专利名称:一种嗜酸乳杆菌活菌制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防和治疗病毒性疾病的制剂，具体是一种嗜酸乳杆菌活菌 制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
病毒性疾病一直困扰畜禽养殖业。随着生物技术的发展，目前有多种细胞因子通 过基因工程菌得以表达并制成制剂，如猪、鸡、牛干扰素和白介素等。目前，利用分子生物学 技术构建基因工程菌株来防治畜禽传染病等已取得很大进展，例如，免疫增强剂是通过基 因工程技术构建了高效表达猪干扰素(α、β和Υ)的工程酵母菌株，基因工程抗菌肽是利 用基因工程技术构建表达抗菌肽cecA-mil,magainin及其突变体的工程毕赤酵母菌株。
公开号为CN 1589776A、名称为“一种微囊化酵母及其应用”的专利申请提出，采用 微囊化基因工程酵母菌，通过进入人体消化道生长代谢并分泌蛋白药物，用于治疗人体某 些疾病。此外，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作为一种益生菌，目前也被用于食品级表达系统的 研究。
现有的采用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌作为宿主菌制备的用于预防和治疗 畜禽病毒性疾病的制剂存在如下缺陷
(1)蛋白产物纯化方法繁琐、纯化成本高昂；
(2)为保证蛋白的生物学活性及稳定性，制剂需冷链运输和低温保存。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提出一种可耐受胃酸环境并进入肠 道定植、正常生长代谢时产生乳酸和乙酸、造成肠道低PH环境、从而抑制有害菌在人或动 物肠道的生长和繁殖的嗜酸乳杆菌活菌制剂。
本发明的目的还在于提供所述嗜酸乳杆菌活菌制剂的制备方法。
本发明的目的还在于提供所述嗜酸乳杆菌活菌制剂的应用。
嗜酸乳杆菌是普遍存在于人或动物肠道中的益生乳酸杆菌，本发明提出以嗜酸乳 杆菌为宿主菌在人或动物肠道作为抗病毒多肽的细胞反应器，与酵母菌、大肠杆菌和枯草 芽孢杆菌相比，嗜酸乳杆菌本身就是人或动物肠道的正常菌群，可定植于动物肠道，并且能 耐受胃酸环境，进入肠道后能发挥益生作用。因此，以嗜酸乳杆菌作为宿主菌进行基因改造 后，作为食物或药物进入人或动物消化道发挥作用，更易被接受。
本发明的嗜酸乳杆菌活菌制剂由一种携带有表达人或动物各种特异性的干扰素 或白介素家族中的一种或几种基因工程嗜酸乳杆菌制成；
所述基因工程嗜酸乳杆菌是在重组蛋白N末端连接原核细胞信号肽，采用分泌型 表达载体并以抗性基因作筛选标记；克隆干扰素或白介素成熟蛋白基因构建重组质粒；用 电穿孔法导入感受态嗜酸乳杆菌后筛选得到。
所述嗜酸乳杆菌活菌制剂的制备方法包括如下步骤[0014](1)用基因克隆常规手段，在重组蛋白N末端连接原核细胞信号肽，采用分泌型表 达载体并以抗性基因作筛选标记；克隆干扰素或白介素成熟蛋白基因构建重组质粒；用电 穿孔法导入感受态嗜酸乳杆菌后进行筛选，得到性状稳定的基因工程嗜酸乳杆菌活菌；
(2)步骤(1)得到的基因工程嗜酸乳杆菌的浓缩液中添加载体后低温20-40°C干 燥，或者步骤(1)得到的嗜酸乳杆菌浓缩液中添加保护剂后冷冻干燥制备，制剂中含嗜酸 乳杆菌活菌体数量为lif-ioncfu/g。
步骤(2)中所述载体是植物性载体或矿质载体。其中植物性载体主要指淀粉，矿 质载体包括磷酸钙，磷酸氢钙和沸石粉中的一种或几种。所述保护剂是脱脂奶粉，蔗糖和海 藻糖中的一种或几种。
得到的嗜酸乳杆菌活菌制剂可用于制备预防和治疗病毒性疾病的制剂或药物。其 所含基因工程嗜酸乳杆菌活菌体通过作为饲料或食品或饮料添加剂，加入食品或饲料中、 或加入饮水中通过自由饮水、或通过饮水灌服的方式进入人或动物肠道内定植，并高效分 泌表达相应的细胞因子，由肠道吸收后用于预防和治疗病毒性疾病。
该制剂通过饲料或食品或饮料添加、自由饮水添加或饮水灌服等方式进入人或动 物消化道，其中所含的基因工程嗜酸乳杆菌活菌体可耐受胃酸环境后到达人或动物肠道内 生长代谢，并特异性分泌表达抗病毒多肽，达到抗病毒和治疗病毒性疾病效果。
本发明与现有技术相比，具有如下优点
(1)本发明采用的嗜酸乳杆菌本身是一种肠道正常菌，在人或动物肠道内可定植 并正常生长代谢；
(2)嗜酸乳杆菌作为一种益生菌，在人或动物肠道生长代谢时，可造成肠道低PH 环境，抑制病原菌的生长；
(3)嗜酸乳杆菌具有良好的胃酸环境耐受性能，因此不需进行繁琐的制剂包被工 艺。
(4)本发明制剂的制备方法中，省去了方法复杂而且制剂成本高的蛋白纯化工艺， 并且克服了常规基因工程药物运输和保藏不便的缺点。
具体实施方式
实施例
分别构建猪α干扰素(PoIFN-α )和猪、干扰素(PoIFN-Y)基因工程嗜酸乳杆 菌，按常规方法和条件进行工程菌的培养。培养结束后，离心分离菌体，将分离得到的菌泥 按α y = 1 0.5-1混合，再与淀粉按重量1 1-1. 5的比例混合均勻，在鼓风烘箱中 以35°C的热风烘干至含水分6-8%，即得制剂。制剂中基因工程嗜酸乳杆菌活菌体数量为 109cfu/go
将得到的制剂通过饮水灌服的方式给猪只服用，并保证进入猪只体内的基因工程 嗜酸乳杆菌活菌体总量达到IO9以上时，可有效预防和治疗猪病毒性流行性腹泻、猪流感、 猪轮状病毒感染、猪传染性胃肠炎、蓝耳病等病毒感染。
权利要求
一种嗜酸乳杆菌活菌制剂，其特征在于由一种携带有表达人或动物各种特异性的干扰素或白介素家族中的一种或几种基因工程嗜酸乳杆菌制成，制剂中含嗜酸乳杆菌活菌体数量为107 1011cfu/g。
2.根据权利要求
1所述的嗜酸乳杆菌活菌制剂，其特征在于其基因工程嗜酸乳杆菌是 在重组蛋白N末端连接原核细胞信号肽，采用分泌型表达载体并以抗性基因作筛选标记； 克隆干扰素或白介素成熟蛋白基因构建重组质粒；用电穿孔法导入感受态嗜酸乳杆菌后筛 选得到。
3.权利要求
1或2所述嗜酸乳杆菌活菌制剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)用基因克隆常规手段，在重组蛋白N末端连接原核细胞信号肽，采用分泌型表达载 体并以抗性基因作筛选标记；克隆干扰素或白介素成熟蛋白基因构建重组质粒；用电穿孔 法导入感受态嗜酸乳杆菌后进行筛选，得到性状稳定的基因工程嗜酸乳杆菌活菌；(2)步骤⑴得到的基因工程嗜酸乳杆菌的浓缩液中添加载体后低温20-40°C干燥，或 者步骤(1)得到的嗜酸乳杆菌浓缩液中添加保护剂后冷冻干燥制备，制剂中含嗜酸乳杆菌 活菌体数量为IO7-IO11Cfu/^
4.根据权利要求
3所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述载体是植物性载体或矿质 载体；其中植物性载体是淀粉，矿质载体包括磷酸钙，磷酸氢钙和沸石粉中的一种或几种； 所述保护剂是脱脂奶粉，蔗糖和海藻糖中的一种或几种。
5.权利要求
1或2所述嗜酸乳杆菌活菌制剂在制备预防和治疗病毒性疾病的制剂或药 物中的应用。
专利摘要
本发明涉及一种可耐受胃酸环境并进入肠道定植、正常生长代谢时产生乳酸和乙酸、造成肠道低pH环境、从而抑制有害菌在人或动物肠道的生长和繁殖的嗜酸乳杆菌活菌制剂，由一种携带有表达人或动物各种特异性的干扰素或白介素家族中的一种或几种基因工程嗜酸乳杆菌制成。其制备方法包括在重组蛋白N末端连接原核细胞信号肽，采用分泌型表达载体并以抗性基因作筛选标记；克隆干扰素或白介素成熟蛋白基因构建重组质粒；用电穿孔法导入感受态嗜酸乳杆菌后进行筛选；得到的基因工程嗜酸乳杆菌的浓缩液中添加载体后低温干燥，或者添加保护剂后冷冻干燥制备。所述嗜酸乳杆菌活菌制剂可用于制备预防和治疗病毒性疾病的制剂或药物。
文档编号A23L2/52GKCN101892188SQ201010191693
公开日2010年11月24日 申请日期2010年5月28日
发明者李清雄, 林向剑, 邝金媚, 陶正国 申请人:广州立达尔生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan