专利名称：基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系及其制备方法
技术领域：
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系，尤其涉及一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)及其制备方法。
背景技术：
本领域公知，HBV细胞模型是筛选抗药物、研究其生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具。尤其在研究有关肝疾病的发病机制、免疫机制、抗病毒药物的筛选中具有重要作用；其中，Hep2. 2. 15细胞是HBV细胞模型开发研究的里程碑，有研究显示，其用含2个HBV头对尾二聚体的pDolt-HBV-Ι重组载体转染H印G2细胞，经G418筛选后获得一个产高水平HBsAg和HBeAg的细胞克隆，其胞内外均能检测到HBV-DNA以及具有感染性的完整病毒颗粒。迄今，Hep2. 2. 15仍是相关领域应用最为广泛的HBV细胞模型。
然而，HepG2. 2. 15在HBV研究方面仍存在下述缺陷(1)H印G2.2. 15HBV蛋白如HBsAg, HBeAg表达水平相对较低，不利于相关病毒蛋白的研究，且与HBV-DNA —样，其表达水平不稳定，受培养环境等因素影响较多；(2)其整合的HBV基因型非B、C基因型，对于研究中国人群HBV发病或耐药机制方面的研究存在相当的局限性。鉴于中国是肝炎发病大国，Hep2. 2. 15显然已经不能完全满足目前相关的研究，国内目前的有关研究需要良好的HBV细胞模型和实验平台。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种基于!fepG2稳定表达HBV野生株细胞系，尤其涉及一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株(HepG2.HSWT)及其制备方法。本发明的细胞系有利于中国人群HBV发病或耐药机制方面的深入研究，可进一步用于筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的HBV细胞模型的建立。本发明的基于!fepG2稳定表达HBV野生株细胞系，能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可产生HBV颗粒；与所述的的Hep2. 2. 15细胞相比，本发明的细胞系表达HBsAg及HBeAg明显高于!fep2· 2. 15，细胞上清HBV颗粒水平与Ifep2· 2. 15基本持平。本发明尤其提供了一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株0fepG2. HSWT)，所述的细胞株H印G2. HSffT其整合的HBV基因型为B或C基因型；该细胞株对LAM及ADV均敏感；HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。本发明将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染H印G2细胞后，通过潮霉素筛选，然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与H印2. 2. 15细胞株相比较，最终建成基于H印G2稳定表达HBV野生株细胞系，获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2. HSWT,已于2011年6月I日保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 4909，分类命名人肝癌细胞株H印G2. HSWT。
本发明中，所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT，来源于福建医科大学分子病毒
实验室;所述质粒的载体骨架为pREPIO载体,该载体的优势在于潮霉素Hygromycin抗性基因有利于细胞筛选工作以及EBNA-I基因转录蛋白能够上调含OriP复制原点的真核表达质粒中基因转录和表达；
所述HBV复制子为含CP启动子以及完整HBV前基因组的HBV1. 2倍体(B型，GeneBank登录号AF100309)，插入切除RSV启动子的pREPIO，构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-WTo本发明的细胞株具有以下生物学特性能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并可产生HBV颗粒；与目前广泛使用的H印2. 2. 15相比，其表达HBsAg及HBeAg明显高于Hep2. 2. 15，细胞上清HBV颗粒水平与Hep2. 2. 15基本持平，该细胞株整合的HBV基因型为B或C基因型；其对LAM及ADV均敏感；HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。本发明的高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株0fepG2. HSWT)通过下述方法和步骤制备(I)质粒转染H印G2细胞①细胞培养!fepG2细胞以DMEM培养液培养；所述培养液来源于Gibco公司，培养液中含10 %小牛血清，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，0. 03%谷氨酰胺；②细胞转染将处于生长对数期的细胞，以0.25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数；按5X IO5细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养18-24小时后，待细胞约80-90%融合成片时，换新鲜无抗生素的培养液，准备转染；按照每孔转染2 μ g的量，将50 μ I OptiDMEM培养液与5 μ I Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合，同时将2 μ g质粒DNA稀释于50 μ I OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置5分钟；将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置20分钟；将混合物均匀滴加入6孔板中，6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液，继续培养；(2)潮霉素筛选细胞克隆①转染后细胞培养24小时后扩大培养至IOcm培养皿，并设空白对照(未转染H印G2细胞)；②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml ；③每3天换液一次；④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况；⑤挑取细胞克隆至24孔培养板，以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦获取6株HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆，将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；(3)细胞克隆的有限稀释步骤(2)中获得的6株阳性克隆中的I株细胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平较高，经定量后上清HBsAg为30IU/ml左右，HBeAg水平60PeIU/ml左右，HBV-DNA水平维持于104-105COpieS/ml ;细胞传至10代左右，采用有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆；将处于生长对数期的细胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为lOcell/ml，接种96孔培养板，每孔150ul培养基(含潮霉素浓度150ug/ml);显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种Icell的培养孔，继续培养，每周换液一次；2_3周后待细胞密度约60%左右后传至24孔培养板继续培养；待24孔中细胞密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的一株细胞克隆定义为pREP-HBV-WT ；(4) HBV野生型细胞株的生物学特征及表型耐药分析①细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测
HBsAg 及 HBeAg 精确定量试剂盒米用 Abbott 公司 Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit, HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供的说明书中记载的步骤，real-time PCR扩增仪采用ABI-7300，检测结果如图I所示；②细胞内病毒复制检测细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90%汇合度时加入400ul细胞裂解液，37°C过夜(细胞裂解液 lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris. HCl Ph7. 5> IOmM EDTA、IOOmM NaCl、0. 2% SDS)，加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE0 I. 3%凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交；结果显示HBV杂交信号提示胞内HBV复制；③HBV野生型细胞株细胞表型耐药分析IO5Cell/孔细胞密度接种12孔板，细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物，拉米夫定设 0、0. luM、0. 3uM、luM、3uM、10uM、30uM、IOOuM 8 个浓度梯度，阿德福韦设 0、0. luM、
0.3uM、luM、3uM、10uM 6个浓度梯度，每个浓度梯度设复孔，隔天换液，第10天检测细胞上清HBV-DNA水平，细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况。检测分析所述的高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HSffT,结果显示，细胞上清HBV-DNA水平随LAM以及ADV浓度梯度升高从IO4下降至检测水平以下，表明对LAM及ADV均敏感(如图2所示)；杂交结果显示，HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。本发明建立了一种基于H印G2稳定表达HBV野生株细胞系，尤其是高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株0fepG2. HSWT)，该细胞系HBsAg、HBeAg表达水平明显高于H印G2. 2. 15，表达水平稳定，受培养环境等因素影响少，且整合的HBV基因型为B或C基因型，有利于研究中国人群HBV发病或耐药机制，可用于筛选抗HBV药物。
图I显示了 pREP-HBV (WT) HBV细胞株上清HBsAg、HBeAg表达水平，HBsAg水平维持于20-40IU/ml之间，为H印2. 2. 15细胞2-4倍左右；HBeAg水平40_70PeIU/ml之间，为H印2. 2. 15细胞4-8倍左右，HBV-DNA维持于IO4-IO5之间，略低于H印2. 2. 15细胞，随传代次数增加无明显下降。
图2显示了 pREP-HBV (WT) HBV细胞株耐药表型分析，细胞上清HBV-DNA水平随LAM和ADV浓度梯度升高从IO4下降至检测下限之下，表明对LAM及ADV均敏感。图3显示了 pREP-HBV(WT)HBV细胞株细胞上清HBV-DNA基因测序结果表明野生型，与转染质粒相同。图4为pREP-HBV(WT)细胞株镜下细胞形态图，其中，左图为高倍镜下(20X)细胞形态图，右图为低倍镜下(IOX)细胞形态图。
具体实施例方式实施例I建立H印G2. HSffT细胞株将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染H印G2细胞后，通过潮霉素筛选，然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与Hep2. 2. 15细胞株相比较， 最终建成基于H印G2稳定表达HBV野生株细胞系，获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2. HSWT,已于2011年6月I日保藏,保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 4909，分类命名人肝癌细胞株H印G2. HSWT。所述的细胞株H印G2. HSffT通过下述方法和步骤制备(I)质粒转染!fepG2细胞①细胞培养!fepG2细胞以DMEM培养液培养；所述培养液来源于Gibco公司，培养液中含10 %小牛血清，100U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，O. 03%谷氨酰胺；②细胞转染将处于生长对数期的细胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数；按5X IO5细胞/孔的浓度接种至6孔培养板，培养18-24小时后，待细胞约80-90%融合成片时，换新鲜无抗生素的培养液，准备转染；按照每孔转染2 μ g的量，将50 μ I OptiDMEM培养液与5 μ I Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)混合，同时将2 μ g质粒DNA稀释于50 μ I OptiDMEM培养液中，混匀后室温静置5分钟；将稀释的Lipofectamin2000与质粒DNA混和，室温静置20分钟；将混合物均匀滴加入6孔板中，6小时后用PBS清洗2遍后换新鲜培养液，继续培养；(2)潮霉素筛选细胞克隆①转染后细胞培养24小时后扩大培养至IOcm培养皿，并设空白对照(未转染H印G2细胞)；②待细胞贴壁后加入潮霉素浓度至300ug/ml ；③每3天换液一次；④约14-21天待空白对照细胞全部死亡后观察细胞克隆生长情况；⑤挑取细胞克隆至24孔培养板，以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；⑥待24孔培养板中细胞克隆密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA 水平；⑦获取6株HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA阳性克隆，将阳性克隆传至6孔培养板以潮霉素浓度150ug/ml继续培养；(3)细胞克隆的有限稀释
步骤(2)中获得的6株阳性克隆中的I株细胞克隆，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA水平较高，经定量后上清HBsAg为30IU/ml左右，HBeAg水平60PeIU/ml左右，HBV-DNA水平维持于104-105COpieS/ml ;细胞传至10代左右，采用有限稀释法获取更纯净以及高水平表达蛋白细胞克隆；将处于生长对数期的细胞，以O. 25%胰酶消化，吸去胰酶后，用细胞培养液吹打成单个细胞悬液，计数后细胞密度稀释为lOcell/ml，接种96孔培养板，每孔150ul培养基(含潮霉素浓度150ug/ml);显微镜下观察每孔细胞数，标记只接种Icell的培养孔，继续培养，每周换液一次；2_3周后待细胞密度约60%左右后传至24孔培养板继续培养；待24孔中细胞密度至60-70%后测上清中的HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平，将HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平较高的一株细胞克隆定义为pREP-HBV-WT ；(4) HBV野生型细胞株的生物学特征及表型耐药分析
①细胞上清HBsAg、HBeAg以及HBV-DNA水平检测
HBsAg 及 HBeAg 精确定量试剂盒米用 Abbott 公司 Archipct HBsAg Reagent kit和Archipct HBeAg Reagent kit, HBV-DNA检测采用上海科华生物工程有限公司乙肝病毒核酸定量检测试剂盒，检测步骤按照试剂盒提供的说明书中记载的步骤，real-time PCR扩增仪采用ABI-7300，检测结果如图I所示；②细胞内病毒复制检测细胞总DNA抽提，6孔板中细胞90%汇合度时加入400ul细胞裂解液，37°C过夜(细胞裂解液 lXSDS/Pronase buffer, 2mg/ml pronase、50mM Tris. HCl Ph7. 5> IOmM EDTA、IOOmM NaCl、0. 2% SDS)，加入等量的的酚进行DNA抽提、沉淀后DNA溶解于20ul TE0 I. 3%凝胶电泳后20XSSC转膜，southern-blot杂交；结果显示HBV杂交信号提示胞内HBV复制；③HBV野生型细胞株细胞表型耐药分析IO5Cell/孔细胞密度接种12孔板，细胞贴壁后加入核苷类抗病毒药物，拉米夫定设 0、0. luM、0. 3uM、luM、3uM、10uM、30uM、IOOuM 8 个浓度梯度，阿德福韦设 0、0. luM、
0.3uM、luM、3uM、10uM 6个浓度梯度，每个浓度梯度设复孔，隔天换液，第10天检测细胞上清HBV-DNA水平，细胞抽提胞内总DNA检测胞内HBV复制情况。实施例2测试H印G2. HSffT细胞株如图I所示，pREP-HBV (WT) HBV细胞株上清HBsAg、HBeAg表达水平，HBsAg水平维持于20-40IU/ml之间，为H印2. 2. 15细胞2-4倍左右；HBeAg水平40_70PeIU/ml之间，为H印2. 2. 15细胞4-8倍左右，HBV-DNA维持于IO4-IO5之间，略低于H印2. 2. 15细胞，随传代次数增加无明显下降。如图2所示，pREP_HBV(WT)HBV细胞株耐药表型分析的结果表明，细胞上清HBV-DNA水平随LAM和ADV浓度梯度升高从IO4下降至检测下限之下，表明对LAM及ADV均敏感。如图3所示，pREP-HBV(WT)HBV细胞株细胞上清HBV-DNA基因测序结果表明野生型，与转染质粒相同。结果显示，所述的高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株H印G2.HSWT，细胞上清HBV-DNA水平随LAM以及ADV浓度梯度升高从IO4下降至检测水平以下，表明对LAM及ADV均敏感；杂交结果显示，HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。
权利要求
1.基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系，其特征在于，所述细胞系为高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株，保藏编号=CGMCC No. 4909，分类命名高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HSffT ;具有以下生物学特性 能持续表达HBsAg及HBeAg，胞内有HBV复制，并产生HBV颗粒；与!fep2. 2. 15相比，其表达HBsAg及HBeAg高于!fep2· 2. 15，细胞上清HBV颗粒水平与Ifep2· 2. 15基本持平，其整合的HBV基因型为B或C基因型；其对LAM及ADV均敏感；HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。
2.按权利要求I所述的细胞系的制备方法，其特征在于，将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染H印G2细胞后，通过潮霉素筛选，然后检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，并与ifep2. 2. 15细胞株相比较，最终建成基于H印G2稳定表达HBV野生株细胞系，获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HSWT。
3.按权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT的载体骨架为PREPlO载体。
4.按权利要求2方法，其特征在于，所述的HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT通过含cp启动子及完整HBV前基因组的HBV1. 2倍体，B型(GeneBank登录号AF100309)的复制子插入切除RSV启动子的pREPIO，构建成HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT。
5.权利要求I的基于H印G2稳定表达HBV野生株细胞系在筛选抗HBV药物中的用途。
6.按权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的基于H印G2稳定表达HBV野生株细胞系选自高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株H印G2. HSWT。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域，涉及一种基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系，尤其涉及一种高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT及其制备方法。本发明将HBV真核表达质粒pREP-HBV-WT转染HepG2细胞后，通过潮霉素筛选，检测细胞中HBV复制、特异性抗原的表达及病毒颗粒的产生，获得高表达野生型HBV病毒肝癌细胞株HepG2.HSWT；所述的细胞株其表达HBsAg、HBeAg水平明显高于HepG2.2.15，表达水平稳定，受培养环境等因素影响少，整合的HBV基因型为B或C基因型，所述的细胞对LAM及ADV均敏感，HBV胞内复制水平随LAM及ADV浓度上升逐步下降。本发明的基于HepG2稳定表达HBV野生株细胞系，可用于中国人群HBV发病或耐药机制的研究和可用于筛选抗HBV药物。
文档编号C12N5/10GK102816737SQ20111015353
公开日2012年12月12日 申请日期2011年6月9日 优先权日2011年6月9日
发明者张继明, 张轶俊 申请人:复旦大学附属华山医院