专利名称：咽拭子标本手足口病Cox A16病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法
技术领域：
本发明涉及一种咽拭子标本手足口病Cox A16病毒real-time RT-PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
背景技术：
肠道病毒柯萨奇A组16型是早期发现的手足口病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)的主要病原体，感染潜伏期1 3天，上呼吸道感染，起病急，流涕、咳嗽、咽痛、发烧， 全身不适。典型症状为疱疹性咽峡炎，即在鼻咽部、会厌、舌和软腭部出现小疱疹，粘膜红肿，淋巴滤泡增生、渗出，扁桃体肿大，伴吞咽困难，食欲下降。柯萨奇病毒A型感染儿童多见，成人感染占21.7%。临床表现除上述外，主要特点为急性发烧、皮疹。脑膜脑炎伴有Guillain-BarW综合征和急性病毒性心肌病。随着分子生物学技术的发展，荧光实时 RT-PCR方法可以直接检测临床标本的低拷贝病毒RNA，用于肠病毒感染的早期诊断。卫生部新修订的“手足口病诊疗指南”(2010年版)把肠道病毒特异性核酸检测列为手足口病确诊的依据之一。因此，特异性的手足口病病毒核酸检测技术在临床和疾病预防中的价值越来越大。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、高效、低检测周期短、能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据的咽拭子标本手足口病Cox A16病毒 real-time RT-PCR检测试剂盒，本发明的另一发明目的是提供一种非诊断性检测方法。为实现上述目的，本发明一种咽拭子标本手足口病Cox A16病毒real-time RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒的引物和探针序列如下
CA16FP :5’ -CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3，； CA16RP :5’ -GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’ ； CA16P :5’ -CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3’。本发明一种咽拭子标本手足口病Cox A16病毒real-time RT-PCR非诊断性检测方法，具体为
1)根据COXA16病毒基因序列，设计引物和探针序列如下 CA16FP :5’ -CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3，；
CA16RP :5’ -GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’ ； CA16P :5’ -CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3，；
2)提取待测样品RNA;
3)以待测样品RNA为模板，在包括步骤1)所述引物和探针序列的RT-PCR反应体系中进行RT-PCR反应；
4)采用实时PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的
3Ct值阈值和最高荧光强度判断结果，荧光RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有COX A16病
毒核酸。进一步，所述待测样品为咽拭子标本，所述待测样品RNA采用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒提取。进一步，所述RT PCR 反应体系为2X0ne Step RT-PCR Buffer III 12. 5μ 1, TaKaRa Ex Taq HS 5 U/μ 1 0· 5 μ 1，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0. 5 μ 1，RNase Free dH20 4.5 μ 1，ROX Reference Dye II 50X0. 5 μ 1, Primer 40ymol/L 各 0.5 μ 1， Probe 10ymol/L 0. 5 μ 1，模板 5 μ 1，反应体系共计 25 μ 1。进一步，所述RT PCR 反应的反应条件为42°C，8 min ；95°C，10 s ；95°C，5s，59°C， 34s，45 Cycles ；退火温度按 54°C、55°C、56°C、57°C、58°C、59°C、60V分别试验优化，退火温度为59°C时，反应曲线呈典型的S型，荧光信号最强，本方法选择59°C作为退火温度进行所述RT PCR反应。本发明能够方便临床医生和口岸检疫工作者采样操作，具有成本低、检测周期短， 能够提供有效的临床诊断和流行病监测数据。探针实时荧光PCR检测肠道病毒COX A16方法特异性高、重复性好、灵敏度高，可以广泛应用于临床和口岸手足口病的诊断和检测。
图1为实时PCR最低检测限反应曲线； 图2为实时PCR重复性反应曲线；
图3为CUT OFF值的确定曲线一； 图4为⑶T OFF值的确定曲线二 ； 图5为CUT OFF值的确定曲线三； 图6为⑶T OFF值的确定曲线四。
具体实施例方式手足口病在亚太地区的流行呈逐年上升趋势，近年来国内报道了多期暴发流行事件，给人民健康和社会经济发展带来重大威胁，实时荧光PCR分子检测方法的发展为病原生物的快速诊断提供了有力的工具，因此建立一种基于荧光PCR技术的特异敏感高效快速的肠道病毒实验室检测方法非常重要。柯萨奇病毒是单股正链RNA病毒，包括多种亚型，其中Cox A16是最容易传播的毒株。Cox A16的基因组长约7400bp，包括5’及3’端的非编码区和中间一个大的开放读码框(ORF)，依次由 VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11 个基因组成，主要编码产生病毒结构蛋白和病毒复制所需要的酶类。其中VPl区长891bp，编码含297个氨基酸的 VPl蛋白。VPl是病毒主要的中和抗原决定簇所在的部位，是肠道病毒血清型的分型依据。 VPl区的核苷酸序列也是肠道病毒基因诊断和分型的依据。本研究以VPl基因的保守区域设计，从NCBI数据库检索到所有的基因序列，经生物信息软件分析，找到了几套理论上具有很高特异性引物探针序列并合成实验，经过实验比对最终确定了一套最佳检测用引物探针序列。本发明建立的肠道病毒Cox A16实时荧光PCR检测方法仅需要咽拭子标本就可以检测，方便了临床医生和口岸检疫工作者采样操作。本研究建立的方法与肠道病毒诊断标准方法比对结果一致，但本方法所用试剂成本低、检测周期短，能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据。本发明的关键步骤之一就是引物探针的设计，从NCBI-Genebank获取所有的肠病毒Cox A16的基因序列，经相关生物信息学软件反复比对设计，最终确定了该病毒VPl基因的保守区域设计，而且在试验中我们也选取了多套自己设计的引物探针序列实验比对，最终确定了一套最佳检测用弓I物探针序列。本发明一种咽拭子标本手足口病Cox A16病毒real-time RT-PCR检测试剂盒，该试剂盒的引物和探针序列如下
CA16FP :5’ -CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3，； CA16RP :5’ -GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’ ； CA16P :5’ -CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3’。本试剂盒中还包括dNTP，MgC12, RNase抑制剂，AMV逆转录酶，Taq酶等，这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要选用。本发明一种咽拭子标本手足口病COX A16病毒real-time RT-PCR非诊断性检测方法，具体为
1)根据COXA16病毒基因序列，设计引物和探针序列如下 CA16FP :5’ -CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3，；
CA16RP :5’ -GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’ ； CA16P :5’ -CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3，；
2)提取待测样品RNA;
3)以待测样品RNA为模板，在包括步骤1)所述引物和探针序列的RTPCR反应体系中进行荧光实时RT-PCR反应；
4)采用实时PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的Ct值阈值和最高荧光强度判断结果，荧光实时RT-PCR反应呈阳性，则待测样品含有Cox A16病毒核酸。其具体分析过程和处理过程如下 1材料与方法
1. 1材料
1. 1. 1病毒株和阳性标本肠道病毒EV71型和柯萨奇病毒Cox A16型病毒株均为武汉生物制品研究所基因工程室提供。44份Cox A16型病毒阳性咽拭子标本由四川国际旅行卫生保健中心提供。人A型流感病毒、2009甲型Hmi流感病毒、B型流感病毒阳性咽拭子标本均为本实验室测序确证样本、H5N1和H9N2核酸为北京CDC馈赠。1.1.2阴性标本54份正常人咽拭子标本来自深圳口岸医院正常人群。1.1.3试剂与仪器核酸提取试剂盒为德国Qiagen公司Viral RNA Mini Kit, 实时荧光RT-PCR试剂盒为Takara公司产品One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit。荧光 PCR仪为美国ABI 7500型实时荧光定量PCR仪。1. 2 方法
1.2.1引物和探针的设计
从NCBI-Genebank获取所有的肠病毒Cox A16的基因序列，在VPl基因区，利用软件BI0EDIT5.0对各型基因组序列进行比对，针对高度保守区应用primer express 3. 0和 Primer 5. 0软件设计荧光实时RT-PCR的引物和探针。所设计的引物探针进行NCBI-BLAST 检索，理论上，其结果与Cox A16 100%同源，并排除了其他微生物或人类基因组扩增的可能性。Taq-man探针修饰5’-FAM，3’-TAMRA，PCR产物的大小为77bp。设计的引物和探针序列见表1.
表1 COX A16病毒Real-time RT-PCR方法的引物和探针
权利要求
1.一种咽拭子标本手足口病Cox A16病毒real-time RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的引物和探针序列如下CA16FP :5’ -CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3，；CA16RP :5’ -GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’ ；CA16P :5’ -CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3，。
2.一种咽拭子标本手足口病COX A16病毒real-time RT-PCR非诊断性检测方法，其特征在于，该方法具体为1)根据COXA16病毒基因序列，设计引物和探针序列如下CA16FP :5’ -CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3，；CA16RP :5’ -GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’ ；CA16P :5’ -CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3，；2)提取待测样品RNA;3)以待测样品RNA为模板，在包括步骤1)所述引物和探针序列的RTPCR反应体系中进行RT PCR反应；4)采用实时PCR检测仪进行PCR扩增及结果分析，通过荧光定量检测，根据荧光检测的 Ct值阈值和最高荧光强度判断结果，荧光RT PCR反应呈阳性，则待测样品含有COX A16病毒核酸。
3.如权利要求2所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述待测样品为咽拭子标本， 所述待测样品RNA采用QIAGEN病毒RNA提取试剂盒提取。
4.如权利要求2所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述RTPCR反应体系为2X0ne Step RT-PCR Buffer III 12. 5 μ 1，TaKaRa Ex Taq HS 5 U/μ 1 0. 5μ 1, PrimeScript RT Enzyme Mix II0.5 μ l,RNase Free dH20 4.5 μ 1，R0X Reference Dye II 50X0. 5 μ 1,Primer 40ymol/L #0. 5μ 1,Probe 10ymol/L 0.5 μ 1,模板5 μ 1，反应体系共计25 μ 1。
5.如权利要求2所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述RTPCR反应的反应条件为42°C，8 min ；95°C, 10 s ;95°C，5s，59°C，34s，45 Cycles ；退火温度按 54°C、55°C、56°C、 571、581、591、601分别试验优化，退火温度为591时，反应曲线呈典型的3型，荧光信号最强，本方法选择59°C作为退火温度进行所述RT PCR反应。
全文摘要
本发明公开了一种咽拭子标本手足口病CoxA16病毒real-timeRT-PCR检测试剂盒及其非诊断性检测方法，其引物和探针序列如下:CA16FP5’-CCCATCTGTGTTTGTGAAAATGAC-3’；CA16RP5’-GGTATGCACTRGCTGGTGACA-3’；CA16P5’-CCCNCCRGCTCAAGTGTCAGTCCC-3’；本发明能够方便了临床医生和口岸检疫工作者采样操作，具有成本低、检测周期短，能够提供有效和临床诊断和流行病监测数据。探针实时荧光PCR检测肠道病毒COXA16方法特异性高、重复性好、灵敏度高，可以广泛应用于临床和口岸手足口病的诊断和检测。
文档编号C12Q1/68GK102312018SQ20111015289
公开日2012年1月11日 申请日期2011年6月9日 优先权日2011年6月9日
发明者刘胜牙, 叶健忠, 叶卫翔, 朱玉兰, 王佃鹏, 甄胜西, 黄彤文 申请人:深圳国际旅行卫生保健中心