专利名称：以贝壳基质为原料制备人工皮肤的方法
技术领域：
本发明涉及生物组织工程及生物材料技术领域，特别是涉及一种以贝壳基质为原 料制备人工皮肤的方法。
背景技术：
对于重度烧伤患者在临床上需要为其进行人工植皮。采用自体皮肤进行植皮是最 佳治疗方案。然而，大面积烧伤患者通常无法提供充足的自体皮肤以供移植，故采用同种异 体皮肤进行移植。在使用异体皮肤治疗烧伤患者的医学实践中，首先需要进行配型，而且来 源有限。这就促使人们进行人工皮肤的研究。目前，我国的烧伤治愈率处世界一流水平。然 而被治愈的患者的皮肤缺乏汗腺。所以，目前在人工皮肤的研究中，如何促进烧伤患者皮肤 汗腺的再生是研究的前沿问题。利用干细胞进行烧伤患者的治疗以促进皮肤汗腺的再生是 目前研究的热点，并得到了大量的研究成果。在这些不同来源的干细胞中，骨髓间充质干细 胞(bone marrow stem cell, bMSC)由于取材方便、来源充足，在取材过程中不会对供体造 成严重伤害，也不会对供体的正常生命活动造成显著影响，同时，关于骨髓间充质干细胞的 相关研究非常充分，这就决定了它是一种有望广泛应用于临床的较为理想的干细胞种类。 目前已经有利用骨髓间充质干细胞成功修复烧伤患者皮肤汗腺的报道。人工皮肤是指通过人工方法制作的片状或膜状物，在临床上用于覆盖皮肤缺损患 者(主要是皮肤烧伤患者)的皮肤缺损部位，从而促进皮肤创面的愈合。这种愈合并不意 味着汗腺的修复或再生。人工皮肤的功能主要体现在以下方面①覆盖皮肤创面，与外界环境隔离开来，以避免感染。②作为药物的释放载体，持续地给创面给药，以促进创面的愈合。③作为种子细胞的载体，利用种子细胞的分泌、迁移，组织重构等功能对创面进行 全面修复。目前所报道的人工皮肤的功能一般包含上述功能中的一种或多种。在利用骨髓间充质干细胞修复烧伤患者皮肤汗腺的研究中，一般是将骨髓间充质 干细胞悬液直接涂布于患者皮肤创面，也有将骨髓间充质干细胞与材料复合制备人工皮肤 的报道。但尚未见将骨髓间充质干细胞与贝壳基质复合制备人工皮肤的报道。
发明内容
鉴于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种以贝壳基质和骨髓间充质 干细胞为材料制备人工皮肤的方法。本发明在国内外首次以贝壳基质为种子细胞载体，构 建具有生物活性的、可以促进患者皮肤汗腺重建的人工皮肤。贝壳是软体动物体外的一种保护性结构。由5-10% (w/w)的有机物和90-95% (w/ w)的无机物构成。无机物主要为碳酸钙，有机物即贝壳基质主要为糖蛋白及多糖。用稀酸 将贝壳处理后，其中的无机物被酸溶解，剩余部分即为贝壳基质。贝壳基质在天然状态下， 为由规整的五边形或六边形管状结构组成的立体网格状结构。网格的壁厚为1微米左右。网格多边形的边长为25微米左右。本发明中所述的贝壳为背角无齿蛘(Anodonta woodiana)贝壳。背角无齿蛘俗称 “河蛘”，属软体动物门，瓣鳃纲，蛘科，营淡水生，在重庆地区的资源贮量极其丰富。其贝壳 由相同形状的两瓣贝壳组成。成年河蛘的贝壳为扇形，厚度为1毫米左右，纵轴为150毫米 左右，横轴为90毫米左右。贝壳基质的形态与贝壳形态基本一致。贝壳基质来源丰富，价格低廉。与目前所有应用于人工皮肤研究中的材料相比，贝 壳基质的优势主要体现在以下方面①贝壳基质的成分以多糖为主，与其他应用于人工皮肤的生物组织来源的材料相 比，具有更低的免疫原性，同时还具有促细胞增殖的功能。②贝壳基质具有规整的空间网格结构。目前报道的人工皮肤也具有空间网格状结 构，但是孔径的大小及分布极不均勻，这种结构的人工皮肤与种子细胞复合后，种子细胞一 般仅在表面粘附，少数进入人工皮肤空隙的种子细胞，在人工皮肤移植于患者创面后，很难 向外生长以参与创面的修复。与目前所报道的人工皮肤相比，贝壳基质所具有的这种规整 的空间网格薄壁结构，为种子细胞的立体粘附提供了有利条件。同时，在本人工皮肤移植于 患者创面后，这种规整的空间网格薄壁结构还可以为汗腺腺泡的发育提供一种三维支架， 以引导皮肤组织重建。③贝壳基质具有亲水性，可以避免在患者体温作用下，由于人工皮肤中水分的挥 发而变干乃至连带创面皲裂。贝壳基质具有可降解性，随着创面的修复，贝壳基质逐步被降 解吸收，可避免清创过程给患者所导致的痛苦。本发明以贝壳基质为原料制备人工皮肤的方法依次通过下列步骤实现(1)贝壳的准备取河蛘，去除内脏团和闭壳肌，40°C烘干，去角质层，沿贝壳外周去除5毫米宽度；(2)贝壳基质的制备将贝壳浸泡于v/v浓度为1-5%的盐酸和v/v浓度为5-20%的戊二醛混合溶液 中，1周，磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗3次，每次2小时，75%医用酒精浸泡2分钟，得贝壳基 质，置于磷酸盐缓冲溶液密封保存备用；(3)骨髓间充质干细胞的准备常规方法取骨髓1毫升，流式细胞仪分离骨髓间充质干细胞，置于含v/v浓度为 10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基)中培养，常规方法制成细胞悬液；(4)人工皮肤的制备将步骤(2)所得贝壳基质置于含明胶基底的培养皿中，展平，胎牛血清表衬8-12 小时，加入细胞浓度为lX106-lX107ml的步骤(3)所得细胞悬液，至淹没贝壳基质为止， 培养12小时，沿培养皿边缘吸出培养基，添加DMEM培养基(完全培养基)至淹没贝壳基质， 每隔3天换液一次，培养至15-20天为止，得人工皮肤。人工皮肤的保存及运输更换新鲜完全培养基后，连同培养皿一起密封，平置，低温保存(0_8°C )及运输， 保质期3-7天。人工皮肤的使用临床移植前，可根据患者创部的形态将人工皮肤任意切割成所需形态，单层覆盖
4在患者创部。若创面较大，可将多张人工皮肤一起使用。本发明的优点是本发明所制备的人皮肤与报道的相关研究相比，具有材料来源丰富价廉物美的优 点。同时，具有较低的免疫原性，可以为患者皮肤的修复提供种子，引导皮肤的重构和汗腺 的形成。本人工皮肤具有可降解性，随着创面的修复，贝壳基质逐步被降解吸收，可避免清 创过程中给患者所导致的痛苦。
具体实施例方式实施例1 (1)贝壳的准备取河蛘，去除内脏团和闭壳肌，40°C烘干，去角质层，沿贝壳外周去除5毫米宽度；(2)贝壳基质的制备将贝壳浸泡于v/v浓度为的盐酸和v/v浓度为20%的戊二醛混合溶液中，1 周，磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗3次，每次2小时，75%医用酒精浸泡2分钟，得贝壳基质， 置于PBS密封保存备用；(3)骨髓间充质干细胞的准备常规方法取骨髓1毫升，流式细胞仪分离骨髓间充质干细胞，置于含v/v浓度为 10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基)中培养，常规方法制成细胞悬液；(4)人工皮肤的制备将步骤(2)所得贝壳基质置于含明胶基底的培养皿中，展平，胎牛血清表衬8小 时，加入细胞浓度为1X106个/ml的步骤(3)所得细胞悬液至淹没贝壳基质为止，培养12 小时，沿培养皿边缘吸出培养基，添加20ml完全培养基，每隔3天换液一次，培养至15天为 止，得人工皮肤。实施例2 (1)贝壳的准备(如实施例1)(2)贝壳基质的制备将贝壳浸泡于v/v浓度为5%的盐酸和v/v浓度为10%的戊二醛混合溶液中，1 周，磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗3次，每次2小时，75%医用酒精浸泡2分钟，得贝壳基质， 置于PBS密封保存备用；(3)骨髓间充质干细胞的准备(如实施例1)(4)人工皮肤的制备将步骤(2)所得贝壳基质置于含明胶基底的培养皿中，展平，胎牛血清表衬10小 时，加入细胞浓度为1X107个/ml的步骤(3)所得细胞悬液至淹没贝壳基质为止，培养12 小时，沿培养皿边缘吸出培养基，添加20ml完全培养基，每隔3天换液一次，培养至20天为 止，得人工皮肤。实施例3 (1)贝壳的准备(如实施例1)(2)贝壳基质的制备将贝壳浸泡于v/v浓度为3 %的盐酸和v/v浓度为5 %的戊二醛混合溶液中，1周，
5磷酸盐缓冲溶液(PBS)漂洗3次，每次2小时，75%医用酒精浸泡2分钟，得贝壳基质，置于 PBS密封保存备用；(3)骨髓间充质干细胞的准备(如实施例1)(4)人工皮肤的制备将步骤(2)所得贝壳基质置于含明胶基底的培养皿中，展平，胎牛血清表衬12小 时，加入细胞浓度为1X107个/ml的步骤(3)所得细胞悬液至淹没贝壳基质为止，培养12 小时，沿培养皿边缘吸出培养基，添加20ml完全培养基，每隔3天换液一次，培养至20天为 止，得人工皮肤。
权利要求
一种以贝壳基质为原料制备人工皮肤的方法，其特征在于，依次通过下列步骤实现(1)贝壳的准备取河蚌，去除内脏团和闭壳肌，40℃烘干，去角质层，沿贝壳外周去除5毫米宽度；(2)贝壳基质的制备将贝壳浸泡于v/v浓度为1 5％的盐酸和v/v浓度为5 20％的戊二醛混合溶液中，1周，磷酸盐缓冲溶液漂洗3次，每次2小时，75％医用酒精浸泡2分钟，得贝壳基质，置于磷酸盐缓冲溶液密封保存备用；(3)骨髓间充质干细胞的准备常规方法取骨髓1毫升，流式细胞仪分离骨髓间充质干细胞，置于含v/v浓度为10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，常规方法制成细胞悬液；(4)人工皮肤的制备将步骤(2)所得贝壳基质置于含明胶基底的培养皿中，展平，胎牛血清表衬8 12小时，加入细胞浓度为1×106 1×107/ml的步骤(3)所得细胞悬液，至淹没贝壳基质为止，培养12小时，沿培养皿边缘吸出培养基，添加DMEM培养基至淹没贝壳基质，每隔3天换液一次，培养至15 20天为止，得人工皮肤。
全文摘要
一种以贝壳基质为原料制备人工皮肤的方法，将贝壳经去角质层、盐酸和戊二醛混合溶液浸泡后得贝壳基质、贝壳基质于含明胶基底的培养皿中浸泡骨髓细胞悬液等一系列步骤制得。与报道的相关研究相比，具有材料来源丰富价廉物美的优点。同时，具有较低的免疫原性，可以为患者皮肤的修复提供种子，引导皮肤的重构和汗腺的形成。本人工皮肤具有可降解性，随着创面的修复，贝壳基质逐步被降解吸收，可避免清创过程中给患者所导致的痛苦。
文档编号A61L27/60GK101927035SQ201010231979
公开日2010年12月29日 申请日期2010年7月20日 优先权日2010年7月20日
发明者刘彬, 张耀光, 戴丽, 王志坚, 蒲德永 申请人:西南大学