专利名称：表达牛β干扰素的CHO细胞系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达脊椎动物(3干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述 动物P干扰素的基因。更具体地，本发明公开了表达牛(3干扰素的CHO 细胞系。本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产牛(3干扰素标准品的方 法以及通过该方法获得的的牛(3干扰素，其具有极高的比活性和稳定性， 可用作牛卩干扰素生物学活性检测时的标准品和用于牛传染性疾病的预防 和治疗。
背景技术：
I型干扰素是脊椎动物天然免疫系统的重要组成部分，为现代医学的 重要研究领域。如今，病毒感染宿主时逃避干扰素等天然免疫的机制成为 研究热点["3]，这为病毒防治在理论上提供有力支持。牛病毒性腹泻病毒 (bovine viral diarrhea virus， BVDV) [4]、牛疱疹病毒(Bovine herpesvirus ) [s]和牛呼吸道合胞病毒(Bovine respiratory syncytial virus)间等病毒在感染宿 主时，破坏I型干扰素系统都为它们突破宿主免疫系统的一个重要的机制。
I型干扰素在人的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B) [7'8]、慢性丙型肝 炎(chronic hepatitis C) [9]、多发性硬化症(multiple sclerosis, MS) [10]、 肿瘤疾病[11'12]及其它疾病[13'14]的治疗中发挥了重要作用。受到人类干扰素 在治疗中的鼓舞，牛I型干扰素的表达和疾病治疗研究也很多。目前，国 内牛I型干扰素的生产主要采用原核[15]和酵母表达系统[16]。
因此，不管是I型干扰素相关的基础研究还是临床使用，都需要高活 性、天然的I型干扰素样品，此外还需要对其生物学活性进行准确、便捷 的定量。干扰素的定量需要稳定的标准品，目前农业部颁布的兽用生物制 品质量标准中的脊椎动物天然牛白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导牛 白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性较低，约为 10000 AU* mL"。哺乳动物细胞表达的脊椎动物干扰素是与其它表达系统相比能够正确折叠、糖基化和翻译后修饰，因此更稳定、比活性更高、更 适合作为标准品，尤其对于IFN-(3，而目前缺乏源于哺乳动物细胞的脊椎
动物牛的IFN-p标准品。综上，获得高水平哺乳动物细胞表达的脊椎动物
牛I型干扰素具有重要的基础研究和应用研究意义。
发明内容
本发明的目的为建立高效表达牛IFN-卩的CH0-K1细胞表达系统。
具体地，本发明涉及如下各项
1. 一种表达牛P干扰素的CHO细胞系，其含有编码牛(3干扰素的基因。
2. 根据以上1所述的CHO细胞系，其中所述牛(3干扰素的氨基酸序 列如SEQ IDNO:2所示。
3. 根据以上l所述的CHO细胞系，其中所述编码牛p干扰素的基因 如SEQ ID NO: 1所示。
4. 根据以上1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码所述动 物(3干扰素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根据以上1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No. 2415 的CHO细胞系。
6. —种生产牛P干扰素标准品的方法，该方法包括
1) 培养根据以上1至5中任何一项所述的CHO细胞系；
2) 从所述的CHO细胞系的培养液中提取P干扰素，用作牛P干扰素 的标准品。
7. 根据以上6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCC No. 2415的CHO细胞系。
8. 根据以上6或7的方法生产的牛(3干扰素标准品。
9. 一种用于牛传染性疾病的预防和治疗的试剂盒，其包含根据以上6 或7的方法生产的牛P干扰素标准品。
10. 根据以上1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的牛(3干扰素 在制备药物中的应用，所述药物用于牛传染性疾病的预防和治疗。所述牛 传染性疾病特别是牛病毒性腹泻病毒、牛疱疹病毒和牛呼吸道合胞病毒等病毒引起的疾病。
更具体地，在本发明的一个实施方案中，将牛P干扰素(BoIFN-p) 的ORF基因克隆至真核稳定表达载体pCI-neo (BoIFN-卩在高效启动子 CMV控制下表达)，并稳定转染至CH0-K1细胞，经G418压力筛选和2 次单克隆，筛选出可稳定表达重组BoIFN-卩的CHO细胞克隆 (CHO-BoIFN-p)。本发明的一株阳性CHO细胞克隆(CHO-BoIFN-(3，分 类命名中国仓鼠卵巢细胞(C7^"e //amwer Ova/^ CW/))于2008年3月 25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC， 中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2415。在25cr^的细胞瓶中(5ml培 养液)，重组BoIFN-卩的累积表达水平达到8.4xl05AU(antiviralunits)/ml， 每天的表达量可达5.0xl05 AU/ml或0.5 AU/个细胞。CHO-BoIFN-(3细胞可 在无G418压力筛选下稳定表达至少20代。表达的重组BoIFN-(3可以诱导 MDBK细胞表达牛Mx蛋白。综上，本发明中CHO-BoIFN-p细胞稳定、 高效表达的重组BoIFN-(3具有天然牛I型干扰素的生物学活性，具有重要 的基础和应用研究价值。
本发明的专利性
新颖性
与已经使用的表达脊椎动物牛P干扰素的技术相比(目前干扰素表达
所采用的表达系统主要是原核、酵母表达系统，使用CHO表达脊椎动物 牛(3干扰素的国内外未见报道)，表达的技术路线完全不同。表达的产物 在折叠、糖基化、翻译后修饰、稳定性、比活性上要大大优于已有的技术 手段(原核、酵母)。
创造性
1 、我们扩增获得的牛的氨基酸序列和碱基序列与已报道的(GeneBank 登录的序列)都有所不同；
2、 与已有的原核和酵母表达系统比较，本发明CHO表达系统表达出 的干扰素在蛋白的折叠、糖基化等翻译后修饰上最接近于天然干扰素，比 活性更高，约是原核的10倍。
3、 由于我们的目的是表达最接近天然活性的干扰素，而农业部颁布的 兽用生物制品质量标准中的天然猪白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导 猪白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性约10000AU mL"。与此相比较，本发明的表达系统的BoIFN-P的表达水平是其70 倍或以上，且工艺简单、产品成分容易控制，具有极大的优越性。
综上因此以CHO表达的牛|3干扰素与原核和酵母表达的相比较具 有极大的优越性和创造性。
附图简述
图1. RT-PCR验证BoIFN-p基因在CHO-BoIFN-p细胞中转录表达。 M. DL2000标记；1. CHO-BoIFN-卩细胞；B. CHO-K1细胞； 图2.重组BoIFN-卩在CHO-BoIFN-卩细胞中的表达； 图3.传代次数和G418对CHO-BoIFN-(3细胞表达重组BoIFN-|3的影
响；
图4.免疫印迹检测BoIFN-(3cHo诱导MDBK细胞Mx蛋白的表达。 0.空白对照；M.蛋白分子量标记；A F. 1.02X10"， 1.02X10°，…， 1.02X 104稀释的BoIFN-(3cho;
图5.牛卩干扰素的氨基酸序列(SEQIDNO:2); 图6.编码牛卩干扰素的基因(SEQIDNO:l);
图7.质粒pCN-BoIFN-卩的核苷酸序列，其中1144-1701位(斜体部 分)是BoIFN-卩基因，1118-1143位(双下划线标记部分)是Kozak序歹U。
具体实施例方式
下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例 说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利 要求具体限定。
实施例1.高效稳定表达重组牛P干扰素的CHO表达系统的构建 1材料与方法
1.1质粒、细胞株和毒株
稳定真核表达载体pCI-neo (pCN)购自Promega公司，neo在SV40早期启动子的控制下表达。CHO-K1细胞株商购自ATCC (ATCC No. CCL-61), CHO-K1细胞于含10%FBS的DMEM-Ham，s F12 (DF12)培 养基(invitrogen)中土咅养。
pMD18-T载体购自TaKaRa公司；原核表达质粒pET-32a(+) (Novagen 公司)、传代牛肾细胞系(MDBK) (ATCC No. CCL-22)和BHK-21细 胞(ATCCNo. CCL-10)均由本实验室保存；原代鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts, CEFs)采用10日龄的SPF鸡胚常规方法[17]制备；表 达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒(VSV*GFP)由本实验室参考文 献通过反向遗传技术构建网、MDBK细胞系滴定PFU(plaque forming unit) 后-7(TC保存；新城疫LaSota株病毒(CCVC NO. AV1615)商购自中国微 生物菌种保藏管理委员会组织系统(CCCCM)下属的兽医微生物菌种保 藏管理中心(CVCC)，由本实验室保存，CEFs滴定PFU后-70'C保存备 用。
1.2试剂与仪器
T4 DNA聚合酶购自MBI公司。Ni-NTA琼脂糖亲和树脂、硝酸纤维 素膜购自Pierce公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、鱼皮蛋白购自 Sigma公司；高亮萤光素酶检测试剂(Bright-Glo Luciferase assay system) 购自Promega公司；各种限制性内切酶和Ex-Taq酶都购自TaKaRa公司； T4 DNA连接酶购自MBI公司；质粒中量提取试剂盒购自Qiagen公司； 转染试剂Fugene6购自Roche公司；96孔白色板(96 well white plate)购 自Coming公司；荧光倒置显微镜为LEICA公司产品；Microplate Fluorescence Reader (FLx800)为Bio-Tek公司产品，可检测发光和荧光； CEQ8000自动测序仪为Beckman公司产品。Grace's培养基、DMEM培养 基、Trizol和M-MLV反转录试剂盒购于Invitrogen公司。荧光素(FITC) 标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物技术公司。DAB显色试剂盒购自博 士德公司。
1.3干扰素基因克隆与质粒构建从GenBank获取BoIFN-卩的ORF序列(GenBank Accession No. E00139),设计引物。上游引物为5，-TGCCACCATGACCTACCGGTG CCTC，下游引物为5，-ACAGGTGGG AGATGTTCAGTC AC，上游引 物在起始密码子ATG前加入了利于真核表达的Kozak序列。
传代牛肾细胞系(MDBK) (ATCCNo. CCL-22)细胞生长至密度为 90%左右时，按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为l.O接种新城 疫LaSota株病毒(CCVC NO. AV1615 )。 8h后收细胞，用Trizol (Invi加gen 公司)提取总RNA，采用上述引物进行RT-PCR。扩增的BoIFN-pPCR产 物克隆到pMD18-T载体获得质粒pMD18-BoIFN-卩，通过测序鉴定。
从质粒pMD18-BoIFN-卩以I/Z&a I双酶切下BoIFN-(3的ORF片断， 克隆至以屈o I/A%e I双酶切的质粒pCAGGS[18'19]，获得瞬时真核表达质粒 pCA-Bo丽-卩。
从质粒pMD18-BoIFN-卩以Sal I/Xba I双酶切下BoIFN-(3的ORF片断，
以T4 DNA聚合酶平滑化末端后克隆至Sma I酶切的稳定真核表达质粒 pCI-neo (在本文中也称为pCN) (Promega公司)，获得稳定真核表达质粒 pCN-Bo顧-卩。
1.4瞬吋转染
以pCA-BoIFN-卩和pCAGGS，按照Fugene6 (Roche公司)按操作说 明书转染至BHK-2T细胞(ATCCNo.CCL-10)(于含5%FBS的DMEM 中培养，培养条件为37'C及5XC02)，于转染后16 h换新鲜培养基，继 续在相同条件下培养48h收获细胞培养上清，分别命名为BoIFN-Ppca和 mockpCA，分装并于-7(TC保存备用。
1.5抗病毒活性滴定
IFN抗病毒活性定量检测的操作步骤见参考文献[17]，具体如下MDBK 细胞于96孔细胞板中生长至密度为90%，弃上清，每孔加IO倍梯度稀释 IFN样品100pl，每个稀释倍数设3个平行对照孔，37"及5%<:02培养条 件下处理24h后，弃上清，用含2。/。FBS的DMEM稀释VSV*GFP，按每孔30000 PFU (lOOpl)加入病毒稀释液，同时设未经转染上清处理，只加 病毒液的病毒对照(Virus Control, VC)孑L。不加干扰素和病毒的孔，作 为空白孔(Blank Control, BC)。接毒后至VC孔的CPE (cyt叩athic effect) 约为100%时，荧光倒置显微镜下观察GFP表达及病毒感染复制情况。最 后所有孔每孔加入50pl细胞裂解液(cell lysis buffer, CLB)
，于摇床上裂解15min释放细胞内的 GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏感性设置为70，激发光485 nm， 吸收光528 nm)检测每孔绿色荧光蛋白的相对表达水平。判定以BC孔 校0，以VC孔为参照，每mL中，以表达绿色荧光数减少为VC孔50X 的平均最高稀释度为一个抗病毒活性抑制单位(Antiviral Unit， AU)，计 算具体如下。
基于VSV*GFP检测方法是计算半数病毒复制抑制的稀释倍数，方法 如下若绿色荧光蛋白相对荧光值(Relative Fluorescence Units, RFU)用 F表示，以BC孔校0，则50%病毒复制抑制的荧光值(F50) 二F (VC) /2，按下面公式计算IFN的抗病毒活性单位log，Q[每mL中IFN抗病毒活 性单位(AU) ] = [F50—F(小于F50孑L)]/[F(高于F50孑L)一F(小于F50孑L)] 十logK)[小于F50孔的稀释倍数]。
1.6稳定转染
首先确定筛选培养基中合适的G418 (invitrogen)浓度，方法如下 24孔细胞培养板接种每孔1000个CHO-K1细胞，并加G418使其浓度分 别为100、 200、 300 1200昭/ml，选择能在10_ 14天把细胞彻底杀死的 孔作为G418的筛选浓度。
参照转染试剂Fugene 6操作说明书转染pCN-BoIFN-卩至CHO-K1细 胞。转染后24小时，按1:8的比例进行细胞传代，用含有800吗/mlG418 的压力筛选培养液筛选培养细胞，10 14天后，用克隆环圈住具有新霉素 抗性的细胞克隆集落，胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养 板扩大培养。筛选出的不同细胞克隆按照0.5><106个细胞接种于6孔细胞 培养板中生长至密度为100%后24小时，收取细胞培养上清，分别如上用 VSV*GFP进行抗病毒活性滴定，选择表达水平最高的克隆按限稀释法再进行单细胞克隆，按上述步骤筛选表达量最高的克隆后，扩增并按常规方
法冻存细胞，命名为CHO-BoIFN-P，含有重组BoIFN-(3的细胞培养上清 命名为BoIFN-(3cho。将CHO-BoIFN-P于2008年3月25日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏 号为CGMCC No. 2415。
1.7鸡Mx蛋白多克隆抗体的制备
I型IFN发挥其抗病毒生物学功能的途径之一是经由JAK-STAT信号 转导途径激活Mx启动子(Mx promoter, Mxp)，表达的Mx蛋白(Mx protein)能够抑制负链RNA病毒复制；Mxp有较好的专一性，它不能被 白细胞介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF) 等其它细胞因子启动。通过对鸡、猪和牛的Mx蛋白氨基酸序列进行同源 性分析，发现有部分同源性，主要位于Mx蛋白的N端，因此设计引物扩 增鸡Mx蛋白的N端序列，长810bp，并克隆到原核表达载体pET-32a(+)， 表达的原核蛋白经Ni-NTA免疫小鼠制备的多抗，用于这三种动物的Mx 蛋白的检测。
新城疫病毒MOI为1.0感染细胞密度为约为100X的CEFs，待细胞病 变达60%—80%时收获细胞，用Trizol提取总RNA，并用括号中的引物 (上游引物为5，-GGGGATATC AGC AATCAG ATGGCTTTC-3，，引入 五coi V酶切位点；下游引物为5，-TTT GTC GAC TGG GAT GAC CTC GTT TTG-3，引入I酶切位点)进行RT-PCR，扩增鸡Mx蛋白ORF的前半 部分基因片段，PCR产物以五coR V/Sa/ I双酶切后克隆到同样EcoR VASa/ I双酶切的pET-32a(+)上，获得鸡Mx蛋白的原核表达质粒，鸡Mx 蛋白表达框架与载体上的His标签融合。质粒转化到大肠杆菌BL21中， 用0.5mMIPTG于37T:诱导3小时后，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达。 表达产物参照Ni-NTA琼脂糖亲和树脂纯化说明书纯化后，透析除去尿素。 以纯化的鸡Mx蛋白原核表达蛋白按常规方法免疫BALB/C小鼠(商 购自维通利华公司)，免疫前断尾采血，分离免疫前小鼠血清，然后按常 规程序免疫小鼠并采血分离血清，于-2(TC保存备用。1.8 Mx蛋白的诱导表达
MDBK细胞于6孔板中生长至单层汇合，分别加入梯度稀释的以上获 得的BoIFN-(3CH0， 37。C及5XC02孵育24小时后，用胰酶(amresco)消 化细胞，3000rpm离心5min后收集细胞，加入lxSDS上样缓冲液100^1 混匀，于沸水中煮20min后，进行SDS-PAGE电泳并转印到硝酸纤维素膜， 5%鱼皮蛋白(PBST配制)封闭过夜，以PBST 1:100稀释鸡Mx蛋白小 鼠多抗为一抗，PBST 1:5,000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为二 抗，DAB显色3 5分钟后加去离子水终止。
2结果
2.1瞬时表达产物的抗病毒活性滴定
PCR产物电泳表明扩增出的片段为581bp，与预期相符，经测序鉴定 证实获得了 BoIFN-p的完整ORF基因。再将BoIFN-卩的完整ORF克隆至 高效真核表达质粒pCAGGS中，构建成pCA-BoIFN-(3，并酶切鉴定正确。 以pCA-BoIFN-P和pCAGGS瞬时转染BHK-21细胞，于转染后16 h换液， 再培养48h收获细胞培养上清，分别命名为BoIFN-PpCA和mockpCA，其抗 病毒活性用VSV*GFP于MDBK细胞进行抗病毒活性滴定。实验结果表明， 105倍稀释的BoIFN-(3pCA仍然能够部分抑制VSV*GFP表达GFP (即抑制 病毒的复制)，而10倍稀释的mockpCA几乎无抑制VSV*GFP表达GFP的 能力，计算出BoIFN-PpCA抗病毒活性约为lO"AU，mL-1，证实了所获得的 BoIFN-卩完整ORF基因可用于下一步构建稳定转染表达载体。
2.2稳定转染质粒的构建
为了构建稳定表达BoIFN-卩的质粒，首先从质粒pMD18-BoIFN-卩以 5b/ 1/力a I双酶切下BoIFN-P的ORF片断，亚克隆至同样双酶切的质粒 pCN，获得稳定真核表达质粒pCN-BoIFN-p，使BoIFN-(3在CMV启动子
的控制下表达。
ii2.3稳定表达重组BoIFN-p的CHO-kl细胞克隆的筛选
为了确定筛选培养基中合适的G418浓度，于24孔板中每接种1000 个CHO细胞，G418浓度在700 800(ig/ml之间时，细胞于10—14天全 部死亡。因此选择800 pg/ml作为今后实验中CHO细胞的压力筛选培养基 的G418浓度。
转染pCATN-BoIFN-p至CHO细胞后，只有稳定整合的基因才能稳定 转录，用含有800吗/mlG418的压力筛选培养基筛选具有新霉素抗性的细 胞集落并扩大培养，通过检测各细胞克隆培养上清的抗病毒活性，筛选出 表达量最高的克隆。此后再进行一次单细胞克隆筛选，最后获得单纯、稳 定表达的细胞克隆，液氮存种，命名为CHO-BoIFN-P。此后CHO-BoIFN-(3 细胞以含有400吗/ml G418的压力筛选培养基进行传代。将该 CHO-BoIFN-(3于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2415。
2.4重组BoIFN-p在CHO-BoIFN-p细胞中的表达
用Trizol提取CHO-BoIFN-卩细胞总RNA， RT-PCR扩增BoIFN-卩基 因，扩增出581bp的片段(图1泳道1)，与预期相符，未从CHO-K1细 胞中扩增出片段(图1泳道B)，表明BoIFN-卩基因在CHO-BoIFN-(3细胞 中转录为mRNA。
CHO-BoIFN-P细胞于含有10%FBS的DF12培养基中培养，按1:7传 代至25cn^底面积的细胞培养瓶(每瓶加培养液5ml，长满后约5><106个 细胞)，待细胞长满后，用3ml PBS洗细胞2次，换新鲜培养液，然后分 别于24、 48和72小时取样，每次取10(Hd。所取含有重组BoIFN-卩的细 胞培养上清命名为BoIFN-(3cho，每次取的样品冻存于-7(TC备用。所有样 品以VSV*GFP在MDBK细胞上于同一批次进行抗病毒活性滴定，结果如 图2所示，最高的累积表达量可达8.4x105 AU/ml， 24 48 h的表达量可 达5.0x105 AU/ml，此时每个细胞每天能够表达约0.5 AU/ml的重组 BoIFN-P，此后培养液中的重组BoIFN-P—直维持在约8.0x105 AU/ml左右， 不再增加。结合BoIFN-(3 mRNA的转录和细胞培养上清的抗病毒活性，可证实 BoIFN-(3基因在CHO细胞中获得转录表达。
2.5 CHO-BoIFN-p细胞表达水平与传代次数的关系
CHO-BoIFN-卩细胞分别在含有G418 (400吗/ml)的筛选培养基和不含 有G418的培养基培养传代，于25 cn^的细胞瓶中、37^及5%(302条件 下培养，每3天到4天传一代，基本每周传代2次。分别于第0、 5、 10、 15和20代取样，每种培养条件下的细胞做3个重复。取样前，上述两种 培养条件下的CHO-BoIFN-(3细胞以相同细胞密度接种，待细胞形成汇合 单层时，再继续培养24小时取样，样品保存于-7(TC，最后于同一批次进 行抗病毒活性滴定。结果表明(图3)，虽然每代次的重组BoIFN-(3表达 量都有所不同，这可能是由于细胞密度和状态不能够每次都保证完全相同 的原因。总的来看，CHO-BoIFN-P细胞的重组BoIFN-P表达量水平非常 稳定，无论是否有G418压力存在，可稳定表达至少20代。
实施例2. BoIFN-Pcho的生物学活性研究
把102316AU，mL—1的通过实施例1的CHO表达系统获得的 BoIFN-卩cho (以VSV*GFP于MDBK细胞上滴定其抗病毒活性)进行10 倍梯度稀释(即O.l、 1.02、 10.2、 1.02xl02、 1.02xl。3和1.02xl04AUntiL"， 图4泳道A F)，分别刺激MDBK细胞24小时，收获MDBK细胞。然 后以鸡Mx蛋白小鼠多抗为一抗，羊抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹检测牛 Mx蛋白(分子量约78kDa)的表达，结果如图4所示BoIFN-(3cHo能够 诱导出可检测到的Mx蛋白下限为10.2Al^mL"(图4泳道C)，且在10 K^AU'mL-1 (图4泳道C F)范围内，诱导出的Mx蛋白量和BoIFN-|3CHO 活性单位成正相关，显示BoIFN-卩cho具有良好的I型干扰素生物学活性； 未加干扰素诱导的空白对照孔(图4泳道0)未诱导出Mx蛋白。
抗病毒活性滴定结果和Mx蛋白的诱导结果两者相符合，表明 CHO-BoIFN-P细胞表达的重组BoIFN-p具备天然I型干扰素的生物学功本发明人建立的CHO-BoIFN-(3细胞(CGMCCNo.2415)能够稳定高 水平表达重组BoIFN-(3，累积表达的最高水平可达约8.4xl05AU/ml，每天 表达水平可达约5.0xl05 AU/ml，平均每个细胞每天能够表达约0.5 AU 的重组BoIFN-p。表达重组BoIFN-P的CHO-BoIFN-P细胞是在G418的压 力筛选下筛出的，但是经过细胞单克隆筛选出的克隆，无论在有无G418 的培养液中传20代，表达能力基本不变，表明BoIFN-p的表达框架已稳 定整合至CHO-K1细胞的基因组中。
天然的I型干扰素发挥其抗病毒生物学活性的途径之一激活是诱导 Mx蛋白的表达。通过比较鸡、猪、牛、鼠和人的Mx蛋白氨基酸序列， 可以发现在Mx蛋白的N端有几段氨基酸序列同原性较高，因此本实验使 用鸡的Mx蛋白N端氨基酸制备的鼠多克隆抗体作为检测鸡、猪和牛Mx 蛋白的抗体。CHO-BoIFN-P细胞表达的重组BoIFN-p处理MDBK细胞后， 通过免疫印迹检测出牛Mx蛋白被诱导表达，且与重组BoIFN-P的抗病毒 活性单位成正相关。这些都表明了 CHO-BoIFN-(3细胞表达的重组BoIFN-P 具有I型干扰素的生物功能，具有良好的天然牛IFN-P生物学活性。
哺乳动物细胞表达的IFN-(3的糖基化和折叠与天然的完全相同，正确 的糖基化对于IFN-p的活性和稳定性至关重要；杆状病毒表达系统以病毒 为载体，在感染后期收获表达产物，此时昆虫细胞大部分死亡裂解，这为 纯化和应用带来了问题，而CHO系统的表达产物热源极少，经过简单的 纯化就可以应用于动物机体的抗感染预防治疗；杆状病毒表达系统需要不 断制备新鲜的昆虫细胞和重组杆状病毒，工艺复杂，而CHO细胞可连续 稳定传代，无需重新制备新鲜细胞，工艺简单；CHO细胞稳定表达的重 组BoIFN-p具有良好的热及振荡等稳定性(数据未显示)，且具有极高的 比活性，既使上清浓缩10倍也不能在SDS-PAGE胶上看到表达的重组 BoIFN-卩条带(数据未显示)。
结论，本研究建立的CHO-BoIFN-p细胞表达的重组BoIFN-P具有天 然牛I型IFN相同的生物学功能，表达水平高，且具有极高的比活性和稳 定性，可作为牛IFN-(3生物学活性检测时的标准品，在病原一宿主细胞的 感染一抗感染天然免疫相关基础研究中具有重要的应用价值，同时具有良 好临床应用前景。工业实用性
1、 我们所表达的(3干扰素由于折叠、糖基化修饰比原核和酵母表达的 P干扰素更接近天然干扰素，比活性高，为我们开展病原一宿主的感染与 抗感染天然免疫机制研究提供了良好的样品，具有重要的基础研究应用价 值。
2、 人类干扰素在人类病毒病的治疗中(如慢性乙型肝炎、慢性丙型肝 炎)发挥了重要的作用，并且其在SARS的体外抗病毒实验、和动物实验 中显示出鼓舞人心的结果[2<)-22]。由于动物病毒病是畜牧业的最大威胁之 一，每年都造成了巨大的损失，而目前缺乏特效的抗病毒化学药物。通过 人干扰素的应用经验和已报道的动物干扰素体内外抗病毒实验，干扰素在 动物病毒病的预防和治疗中具有必有大作为。因此，我们表达的(3干扰素 在对动物病毒病的预防和治疗中具有重要的应用价值，具有良好的市场前 景。
参考文献 Weber F, Kochs G， Haller 0. Inverse interference: how viruses fight the interferon system [J]. Viral Immunol, 2004, 17(4):498-515 Stetson D B, Medzhitov R. Type I interferons in host defense [J]. Immunity, 2006, 25(3):373画381 Sen G C. Viruses and interferons [J]. Annu Rev Microbiol, 2001, 55:255-281 Valarcher J F， Furze J, Wyld S, et al. Role of alpha/beta interferons in the attenuation and immunogenicity of recombinant bovine respiratory syncytial viruses lacking NS proteins [J]. J Virol, 2003, 77(15):8426-8439[5] Henderson G, Zhang Y, Jones C. The Bovine herpesvirus 1 gene encoding infected cell protein 0 (bICPO) can inhibit interferon-dependent transcription in the absence of other viral genes [J]. J Gen Virol， 2005， 86(Pt 10):2697-2702 Valarcher J F, Taylor G. Bovine respiratory syncytial virus infection [J]. Vet Res, 2007, 38(2): 153-180 Zhao L S. [Problems and strategies during interferon therapy for hepatitis B] [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2006， 14(5):378-379 Vilar Gomez E, Gra Oramas B, Arus Soler E, et al. [Sequential combination therapy with prednisone, lamivudine and interferon alfa-2b for HBeAg-positive chronic hepatitis B〗[J]. Gastroenterol Hepatol， 2006， 29(9):534-541 Koyama R, Arase Y, Ikeda K， et al. Efficacy of interferon therapy in elderly patients with chronic hepatitis C [J]. Intervirology, 2006, 49(3):121-126 Satoh J. [Interferon -beta therapy in multiple sclerosis] [J]. Nippon
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〈110〉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 〈120〉表达牛P干扰素的CHO细胞系及其应用
<130> IB083074
〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.1
〈210〉 1
〈211> 561
〈212〉 DNA
〈213〉 牛
<400〉 1
atgacctaccggtgcctcctcccgatggttctcctgctgtgtttctccaccacagctctt60
tccaggagctacagcttgctccgattccagC3犯ggCgg3gcgctgaggtgtgtc3gaa^120
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〈210> 2 <211> 186 <212〉 PRT <213> 牛 〈400〉 2
Met Thr Tyr Arg Cys Leu Leu Pro Met Val Leu Leu Leu Cys Phe Ser 15 10 15Thr Thr Ala Leu Ser Arg Ser Tyr Ser Leu Leu Arg Phe Gin Gin Arg
30
His Ser Thr
Pro
Leu 20
Glu Val Cys Gin
Arg Ser Ala 35
His Cys Leu Glu
Ser 25
Leu Leu Gly Gin
Gin 50
Met Asn Gin Ala Gin 65
Tyr Glu Met Leu
Lys 40
Arg Met Asp Phe
Ala 55
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Leu 45
Vai Pro Glu Glu
Gin 70
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Gin 60
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Gin 85
Ser Thr Gly Trp Ser Glu Thr lie 100
Met Asn Arg Leu
Asp 75
Leu Thr Arg Asp
Tyr Gly Gin 115
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lie Glu Asp Leu Leu 105
Pro lie Gin Lys
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Glu
Gin 130
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Gin 120
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Tyr 145
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Leu Met Arg Leu 180
Gly 135
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Val 150
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Val Val Arg Val Gin lie 165 170 Thr Ala Ser Leu Arg Asp
Arg 185
Leu 140
Lys Glu Tyr Asn
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lie
80
Ser
Leu
Val 110
lie Met Gin
Glu 125
His Leu Lys Lys
Ser Lys Glu Tyr Asn Arg 155 160 Leu Thr Asn Phe Ser Phe
权利要求
1.一种表达牛β干扰素的CHO细胞系，其含有编码牛β干扰素的基因。
2. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述牛P干扰素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述编码牛(3干扰素的 基因如SEQ ID NO:所示。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码所 述动物P干扰素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No. 2415的CHO细胞系。
6. —种生产牛(3干扰素标准品的方法，该方法包括1) 培养根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系；2) 从所述的CHO细胞系的培养液中提取(3干扰素，用作牛P干扰素 的标准品。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCC No. 2415的CHO细胞系。
8. 根据权利要求6或7的方法生产的牛(3干扰素标准品。
9. 一种试剂盒，其包含根据权利要求6或7的方法生产的牛卩干扰素 标准品。
10. 根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的牛|3 干扰素在制备药物中的应用，所述药物用于牛传染性疾病的预防和治疗。
全文摘要
本发明公开了表达脊椎动物β干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述动物β干扰素的基因。更具体地，本发明公开了表达牛β干扰素的CHO细胞系。本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产脊椎动物β干扰素标准品的方法以及通过该方法获得的牛β干扰素，其具有极高的比活性和稳定性，可用作牛β干扰素生物学活性检测时的标准品和用于牛传染性疾病的预防和治疗，具有重要的应用前景和市场前景。
文档编号C12P21/02GK101603033SQ200810109948
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月11日 优先权日2008年6月11日
发明者步志高, 陈伟业 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所