专利名称：一种以莲子壳为原料生产饲用复合酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物发酵产酶的方法，特别是涉及一种以莲子壳为原料生产饲用复合酶的方法背景技术
随着我国经济的快速发展，人民的生活水平不断提高。对食品的需要量日渐增加， 促进了畜牧水产养殖业的迅速发展。然而随着人口增加和耕地面积的不断减少，出现了人畜争粮的现象，导致饲料价格居高不下，因此提高畜禽日粮中各种营养物质的利用率，一直是动物营养科学的研究目标之一。其中饲用酶制剂是近年来的研究热点。酶制剂的科学使用不仅可以提高畜禽饲料的利用率，促进畜禽生产，而且酶制剂不会在畜禽产品中残留。危害人类健康。此外，有些酶还可以增强畜禽的免疫力，提高动物的抗应激能力。目前，饲用酶在世界各国广泛应用于猪、家禽、反刍动物和水产动物等的日粮中。
饲用复合酶是一类新型的活性饲料添加剂，是多种消化酶的混合制剂，主要由纤维素酶、半纤维素酶、糖化酶、蛋白酶、果胶酶多种水解酶组成。酶源主要来自动物、植物和微生物，而利用微生物发酵制取复合酶逐渐成为饲用酶制剂的主要来源。
莲子壳是子莲加工后产生的副产品，由于莲壳质硬壁厚，利用率较低，大多被焚烧填埋，据分析莲壳中含有丰富的纤维素及适宜食用菌生长的营养物质，是一种良好的微生物培养基质，具备生产饲用复合酶的潜力，但用莲子壳为原料固态发酵生产复合酶制剂国内外未见文献报道。
本研究方法主要以廉价的废物莲子壳为原料，通过微生物发酵来生产饲用复合酶，为综合利用莲壳、提高经济效益提供理论参考。发明内容
本发明的目的在于提供一种以莲子壳为主要原料发酵生产饲用复合酶的方法。
本发明采用的技术方案是
一种以莲子壳为原料生产饲用复合酶的方法，其特征在于，它包括以下步骤
(a)菌种选取在产羧甲基纤维素酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、果胶酶、果胶裂解酶和木聚糖酶的产生菌中挑选出棘孢曲霉作为生产菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于 26 32°C下培养84 120h天成熟后保存备用；
(b)菌种培养将挑选的棘孢曲霉菌株放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中在28°C的温度条件下复壮培养84 120h，然后放入固体发酵培养 基中进行恒温培养60 72h ；
(C)发酵处理按重量百分比取5% 8%的培养菌种的孢子悬浮液IO6 IO7个孢子/ml、接入已灭菌的固体发酵培养基中，该培养基的重量百分比构成为干燥莲子壳45 55%，豆柏25% 35%，稻草粉10% 15%，硫酸铵I % 2%，氯化钙I % 2%，混匀后加水调整至消毒后含水量为重量百分比60 70% ;恒温生化培养箱中保持环境温度为28 30°C，环境湿度为65 70%的条件下发酵60 84h ;发酵成熟的固体料进行真空冷冻干燥，直至含水量达到4 5%，再利用粉碎机低温粉碎至40 50目，得到饲用复合酶。
所述的饲用复合酶包含有羧甲基纤维素酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、木聚糖酶。
本发明具有的有益的效果是1、对大量菌株进行筛选得到能利用莲子壳生产高酶活复合酶的棘孢曲霉；2、以莲子壳为主要原料，添加少量的豆柏、稻草粉及无机盐，其原料来源广，价格低廉，生产成本低；3、固态发酵能耗低，培养周期短，投资少且原料比较粗放， 终产物往往含有多种酶活性，很适合用作饲料添加剂；4、一次发酵即可获得多酶种、高酶活的发酵曲料，真空冷冻干燥、粉碎，能制备出可直接添加的复合酶饲料添加剂。操作简便，容易推广；5、产品酶系全且酶活高，作为畜、禽和水产的养殖动物的绿色饲料添加剂，使用范围广；6、生产中不产生废水废渣，后处理简单，基本无污染。具体实施方案
一、菌种制备
菌种为湘潭大学生物食品工程系分离保藏的棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)。 囷种制备分为一、~■级囷种制备。
一级菌种培养基为新鲜马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基斜面，棘孢曲霉保藏菌株划线法接种，28 30°C下培养84 120h，用无菌水洗下孢子，转移至无菌带玻璃珠三角瓶，振荡打散孢子，制成孢子悬浮液，调节孢子浓度在IO6 IO7个/ml，待用。
二级菌种按照干燥的莲子壳粉78%，豆柏粉20%，硫酸铵2%，培养基含水量 50%,自然pH值，121°C下高压灭菌20min,冷却，接入一级种子孢子悬浮液,每个三角瓶接 lml，搅拌均匀，于28 30°C下培养约84 120h，然后，用无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，调节孢子浓度为IO6 IO7个/ml。
二、固体发酵
培养基配制培养基干料组分的重量百分比为干燥莲子壳45 55%，豆柏25% 35 %,稻早粉10 15 *%，硫酸按I 2 *%，氣化韩I 2 *%，混勾后加水调整至灭囷后含水量为重量百分比60 70%;具体操作方法将莲子壳、豆柏与稻草粉按比例混合均匀， 再将硫酸铵和氯化钙溶于蒸馏水中，均匀，121°C下高压灭菌20min，在恒温生化培养箱中保持环境温度为28 30°C，环境湿度为65 70%的条件下发酵60 84h。
三、干燥
发酵成熟的固体料利用真空冷冻干燥器在-110°C下进行干燥，直至含水量达到 4 5%,再利用粉碎机低温粉碎至40 50目即可。
实施例1
将低温保藏的棘孢曲霉斜面菌种转接到新鲜PDA培养基斜面上，置于恒温培养箱中，温度控制在28°C，经过84小时培养，待菌丝长满斜面并长满灰黑色孢子后，加入适量的无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，调节孢子浓度到IO7个/ml，在250mL三角瓶中，装入IOg 莲子壳固体发酵培养基，其中包括莲子壳粉4g，豆柏lg，硫酸铵O. lg，水5ml，121°C下灭菌 20min,冷却后接入ImL孢子悬浮液，置于28°C生化培养箱中发酵培养，经过72h待发酵固体表面布满灰黑色孢子后，加入无菌水，洗下孢子，调节孢子浓度为IO7个/ml，备用。将上述培养好的孢子悬浮液Iml均匀喷洒在装有11. 6g发酵培养基的250ml三角瓶中，发酵培养基包括3g干燥的莲子壳粉，2g豆柏粉，Ig稻草粉，O.1g硫酸铵，O.1g氯化钙，5. 4ml蒸馏水，121°C灭菌30min，在28°C下、湿度为70%条件下培养8 Ih后，培养基上的白色菌丝转化成灰黑色孢子，然后在真空冷冻干燥器在-110°C下进行干燥，直至含水量达到4 5%，再利用粉碎机低温粉碎至40 50目。
经测定，羧甲基纤维素酶活13. 99U/g、β -葡萄糖苷酶活51. 36U/g、蔗糖酶活 128. 32U/g、果胶酶活126. 34U/g、果胶裂解酶活123. 18U/g、木聚糖酶活61. 23U/g。
实施例2
将低温保藏的棘孢曲霉斜面菌种转接到新鲜PDA斜面上，置于恒温培养箱中，温度控制在28°C，经过72小时培养，待菌丝长满斜面并长满灰黑色孢子后，加入适量的无菌水洗下孢子，制成孢子悬浮液，调节孢子浓度到IO7个/ml，在250mL三角瓶中，装入IOg莲子壳固体发酵培养基，其中包括莲子壳粉4g，豆柏lg，硫酸铵O. lg，水5ml，12rC下灭菌 20min，冷却后接入ImL孢子悬浮液，置于28°C生化培养箱中发酵培养，经过84h待发酵固体表面布满灰黑色孢子后，加入无菌水，洗下孢子，调节孢子浓度为IO7个/ml，备用。将上述培养好的孢子悬浮液4ml均匀喷洒在装有45g发酵培养基的IOOOml三角瓶中，发酵培养基包括12g干燥的莲子壳粉，Sg豆柏粉，4g稻草粉，O. 4g硫酸铵，O. 4g氯化钙，20ml蒸馏水， 121 °C灭菌30min，在28 °C下、湿度为70 %条件下培养8 Ih后，培养基上的白色菌丝转化成灰黑色孢子，然后在真空冷冻干燥器在-110°C下进行干燥，直至含水量达到4 5%，再利用粉碎机低温粉碎至40 50目。
经测定，羧甲基纤维素酶活14.04U/g、葡萄糖苷酶活50.33U/g、蔗糖酶活 124. 41U/g、果胶酶活120. 61U/g、果胶裂解酶活119. 59U/g、木聚糖酶活62. 89U/g。
附酶活测定方法以及酶活定义
羧甲基纤维素酶的活性测定义在pH4. 8，50°C条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠产生I μ mol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
β-葡萄糖苷酶的活性测定义在pH4.8，5(TC条件下，每分钟水解水杨苷产生 I μ mol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
蔗糖酶的活性测定义在pH4. 8，50°C条件下，每分钟水解水杨苷产生I μ mol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
果胶酶的活性测定义在pH4. 8，45°C条件下，每分钟水解果胶产生I μ moID-半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
果胶裂解酶的活性测定义在pH4. 8，50°C条件下，每分钟水解水杨苷产生I μ mol D-半乳糖醛酸所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
木聚糖酶的活性测定义在pH4. 8，50°C条件下,每分钟水解木聚糖产生I μ mol木糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
羧甲基纤维素酶的活性测定方法
先加ImL的I %的CMC-Na溶液，再加0. 5mL酶液，在50°C下恒温反应30min，然后加入1. 5mLDNS试剂，沸水浴反应5min，流动水冷却，定容至25mL，在520nm下测定吸光值。
β -葡萄糖苷酶活性测定方法
先加ImL的I %的水杨苷溶液，再加0. 5mL酶液,在50°C下恒温反应30min,然后加入1. 5mLDNS试剂，沸水浴反应5min，流动水冷却，定容至25mL，在520nm下测定吸光值。
蔗糖酶活性测定方法
先加ImL的I %的蔗糖溶液，再加O. 5mL酶液，在50°C下恒温反应30min，然后加入1. 5mLDNS试剂，沸水浴反应5min，流动水冷却，定容至25mL，在520nm下测定吸光值。
果胶酶的活性测定方法
先加ImL的I %的果胶溶液，再加O. 5mL酶液，在50°C下恒温反应30min，然后加入1. 5mLDNS试剂，沸水浴反应5min，流动水冷却，定容至25mL，在520nm下测定吸光值。
果胶裂解酶的活性测定方法
先加ImL的I %的果胶溶液，再加O.1mL酶液与O. 4ml的缓冲液，在50°C下恒温反应30min，然后加入1. 5mLDNS试剂，沸水浴反应lOmin，流动水冷却，定容至25mL，在540nm 下测定吸光值。
木聚糖酶的活性测定方法
先加ImL的I %的果胶溶液，再加O. 2mL酶液与O. 3ml的缓冲液，在50°C下恒温反应30min，然后加入1. 5mLDNS试剂， 沸水浴反应15min，流动水冷却，定容至25mL，在550nm 下测定吸光值。
权利要求
1.一种以莲子壳为原料生产饲用复合酶的方法，其特征在于，它包括以下步骤(a)菌种选取在产羧甲基纤维素酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、果胶酶、果胶裂解酶和木聚糖酶的产生菌中挑选出棘孢曲霉作为生产菌株，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上于26 32°C下培养84 120h天成熟后保存备用；(b)菌种培养将挑选的棘孢曲霉菌株放入马铃薯葡萄糖琼脂培养基中在28°C的温度条件下复壮培养84 120h，然后放入固体发酵培养基中进行恒温培养60 72h ；(c)发酵处理按重量百分比取5% 8%的培养菌种的孢子悬浮液IO6 IO7个孢子/ml、接入已灭菌的固体发酵培养基中，该培养基的重量百分比构成为干燥莲子壳45 55%，豆柏25% 35%，稻草粉10% 15%，硫酸铵I % 2%，氯化钙I % 2%，混匀后加水调整至消毒后含水量为重量百分比60 70% ;恒温生化培养箱中保持环境温度为28 30°C，环境湿度为65 70%的条件下发酵60 84h ;发酵成熟的固体料进行真空冷冻干燥，直至含水量达到4 5%，再利用粉碎机低温粉碎至40 50目，得到饲用复合酶。
2.根据权利要求1所述的一种以莲子壳为原料生产饲用复合酶的方法，其特征在于所述的饲用复合酶包含有羧甲基纤维素酶、葡萄糖苷酶、蔗糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、木聚糖酶。
全文摘要
本发明公开了一种以莲子壳为原料生产饲用复合酶的方法，它包括以下步骤菌种选取；菌种培养；发酵处理，得到饲用复合酶。本发明具有的有益的效果是1.对大量菌株进行筛选得到能利用莲子壳生产高酶活复合酶的棘孢曲霉；2.以莲子壳为主要原料，添加少量的豆粕、稻草粉及无机盐，其原料来源广，价格低廉，生产成本低；3.固态发酵能耗低，培养周期短，投资少且原料比较粗放，终产物往往含有多种酶活性，很适合用作饲料添加剂；4.一次发酵即可获得多酶种、高酶活的发酵曲料，真空冷冻干燥、粉碎，能制备出可直接添加的复合酶饲料添加剂。操作简便，容易推广；5.产品酶系全且酶活高，作为畜、禽和水产的养殖动物的绿色饲料添加剂，使用范围广；6.生产中不产生废水废渣，后处理简单，基本无污染。
文档编号C12R1/66GK103045546SQ201210594538
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月30日 优先权日2012年12月30日
发明者陶能国, 吴锋, 石文卿, 黄师荣 申请人:湘潭大学