猪干扰素α的一个SNP标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于猪分子标记制备与应用【技术领域】，具体涉及猪干扰素α的一个SNP分子标记，该分子标记是从猪TLR6基因外显子中克隆得到，本发明还包括猪TLR6基因外显子序列突变位点的检测方法与应用。本发明通过制备得到一种猪干扰素(IFN)-α免疫性状相关的SNP分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，在序列表SEQ ID NO:1第587bp处存在一个A/G碱基突变，该突变导致PCR-BtsI-RFLP多态性。本发明还公开了该分子标记的制备方法及其在猪干扰素α关联分析中的应用。
【专利说明】猪干扰素 α的一个SNP标记及应用
[0001] 本发明属于猪遗传标记制备【技术领域】，具体涉及猪干扰素 α的一个SNP标记及应 用，该标记是从猪TLR6基因外显子中克隆得到，本发明还包括猪TLR6基因外显子序列突变 位点的检测方法与应用。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择（Molecular marker-assisted selection，MAS)是随着现代分 子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，利用与育种性状相关的各种标记代替以表型为 基础的选择，从分子水平上分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子 育种。可克服直接选择的弊端，提高选择准确性和缩短世代间隔（吴常信2000)。按技术特 性，分子标记可分为三大类。第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术；第二类是以聚合 酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR反应）为基础的各种DNA指纹技术；第三 类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP)， 由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱 基的插入、缺失等。限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphisms, RFLP标记）根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱 基发生改变，导致酶切片段大小发生变化，这种变化可以通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，从 而比较不同品种（个体）之间DNA水平的差异（Beuzen，Stear et al.2000)。
[0003] TOLL样受体（Toll-like rec印tors，TLR)存在于体内的天然免疫受体之一，是一 类横跨膜蛋白基因家族。目前研究已发现11个成员，主要表达于免疫细胞表面，在激活和 调节先天性免疫及诱导获得性免疫中发挥关键作用（李丽燕2011)。TLR基因的变异是机 体对病原微生物抵抗力差异的重要遗传基础。TLR6是TLRs家族成员之一，和其他模式识 别受体（pattern-recognition receptors,PRRs) -样，主要通过识别病原微生物相关分子 来启动免疫应答反应，使机体免疫细胞释放细胞因子和其他介质，以抵抗外界微生物对机 体的损伤（Takeuchi, Kawai et al. 1999 ;0kamura, Watari et al. 2001)。干扰素（IFN-α ) 主要是由效应T淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，在抵抗病毒感染的过程中能够抑制病毒的复 制，而发挥着抗病的生物学功能。李媛媛（2010)等在人类的过敏性紫癜（HSP)免疫发病机 制的研究中发现，病理状态下Toll样受体家族的异常活化（变异），干扰素 -a表达水平呈 现上调表达趋势（李媛媛，李成荣et al.2010)。Hoffjan，S(2005)等的研究认为，TLR6 基因的单核苷酸多态性变异与机体对病原微生物的识别有关，进而直接影响疾病抵抗力的 差异（Hoffjan, Stemmier et al. 2005)。IFN-α是机体重要的抗病毒物质，其在体内表达 水平不同个体间的抗病力也有所差异。本研究利用PCR-RLFP技术检测了猪TLR6基因多态 性，分析其多态性与免疫性状的相关性，试图寻找影响猪免疫性能的新基因，以建立影响猪 免疫性状的新标记，期望能为猪抗病育种及标记辅助选择育种提供理论依据。
[0004] 针对目前猪免疫性状的分子标记研究很少，本发明在猪TLR6基因的编码区找到 的IFN- a免疫性状SNP分子标记属首次发现。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于获得猪干扰素 α的一个SNP标记，该标记与猪IFN-α免疫性 状相关的单核苷酸多态性（SNP)分子标记有关。本发明另一个目的在于提供与猪免疫性状 相关的单核苷酸多态性分子标记的应用。
[0006] 本发明的技术方案如下所述：
[0007] 申请人:从报道的猪TLR6基因中克隆得到猪干扰素 α的一个SNP分子标记，核苷 酸序列如下：
[0008] CCCAGAGAGC CGCCAAGCAG GTTAGCAACA CACAACCACA GTTCTTTGCT AACAAGGTCT
[0009] GTATTGCCTT TCTGGCACCA GCCACTTGTA TAATTGGAAA AAAATAACAT TAAATTATGG
[0010] GGACAGAAAT GATTCTGATA GTGAATAAAG AACTCATTGA GATTTTGTGT TTACTAAGGA
[0011] GATGTTTCAG AACAGTCATC CAATCTTTAT ACATCTTTGT TTTCCATCCA ATCTTTATAT
[0012] ATCGTAACAT ATATTTCTAG AATTTGGATG CCTAGCAAGA TGTTCTGAAG AACAGCAGCA
[0013] ACCCTCTGGG GGATGGTAAC TTCAACATCA TGAGCAAAGA CAAAGAACCT ACTGTCATAA
[0014] GCCTTCATTC TGTGTATGTC ATGACCTTAG TATGGGGAAC CCTAATCCAG TTCTCTGAAG
[0015] AAAGTGAATT TGTGGTAGAC AAGTAGTCAA AAATAGGCCT TACTCGTGTT GCCACCCCAA
[0016] ACCAAAGTCT TAGATGTGTC TCAAAACTTC ATAACTGAGC TTCACCTCTC TGACATCAGC
[0017] TTTCTCTCGC AGCTGACGGT TTTGAGACTT TCCCAGAATA GGATGC R
[0018] (A/G)GTG CCTTGATATC
[0019] AGTGTTTTCA AGTTCAATCA GGATTTGGAA TATTTGGATT TATCTCACAA TCAGTTGCAG
[0020] ACAATCTTGT GCCATCCCAT CACCAGCCTC AAGCATTTGG ACCTCTCATT CAATGACTTT
[0021] GAAGCCCTGC CCATATGTAA GGAGTTTGGC AACTTGACAC AACTGAATTT CTTGGGATTA
[0022] AGTGCTACAA AGTTACAGCA ATTAGATCTA CTACCAATTG CTCACTTGCA TCTAAGTTGC
[0023] ATCCTTCTGG ATTTGGAACG TTATTACATG AAAGAAAATG AGAAAGAAAG TCTTCAAATT
[0024] CTGAACACAA AGAAACTTCA CCTGGTCTTT CATCCAAATA GCTTCTTCTC TGTCCAAGTA
[0025] AACATATCGG TTAAGAGTGT AGGGTGTTTA CAACTGGCTA ATATTAAACT GAGTGATGAC
[0026] AACTGTCAGG TTTTCATTAC ATTTTTATTG GAACTCACTC AAGGGCCAAC CTTACTAAAT
[0027] TTTACGCTCA ACCATGTGG
[0028] 上述序列中的587位中的R是A或G，该突变导致PCR-BtsI-RFLP多态性。
[0029] 申请人:设计了扩增上述TLR6基因片段的引物对（该引物对也是扩增本发明的分 子标记的引物对），其DNA序列如下所示 ：
[0030] 正向引物：5'CCCAGAGAGCCGCCAAGCAGGTTAG 3' ；
[0031] 反向引物：5' CCACATGGTTGAGCGTAAA 3'。
[0032] 实现本发明的具体制备方法是：提取杜洛克X二花脸F2代猪基因组DNA ;根据 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/snp/中公布的猪TLR6基因序列信息，设计PCR扩增引物 (其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2和3所示）。用该引物对进行PCR扩增，得到长度为 1099bp的扩增片段，该片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1所示，在该序列的第587位 有一个等位基因的突变（A/G)，该突变导致PCR-BtsI-RFLP多态性，进而对所获得的PCR产 物酶切分型，进行基因型与猪IFN-α免疫性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅 助选择提供一个新的分子标记。
[0033] 更详细的发明技术方法参见《【具体实施方式】》所述。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 序列表SEQ ID NO: 1 :是本发明制备的猪干扰素 α的一个SNP标记（杜二F2代 猪）的核苷酸序列，序列长度为l〇99bp ;
[0035] 序列表SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3是扩增SEQ ID NO:所示的1特异基因片段 所用的正向引物和反向引物，也是检测猪A/G变异PCR-BtsI-RFLP (限制性内切酶酶切片段 长度多态性）基因型分型方法的正向引物和反向引物。
[0036] 图1 :为本发明在杜洛克X二花脸F2代（或简称杜二F2代）猪中TLR6基因序 列测序结果的SNP位点。
[0037] 图2 :为本发明包括猪TLR6基因部分外显子的基因片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼 脂糖凝胶浓度为2%，附图标记说明：M泳道为DNA Marker DL2000,泳道1、2为序列表SEQ ID N0:2所示引物在杜二F2代猪群体中的扩增片段，片段大小为1099bp ;
[0038] 图3 :为猪TLR6基因 PCR-BtsI-RFLP检测结果。琼脂糖凝胶浓度为2%，附图标记 说明：M泳道为DNA Marker DL2000, GG基因型片段大小为1099bp，AA基因型片段大小为 507bp 和 592bp，AG 基因型为 507bp、592bp 和 1099bp。
[0039] 图4 :是本发明的是本发明制备的猪干扰素 α的一个SNP标记的DNA序列。在该 序列的587位中存在一个突变R，该R是A或G，该突变导致PCR-BtsI-RFLP多态性。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1
[0041] 一、猪基因组DNA提取（样品为杜二F2代猪种，由广东省温氏集团提供）
[0042] 本发明所使用的猪群体（杜洛克X二花脸F2代，简称杜二F2代，下同）的DNA 样品全部采用北京天根生化技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit ;按该试剂盒说明书进行操作）提取，具体步骤如下所示：
[0043] (1)将取自杜二F2代猪耳样（组织）放入2ml的EP管中，用酒精棉擦拭干净的眼 科手术剪剪成糊状后加入200 μ 1缓冲液GA (该试剂盒自带）。
[0044] (2)再加入20μ 1蛋白酶K溶液（该试剂盒自带），混匀后置于56°C水浴锅中消化 过夜。
[0045] (3)加入200 μ 1缓冲液GB (该试剂盒自带），充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶 液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
[0046] (4)加入200 μ 1无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离 心以去除管盖内壁的水珠。
[0047] (5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0048] (6)向吸附柱CB3中加入500 μ 1缓冲液⑶（该试剂盒自带），12000rpm离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0049] (7)向吸附柱CB3中加入600 μ 1漂洗液PW(该试剂盒自带），12000rpm离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
[0050] (8)重复操作步骤7。
[0051] (9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0052] (10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50-200 μ 1洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管 中。
[0053] (11)对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于一 20°C下保存备用。
[0054] 二、突变位点的PCR扩增
[0055] 本发明的突变位点位于TLR6基因组的外显子上，根据NCBI提供的猪TLR6基因序 列信息，在突变位点两端设计引物扩增并检测突变所用的引物对的核苷酸序列如下：
[0056] 正向引物：5'CCCAGAGAGCCGCCAAGCAGGTTAG 3' ；
[0057] 反向引物：5' CCACATGGTTGAGCGTAAA 3'。
[0058] 反应体系为 20 μ L，其中 DNA 模板 1 μ L (约 IOOng)，10 X buffer (含 Mg2+) 2 μ L，上 述正反向引物终浓度各〇. 3μπι，dNTPs混合物终浓度为75μΜ，0. 6U Taq DNA聚合酶，不足 部分用双蒸水补足。
[0059] PCR 扩增程序：95°C预变性 5min，94°C 30s，56°C 30s，72°C lmin，循环 35 次，最后 72°C延伸5min，15°C 2min停止反应。
[0060] 本实施例中，PCR扩增产物用2 %琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均为特异的PCR产 物，片段全长为l〇99bp，如图2所示。
[0061] 三、PCR-BtsI-RFLP 检测分子标记 A587-G587
[0062] 将PCR产物15yL，10Xbuffer 5yL，限制性内切酶BtsI为IyL(IOU),用双蒸水 补足50 μ L，样品混匀后离心，在55°C培养箱酶切I. 5h。2%琼脂糖凝胶电泳分离后紫外灯 下检测拍照，记录基因型。结果见图3。
[0063] 分子标记基因型分析：如图3所示，用上述引物对扩增猪基因组DNA获得的 1099bp的特异性扩增片段，序列分析在587bp处存在A587-G587突变，并导致BtsI多态性。 该基因突变位点由两个等位基因控制，其中G是没有形成酶切位点的等位基因，A是形成酶 切位点的等位基因。这两个等位基因可组成三种基因型：其中GG型为未发生酶切的纯合型 (电泳检测时只有l〇99bp-条DNA带），AA型为发生酶切的纯合型（电泳检测时出现592bp 和507bp的两条DNA带），AG为杂合型（电泳检测时出现1099bp，592bp和507bp三条DNA 带）。
[0064] 实施例2
[0065] 一、构建家系及基因型扫描
[0066] 用于性状关联分析的试验猪群（杜二F2代）是由 申请人:所在的华中农业大学动 物遗传育种与繁殖分子生物学实验室与广东温氏集团合作构建的杜洛克与二花脸猪杂交 F2代试验猪群体，仔猪出生时采集耳朵组织样本，共计254头。仔猪生长到35日龄时，收集 血清样本，并用ELISA法（为常规方法，分析方法由尚柏生物医学技术（北京）有限公司完 成）测定关联分析的细胞因子水平数据包括：干扰素 α、干扰素 β、IGg抗体等。杜二F2 代猪基因组DNA全部由华中农业大学所在的动物遗传育种与繁殖分子生物学实验室从每 个杜二F2代猪个体耳缘组织样品中提取获得（制备方法参见实施例1)，置于-20°C保存备 用。
[0067] 对254头杜二F2代猪的DNA样品用PCR-BtsI-RFLP方法进行基因分型，检测 A587-G587位点的多态性。结果表明，AA基因型有57个，基因型频率为0. 22 ;AG基因型127 个，基因型频率为0. 49 ;GG基因型有70个，基因型频率为0. 27。
[0068] 二、猪TLR6基因分子标记位点A587-G587与猪免疫性状的关联分析
[0069] 根据本发明所使用的资源家系的群体结构及其影响因素， 申请人:运用混合线性 模型来分析猪TLR6基因 A587-G587位点的不同基因型对测定的猪胴体性状的影响，采用 SAS (Version 8. 1)软件中Mixed Procedure程序进行数据处理与统计分析，模型如下：
[0070] Yijk = V- +Sex^genotypej++ ε iJk
[0071] 其中，Yijk表示处理后的性状值，μ表示每个性状的均值，％\表示性别效应， genotype』表示基因型效应，ε ijk为随机误差。分析结果表明，A587-G587位点的多态性与 猪干扰素 -α (IFN-α )呈显著相关（P〈〇. 05)。A587-G587位点的多态性与猪干扰素性状关 联分析的详细结果见表1。
[0072] 表1猪TLR6基因 A587-G587位点的多态性与干扰素 a免疫性状的关联分析
[0073]
【权利要求】
1. 猪干扰素a的一个SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示： CCCAGAGAGCCGCCAAGCAGGTTAGCAACACACAACCACAGTTCTTTGCTAACAAGGTCTGTATTGCCTTTC TGGCACCAGCCACTTGTATAATTGGAAAAAAATAACATTAAATTATGGGGACAGAAATGATTCTGATAGTGAATAAA GAACTCATTGAGATTTTGTGTTTACTAAGGAGATGTTTCAGAACAGTCATCCAATCTTTATACATCTTTGTTTTCCA TCCAATCTTTATATATCGTAACATATATTTCTAGAATTTGGATGCCTAGCAAGATGTTCTGAAGAACAGCAGCAACC CTCTGGGGGATGGTAACTTCAACATCATGAGCAAAGACAAAGAACCTACTGTCATAAGCCTTCATTCTGTGTATGTC ATGACCTTAGTATGGGGAACCCTAATCCAGTTCTCTGAAGAAAGTGAATTTGTGGTAGACAAGTAGTCAAAAATAGG CCTTACTCGTGTTGCCACCCCAAACCAAAGTCTTAGATGTGTCTCAAAACTTCATAACTGAGCTTCACCTCTCTGAC ATCAGCTTTCTCTCGCAGCTGACGGTTTTGAGACTTTCCCAGAATAGGATGCR[A/G]GTGCCTTGATATCAGTGTT TTCAAGTTCAATCAGGATTTGGAATATTTGGATTTATCTCACAATCAGTTGCAGACAATCTTGTGCCATCCCATCAC CAGCCTCAAGCATTTGGACCTCTCATTCAATGACTTTGAAGCCCTGCCCATATGTAAGGAGTTTGGCAACTTGACAC AACTGAATTTCTTGGGATTAAGTGCTACAAAGTTACAGCAATTAGATCTACTACCAATTGCTCACTTGCATCTAAGT TGCATCCTTCTGGATTTGGAACGTTATTACATGAAAGAAAATGAGAAAGAAAGTCTTCAAATTCTGAACACAAAGAA ACTTCACCTGGTCTTTCATCCAAATAGCTTCTTCTCTGTCCAAGTAAACATATCGGTTAAGAGTGTAGGGTGTTTAC AACTGGCTAATATTAAACTGAGTGATGACAACTGTCAGGTTTTCATTACATTTTTATTGGAACTCACTCAAGGGCCA ACCTTACTAAATTTTACGCTCAACCATGTGG 上述序列中的587位中的R是A或G，导致PCR-BtsI-RFLP多态性。
2. 扩增如权利要求1所述分子标记的引物对，其DNA序列如下所示： 正向引物：5'CCCAGAGAGCCGCCAAGCAGGTTAG 3'， 反向引物：5'CCACATGGTTGAGCGTAAA 3'。
3. 权利要求1所述的分子标记在猪干扰素a性状检测中的应用。
4. 权利要求2所述的引物对在猪干扰素a检测中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104313030SQ201410580129
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】朱猛进, 郭敬颂, 王超, 刘向东, 赵书红, 何民慧 申请人:华中农业大学