专利名称：：超声波诱导植物组织基因转移方法
技术领域：
：本发明利用超声波处理将外源基因直接导入植物组织细胞内，是一种诱导植物组织直接基因转移的新方法，属生物工程
技术领域：
。植物基因工程的关键技术之一，是如何高效地将外源基因导入植物细胞，并再生出转基因植株，以用于作物品种改良，培育出高产、优质、抗病的新品种。然而，作为植物基因工程最重要对象的禾谷类作物(属于单子叶植物)如小麦、玉米等，恰恰又是基因工程技术应用的难点，其困难之处即在于基因转移。这是因为，多数植物基因转移方法只适用于以原生质体(植物去壁细胞)或带壁的悬浮培养细胞作为转基因受体，而对于单子叶植物由原生质体或悬浮细胞再生植株很困难。克服这一困难的办法是选用植物组织块(幼胚、愈伤组织、叶片等)作为转基因的直接受体，因为任何植物(包括单子叶植物)由组织块再生植株都是很容易做到的。这就需要发展有效的、能以植物组织块作为转基因受体的方法。在现有的植物基因转移方法中，基因枪法是一种能以植物组织块作为转基因对象的方法[SanfordJCetal.ParticleSciTechnol，1987527]。该方法的基本原理是将DNA包裹于微小的金属钨或金颗粒的表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入受体细胞的核中整合并表达。该方法的优点是可以免去分离原生质体的麻烦，直接转化植物的各种外植体、愈伤组织以及胚性细胞系。该方法的缺点是转化效率较低，因为只有击中具有潜在再生能力的胚性细胞时才有可能获得转化植株；此外，仪器价格也比较昂贵。WO专利91/00358提出利用超声处理诱导外源遗传物质进入植物带壁的悬浮培养细胞的方法。但是，上述方法未涉及利用植物组织块作为转基因直接受体。由于植物组织块是带壁细胞的聚集体，它不同于悬浮于溶液中的带壁细胞，因此，需要经过特殊的超声处理，才可以实现植物组织块的基因转移。本发明的目的，是提出一种超声波诱导植物组织基因转移的方法，即利用脉冲型超声波处理，将外源基因导入各种植物组织块中，以用于作物品种改良，培育出高产、优质、抗病的新品种。本发明提出的利用超声波诱导植物组织基因转移的方法，由下列各步骤组成1)植物材料组织块的预处理将植物组织块切成若干毫米见方的小块，以增加基因转移的效率；2)制备缓冲液，缓冲液的pH值为6.5～8.5；3)将外源DNA加进缓冲液中，外源DNA的浓度大于10μg/ml，以保证基因转移具有足够的效率；4)将预处理过的植物组织块放入适当的容器中，再加入上述第3)步所得含DNA的缓冲液，缓冲液加入量一般应保证溶液液面没过植物组织块；5)将超声波探头置于容器外壁上或伸入溶液中，开启超声波信号发生器。超声波为脉冲型，超声波作用时间为0.5～60分钟；声波频率为20K～5MHz；声强为0.1～5w/cm2；一个脉冲周期内，超声波作用时间为1～50ms，脉冲占空比为5∶0.1～5。图1是pBI121质粒的物理图谱图。超声波诱导基因转移的机理，主要是超声波的空化作用。所谓空化作用，就是液体中存在的一些小气泡在超声波作用下发生共振并伴随产生的一系列物理现象。如空化作用发生时，在空化中心会产生局部的高温高压，使得细胞壁产生局部的穿孔，细胞膜也产生局部和暂时的结构改变，即也造成一系列的穿孔效应，溶液中的DNA分子可以藉此扩散进入细胞。在高等植物的许多组织中，细胞间的通道里存在一些微小气泡，这些气泡在超声作用下将成为空化中心，从而对周围的细胞发生作用。由于这种气泡是普遍存在的，这就使得大量细胞都能感受到超声波的空化作用。本发明提出一种新的利用超声波诱导植物组织直接基因转移的方法。由于此方法可以将外源基因导入各种植物组织块中，因此特别适合于单子叶植物的基因转移，特别是禾谷类作物的基因转移。该方法同时还具有设备便宜、操作方便和转化效率高(见实施例)等特点，因此，在植物基因工程中将有着广泛的应用前景。本发明的实施过程中，待转移基因的植物组织块，在超声处理前，一般切成若干毫米见方的小块，以增加基因转移的效率。本发明使用的超声处理缓冲液，其成分为氯化钠(浓度为15mmol/L)，柠檬酸钠(分子式Na3C6H5O7.2H2，浓度为1.5mmol/L)，缓冲液的pH值为7.5。缓冲液的pH值过大或过小，都不利于DNA的稳定。缓冲液也可以采用植物组织培养液。为达到一定的基因转移效率，外源DNA浓度一般不宜低于10μg/ml。另外，为提高外源DNA的转移率，与其他转基因方法相同，也可在缓冲液中加入适量辅佐DNA(如鲑鱼精DNA)及二甲基亚砜(DMSO)。将超声波导入容器的方法，是将超声探头置于容器的底部或外壁，或将超声探头伸入溶液中。当将超声探头置于容器的底部或外壁时，应在探头与外壁或底部之间涂上超声耦合剂，以减少超声波穿过时的能量损失。超声耦合剂可以采用一般医学理疗超声使用的耦合剂。本发明的三个实施例为；1.超声波诱导小麦愈伤组织基因转移将小麦幼穗诱导的愈伤组织切成小块(直径约3mm)；置于无菌容器中(用Φ35mm培养皿)，加入3ml缓冲液，内含pBI121质粒(物理图谱见附图1，具有PCaMV35S-GUS基因和Pnos-NPTII基因。前者用作报告基因，其表达产物与底物X-Gluc作用后显示兰色；后者用作卡那霉素(Kan)抗性选择)10μg/ml和鲑鱼精DNA100μg/ml，以及20％DMSO。然后，将该容器经耦合剂耦合而置于超声探头上，进行超声处理。超声波为脉冲型，频率800KHz，脉冲占空比15ms∶3ms，声强与时间的组合为0.5w/cm2×30min和1.0w/cm2×30min二种。超声处理后，将材料随机分成二部分，第一部分放在N6(朱自清等，通过氮源比较试验建立一种较好的水稻花药培养基，中国科学，5484-490，1975)液体培养基中，培养过夜后检测GUS基因活性；第二部分放在不含Kan的MS(Murashige，T.，etal.，Physiol.Plant.，15，473-497，1962)固体培养基上，培养两天后再转至含Kan50mg/L、Kan75mg/L的同样培养基上，进行Kan抗性选择，三天后检测GUS活性。实验中，设置三种对照组，即加入pBI121质粒但无超声作用，有超声作用但未加入pBI121质粒，既无超声作用也未加入pBI121质粒。实验结果显示，只在加pBI121质粒并经超声处理的愈伤组织中，检测到了GUS活性。GUS基因表达率达到31.4％，愈伤组织转化面积达到70～80％，见表1。表1超声处理后的小麦愈伤组织中GUS基因的短暂表达</tables>2.超声波诱导烟草叶片基因转移白肋烟(Nicotianatabacumvar.WhiteBurley)无菌试管苗生长在14小时光照/10小时黑暗的培养室中，光照强度为1500～2000lux，昼夜温度分别为28℃±1℃，22℃±1℃。取无菌试管苗的中部展开叶片，切成5mm见方的小块，加入容器中。容器中预先加入含5％DMSO的缓冲液3ml，以及pBI121质粒DNA20μg/ml，鲑鱼精DNA40μg/ml。室温下以声强为0.5w/cm2的脉冲超声波(占空比15ms∶3ms)处理30分钟。超声后叶块组织用不加DMSO的缓冲液洗涤3次，接种在MS无激素培养基上(MS0)，置于LPH-200-RDSCT生长箱(NipponMedicaandChemicalLnstrumentsCo.Ltd.，Tokyo，Japan)中培养，光周期为16小时光照/8小时黑暗，光强3000～4000lux，昼夜温度分别为25±1℃，20±1℃。试验中同时设加质粒DNA不作超声处理，超声处理不加质粒及不超声不加质粒3种对照。GUS检测叶块在MSO上培养一天后，每种处理方法取样10块，作徒手切片，然后于37℃下与X-Gluc(检测GUS基因表达产物的底物，配方参照Jia，S.R.，etal.，PlantCellReports，8336-340，1989)溶液一起温育过夜，检测GUS基因的短暂表达。短暂表达率按具有转化细胞的外植体数占检测外植体总数的百分比计算。转化组织面积百分数则为转化细胞面积占切片总面积的百分数的平均值。Kan抗性选择对照组及经超声波处理组的叶块，在MSO上培养3天后，转移到附加Kan100mg/L的分化培养基上进行抗性选择。分化培养基的组成是MS基本成分附加6-苄基腺嘌呤(BA)1.0mg/L，α-萘乙酸(NAA)0.1mg/L，pH5.8，用0.7％琼脂固化。再生的Kan抗性芽转移至含Kan100mg/L的1/2MSO上诱导生根。培养物均于LPH-200-RDSCT生长箱中培养，培养条件同前。GUS基因的短暂表达超声处理后的叶片，培养一天后，其中86％检测到了GUS基因的短暂表达，叶片组织的平均转化面积达到60-70％。三种对照组叶片均未检测到GUS基因的表达。稳定转化-Kan抗性选择结果超声加质粒及三种对照组的叶片在MSO上培养3天后，转移至含Kan100mg/L的分化培养基上进行培养，30天后统计芽分化频率，超声加质粒组叶片在选择培养基上的芽分化频率(即分化芽的叶片数占处理总叶片数的百分比)为60％。三种对照组的叶片则在含Kan100mg/L的培养基上全部死亡。外源基因在R1代中的分离将5株R0代转基因植株自交的种子，让其在含Kan100mg/L的选择性养基上萌发。生长旺盛而根系发育正常的小苗被认为具有Kan抗性(KanR)，生长衰弱而无根的小苗，被认为是对Kan敏感的(KanS)。无论KanR还是KanS的小苗，均作GUS活性的组织化学检测。表2显示，5株转基因植株中的4株T2，T5，T6，T9，其NPTII和GUS基因都以3∶1的比例分离，表明外源基因是单位点插入；另一株转基因植株T11，其外源基因的分离符合15∶1，表明发生了二个位点的插入。另外，两个标记基因是紧密连锁的，在所有的390株KanR苗中，只有6株显GUS阴性；在所有的93株KanS苗中，只有8株显GUS阳性。表2外源基因在R1代苗中的分离*按15∶1分离比的卡方值χ2(P0.05，df1)＝3.84KanR和KanS分别表示卡那霉素抗性和卡那霉素敏感；GUS+和GUS-分别表示GUS阳性和GUS阴性。3.超声波诱导小麦幼胚基因转移京红5号小麦于授粉后约12天，在无菌条件下分离幼胚，幼胚长约1.0mm。幼胚分离后，放入无菌容器中，加入2ml超声处理缓冲液，含pBI121质粒35μg/ml及5％DMSO。将容器置于超声探头上，进行超声处理。超声波采用脉冲式，脉冲占空比为15ms∶3ms。超声波声强与作用时间见表2。超声处理后，将幼胚转到含2mg/L2，4-D的固化MS培养基上，诱导愈伤组织，然后在含1mg/L2，4-D的MS培养基上继代培养。三个月后，将培养基中的2.4-D浓度减至0.5mg/L，使得愈伤组织高频率地再生出植株。超声波处理以后三个月，在幼胚诱导出的愈伤组织中检测到了GUS基因的表达，处理组最高表达率达到67％，见表2。在由愈伤组织再生出的植株的叶片中，也检测到了部分叶片有GUS表达。进一步将再生植株移栽大田，开花结实后，收取成熟种子。对一丛小麦后代约300粒种子萌发后进行GUS检测，其中有5株在根部检测到了GUS基因的表达。表3超声处理后三个月在小麦幼胚诱导出的愈伤组织中GUS基因的表达</tables>上述三个实施例说明，超声波诱导植物组织直接基因转移方法，不仅能转化双子叶植物，也能转化单子叶植物；不仅能获得外源基因在转化体中的短暂表达，也能获得外源基因在转化体中的稳定表达，并能传递至后代。权利要求1.一种超声波诱导植物组织基因转移的方法，其特征在于该方法由下列各步骤组成1)植物材料组织块的预处理将植物组织块切成若干毫米见方的小块；2)制备缓冲液，缓冲液的pH值为6.5-8.5；3)将外源DNA加进缓冲液中，外源DNA的浓度大于10μg/ml；4)将预处理过的植物组织块放入容器中，再加入由第3)步所得含DNA的缓冲液；5)将超声波探头置于容器外壁上或伸入溶液中，开启超声波信号发生器。超声波为脉冲型，超声波作用时间为0.5～60分钟；声波频率为20K～5MHz；声强为0.1～5w/cm2；一个脉冲周期内，超声波作用时间为1～50ms，脉冲占空比为5∶0.1～5。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的植物材料为双子叶植物或单子叶植物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的植物组织为植物的愈伤组织、叶片或幼胚。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的缓冲液组成为氯化钠(浓度为15mmol/L)，柠檬酸钠(分子式Na3C6H5O7.2H2O，浓度为1.5mmol/L)，缓冲液的pH值为7.5。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的外源DNA为质粒或线形DNA。全文摘要本发明涉及一种利用超声波诱导植物组织基因转移的方法。该方法是将植物组织块经预处理后放入盛有适合于植物组织培养且含外源DNA的缓冲液的容器中,再将超声探头置于容器壁上或直接伸入溶液中,开启超声波,在脉冲型超声波的作用下将外源基因导入植物组织块中。本发明的基因导入方法既适合于双子叶植物也适合于单子叶植物特别是禾谷类作物的基因转移,且具有设备便宜、操作方便、转化效率高等特点,因此,在植物基因工程中将有广泛的应用前景。文档编号C12N15/87GK1180746SQ9711192公开日1998年5月6日申请日期1997年7月4日优先权日1997年7月4日发明者许宁,赵南明,章力建,贾士荣申请人:清华大学,中国农业科学院生物技术研究中心