，发酵工艺为采用曲房多 层固体发酵方法，将孢子悬浮液喷洒至固体发酵培养基中，搅拌均勻，于30-32°C下控制相 对湿度80% -95%的条件下培养84-96h，然后于45_50°C下低温干燥。
8.一种制备权利要求4所述自然组合饲用复合酶的方法，其特征在于，所述方法包括 以下步骤1)制备木霉、宇佐美曲霉和黑曲霉的孢子液；将木霉、宇佐美曲霉和黑曲霉三种保藏 菌种分别接到麦芽汁琼脂斜面培养基中，在30-32°C下培养84-%h，无菌水洗下孢子，制成 孢子悬浮液。将种子培养基质量的5%的孢子悬浮液接种，搅拌均勻，于30-32°C下培养 72-8他，然后用无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液；2)配制固体发酵培养基，培养基配方为麦麸70%-80%，豆粕10% -15%，稻草粉 5-10%，硫酸铵2-3%，磷酸氢二钠1-1.5%，硫酸镁0.2%，料水比1 1.2-1.5;3)孢子悬浮液喷洒至固体发酵培养基中，搅拌均勻，于30-32°C下控制相对湿度 80% -95%的条件下培养84-%h，然后于45-50°C下低温干燥、粉碎，即获得自然组合饲用 复合酶。
全文摘要
本发明涉及饲料领域，具体地，本发明涉及一种自然组合饲用复合酶。本发明的发明人首先改造现有技术中的木霉、宇佐美曲霉、和黑曲霉，经紫外诱变、紫外亚硝酸诱变、紫外线亚硝基胍复合诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到高产酶性能菌株分别为木霉Cx631，宇佐美曲霉By247，黑曲霉M-163。根据本发明的复合酶为上述木霉、宇佐美曲霉和黑曲霉的复合发酵产物的主要酶种组成为木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶。该自然组合复合酶来源同一发酵体系，各酶种间无拮抗作用，相互协同作用效果更强，作为禽、畜、水产的养殖动物的饲料添加剂，使用范围广。
文档编号C12R1/66GK102061264SQ20101054408
公开日2011年5月18日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者刘金山, 史宝军, 周平发, 崔细鹏, 胡爱红 申请人:广东溢多利生物科技股份有限公司