固定化的全人源ecm包被基质的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种固定化的人脐带来源的细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)的制备方法。
【背景技术】
[0002]人胚胎干细胞(human embryonic stem cell, hESC)是具有自我更新能力的多能干细胞，它们从囊胚期的内细胞团分离得到，有分化为三胚层的能力，因此用于组织修复和药物筛选的前景广阔。适合hESC临床应用的培养体系必须具有无动物源性，成分确定，适合大规模生产等优点。而hESCs对生长条件苛刻。只有合适的培养基质与培养基相互配合，才能长期维持其未分化状态。在传统的培养体系中，人胚胎干细胞通常分为有饲养层和无饲养层培养。在有饲养层培养体系中，hESC通常是在CF-1小鼠饲养层上进行培养。为了降低培养体系中的动物成分，制备适合hESC临床应用的培养基质，一些人源细胞取代了小鼠的饲养层。尽管已经证实新生儿包皮成纤维细胞，成人皮肤成纤维细胞，人输卵管上皮细胞，人脐带来源细胞等可以支持hESC的生长，但是这种共培养体系的操作步骤繁琐。首先需要将饲养层细胞用丝裂霉素C或伽马射线处理，使其失去增殖能力。其次在hESCs每次传代前都需要预铺饲养层细胞，它们的状态和密度都直接影响着hESCs的生长。为了简化培养体系，很多人尝试用各种细胞外基质(ECM)代替饲养层细胞。目前基质胶(Matrigel)是无饲养层培养体系中最常用的包被材料，它是从小鼠EHS肉瘤提取的，含有层黏连蛋白，胶原IV，硫酸乙酰肝素，巢蛋白等多种成分。但是Matrigel来源于小鼠EHS肉瘤，含有鼠源成分，所以不适合hESCs的临床应用。为了减少培养体系中动物成分，使人胚胎干细胞更好地应用于临床，一些无异源成分的ECM包被基质被应用于人胚胎干细胞的培养，如玻连蛋白，多肽，人胎盘提取的ECM等。但是它们的生产工艺复杂，不适合大规模生产，且效果不及饲养层细胞和Matrigel。本发明涉及的无异源成分的培养基质来源于人脐带间充质细胞，制备方法简单，是一种全人源的，可以长期保存的，适合人胚胎干细胞长期培养生长的固定化细胞外基质。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种固定化的全人源细胞外基质(extracelluar matrix,ECM)包被基质及其制备方法，以降低人胚胎干细胞培养体系中的异源成分，为最终临床级人胚胎干细胞的体外扩增探索出一个新的途径。
[0004]固定化的人源ECM包被基质的制备步骤是:1)从人脐带获得脐带间充质细胞；2)甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备。
[0005]其中，从人脐带获得脐带间充质细胞的方法为:
[0006]I)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次；
[0007]2)把脐带剪成小段，剥离两动脉和一静脉；
[0008]3)血管去除后，分离华通氏胶；
[0009]4)将分离出的华通氏胶剪成小块，加入适量培养基，放入37°C的CO2培养箱中培养;
[0010]5)培养三天后隔4-5天换液一次，2-3周后可见组织块周围有细胞爬出；
[0011]6)当细胞80%汇合后，进行传代培养；
[0012]7)人脐带间充质细胞Pl代后每2-3天传代一次。
[0013]其中，甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备方法为:
[0014]I)将P5-P15代的人脐带间充质细胞按正常传代密度传到培养板上；
[0015]2)待其生长4-5天达到100%汇合，以便积累足够的ECM ；
[0016]3)开始裂解前，加入洗液I洗一次；
[0017]4)加入裂解液,室温放置5-10分钟；
[0018]5)裂解结束后，立即吸去裂解液，加入洗液2，洗4-5次；
[0019]6)最后一次洗漆结束后,加入60%?100%甲醇室温固定；
[0020]7)培养板真空干燥，4°C保存；
[0021]其中，上述甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备方法中，所用试剂的配方为:
[0022]I)洗液 1:10mM Tris-HCl+10mM EDTA, pH = 8.0,高压灭菌后室温保存；
[0023]2)裂解液:0.3%脱氧胆酸钠 +1mM Tris-HCl+lOmM EDTA, pH=8.0,0.22 μ m 滤膜过滤，室温保存；
[0024]3)洗液2:ImM EDTA，pH=8.0,闻压灭囷后室温保存。
[0025]优选地，步骤6)中加入80%?90%甲醇室温固定，固定时间5-10min。
[0026]本发明披露的固定化的全人源ECM包被基质及其制备方法主要有以下有益效果:
[0027]I)解决了 hESCs培养中操作繁琐的问题，制备了一种即用型的hESCs培养基质；
[0028]2)用人脐带间充质细胞作为基质来源，解决了 hESCs培养基质的异源性问题；
[0029]3)改进了裂解方法，裂解液和洗液配方，制备方法更加简单；
[0030]4)将裂解细胞获得的细胞外基质用甲醇进行固定，使培养基质更加稳定，这种固定化基质可以支持hESCs的长期生长并维持其未分化状态。
[0031]综上，上述的固定化的全人源ECM包被基质及其制备方法，可以大大降低人胚胎干细胞培养体系中的异源成分，为最终临床级人胚胎干细胞的体外扩增探索出新的途径。
【附图说明】
[0032]图1hESC在固定化人源ECM上连续传25代后的克隆形态
[0033]图2hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI / Oct-4染色结果
[0034]图3hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI / Sox2染色结果
[0035]图4hESC在固定化人源ECM上连续传25代后DAPI / SSEA-4染色结果
[0036]图5hESC在固定化人源ECM上连续传25代后畸胎瘤HE染色结果
[0037]图6hESC在固定化人源ECM上连续传25代后核型检测结果
[0038]图5中，A:内胚层(腺体)，B:中胚层(脂肪)，C:外胚层(神经上皮)
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明:
[0040]实施例1:将固定化全人源ECM应用于人胚胎干细胞培养与结果检测
[0041]实验中所用的主要仪器及型号:超纯水仪(SMSV0000，Millipore) ；C02细胞培养箱(Thermo，3111，美国)；超净台(YJ-VS型，无锡一净净化设备有限公司)；荧光倒置相差显微镜(OLYMPUS，1X71，日本)；石蜡切片机(YD202A，金华市益迪医疗设备厂)。
[0042]1.制备固定化的人源ECM包被基质
[0043]1.1从人脐带获得脐带间充质细胞
[0044]I)将从人足月胎儿得到的新鲜人脐带用PBS冲洗三次；
[0045]2)把脐带剪成小段，剥离两动脉和一静脉；
[0046]3)血管去除后，分离华通氏胶；
[0047]4)将分离出的华通氏胶剪成小块，加入适量培养基，放入37°C的CO2培养箱中培养;
[0048]5)培养三天后隔4-5天换液一次，2-3周后可见组织块周围有细胞爬出；
[0049]6)当细胞80%汇合后，进行传代培养；
[0050]7)人脐带间充质细胞Pl代后每2-3天传代一次。
[0051]1.2甲醇固定化人源ECM包被培养板的制备
[0052]1.2.1试剂配方:
[0053]I)洗液 1:10mM Tris-HCl+lOmM EDTA, pH=8.0,高压灭菌后室温保存；
[0054]2)裂解液:0.3%脱氧胆酸钠 +1mM Tris-HCl+lOmM EDTA, pH=8.0,0.22 μ m 过滤后室温保存；
[0055]3)洗液2:lmM EDTA, pH=8.0,高压灭菌后室温保存。
[0056]1.2.2制备步骤:
[0057]I)将P5-P15代的人脐带间充质细胞按正常传代密度传到培养板上；
[0058]2)待其生长4-5天达到100%汇合，以便积累足够的ECM ；
[0059]3)开始裂解前，加入洗液I洗一次；
[0060]4)加入裂解液,室温放置5-10分钟；
[0061]5)裂解结束后，立即吸去裂解液，加入洗液2，洗4-5次；
[0062]6)最后一次洗漆结束后,加入60%?100%甲醇室温固定5_10分钟；
[0063]7)培养板真空干燥，4°C保存。
[0064]2.人胚胎干细胞在固定化人源ECM培养板上的传代培养
[0065]2.1人胚胎干细胞的复苏
[0066]I)从液氮中取出冻存的人胚胎干细胞冻存管，立即投入37°C水浴中快速的振动以迅速解冻(控制在I分钟之内)；
[0067]2)当只有少许冰晶存在时，从水中取出冻存管。用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍;
[0068]3)将细胞转移到15毫升离心管中，缓慢滴加预热的人胚胎干细胞培养基，前I毫升要慢些，后面可加快，混匀。以200g的速度离心5分钟；
[0069]4)吸弃上清液。人胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀；
[0070]5)转移细胞悬浮液到一个包被了固定化人源ECM的培养板中；
[0071 ]6)将培养板放入37°C的C02培养箱中；
[0072]7)复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人胚胎干细胞完全培养基。
[0073]2.2人胚胎干细胞的的传代
[0074]I) 4°C取出固定化人源ECM培养板，恢复至室温；
[0075]2)如果上一代的人胚胎干细胞是在有饲养层条件下培养，按饲养层条件下的传代步骤进行，换成无饲养层条件下的培养基即可。
[0076]3)如果上一代的人胚胎干细胞是在无饲养层条件下培养，按以下步骤传代；
[0077]a)吸弃旧的培养液，加入中性酶Img