来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用。所述的泛应急蛋白FaUSPA基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，通过构建包含还基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，经试验表明，该基因能够在梭菌中稳定高效表达，有效提高了梭菌对丁醇的耐受性。同时，利用厌氧发酵，还表明该基因能够大幅度提高梭菌产丁醇能力。
【专利说明】来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种来源于极端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因、包含该基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体及其构建方法，以及它们在提高梭菌丁醇耐受性，促使梭菌提高产高含量丁醇中的应用。
【背景技术】
[0002]生物丁醇是是一种极具潜力的第二代新型生物燃料，与乙醇相比，丁醇作为生物燃料具有以下众多优势:1)能量含量高，与乙醇相比可多走30%的路程；2)丁醇的挥发性只有乙醇的1/6倍，汽油的1/13.5，与汽油混合对水的宽容度大，对潮湿和低水蒸气压力有更好的适应能力；3)丁醇可在现有燃料供应和分销系统中使用，而乙醇则需要通过铁路、船舶或货车运输；4)与其他生物燃料相比，腐蚀性较小，比乙醇、汽油安全；5)与现有的生物燃料相比，生物丁醇与汽油的混合比更高，无需对车辆进行改造，就可以使用几乎100%浓度的丁醇，而且混合燃料的经济性更高；6) 丁醇可以通过不消耗粮食、不占用耕地、不增加环境压力为前提进行发酵生产。如果丁醇占生物燃料市场的20%，全球市场将超过200亿美
J Li ο
[0003]由于丁醇具有毒性，影响细菌的生长和原料转化。目前生产中，丁醇的终浓度维持在13-14g/L，当超过这个浓度时，由于丁醇的毒性，细胞代谢就终止了(Zheng2009J IndMicrobiol Biotechnol )。经研究发现丁醇的毒性主要是破坏细胞膜的磷脂成分，从而进一步影响糖和氨基酸的吸收。目前普遍认为若细胞对丁醇的抗性得以提高，丁醇的产量也将相应提闻。
[0004]泛应激蛋白(Universal stress protein, Usp)是一类在细胞质中普遍存在的小分子蛋白，通常由111-167个氨基酸残基组成。Usp最早在大肠杆菌中发现，其表达受多种胁迫影响(NyStroml993，J Bacterio)。此后，USP蛋白在多种古生菌、细菌、植物中均被发现。USPA蛋白在埃希氏菌属大肠杆菌细胞生长受到限制，DNA被损坏时诱导表达；该蛋白在化学毒素，渗透胁迫，UV照射条件下调节细胞中的营养物质；被认为外界压力的生物传感器。研究表明该类蛋白在碳、氮、磷、硫酸盐、氨基酸等缺乏时，以及在高温、氧化、紫外线、环丝氨酸、抗生素等刺激下能积累表达(Liu2007, Micro Pathog)。Freestone等(1997, JMol Biol)的研究结果显示，UspA作用于丝氨酸、苏氨酸的蛋白磷酸化，对细胞稳定期的生长有重要作用。在埃希氏菌属大肠杆菌细胞中发现，USPA与细胞分裂蛋白有协同作用，同时可激活RecA的表达，RecA蛋白是细菌中参与DNA同源重组修复的重要蛋白，增强细胞抗性。RecA蛋白和Rad51蛋白分别是细菌和真核生物参与DNA同源重组修复的重要蛋白。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因、表达载体及其构建和应用，以弥补现有技术存在的缺陷。[0006]本发明按照梭菌的偏爱密码合成源于端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛应急蛋白 FaUSPA 基因(Genbank ZP_05570298.1)，设计引物，采用 PTDS 方法(Xiong2004，Nucleic Acids Res)人工合成并克隆该基因,对犾得的阳性克隆进彳丁序列测定,其喊基序列如SEQ IDNOl所示，即为本发明的泛应急蛋白FaUSPA基因，命名为FaUSPAI。
[0007]进一步，本发明通过构建包含上述合成的泛应急蛋白FaUSPAI基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，使其能够在梭菌中高效表达。
[0008]所述的表达载体是以pS0S94载体为基础载体，将氯霉素抗性基因表达单元，梭菌CAC3645基因启动子、上述合成的FaUSPAI基因的阅读框单元和枯草杆菌pyruvate kinase基因终止子定向连接后替换PS0S94载体中的CtfAB及abc表达单元构建而成的。
[0009]其中，从PXYP251载体中扩增氯霉素表达单元。弓丨物为cml:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5’ -TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’ ；扩增条件为 940C 30s, 600C 30s, 72°C 60s ;25 循环。
[0010]从梭菌C.acetobutylicum ATCC824 中扩增 CAC3645 基因启动子，引物为 c3645z: 5，-TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3，，c3645f: 5，-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3，。扩增条件为94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25循环。所得的梭菌CAC3645基因启动子的碱基序列如SEQ ID N02所示。
[0011]从枯草杆菌Bacillus subtilisl68中扩增PYK基因终止子，引物为pykl: 5’_GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3，，pyk2:5，-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCG CCG-3’ ；扩增条件为 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25 循环。
[0012]利用电击法将上述含 有FaUSPAI基因表达单元的梭菌-大肠杆菌穿梭表达载体导入梭菌中，通过红霉素筛选转化子。试验表明，该FaUSPAI基因可以在梭菌中高效表达，有效提高了梭菌对丁醇的耐受性。并在厌氧发酵中，大幅度提高了梭菌产丁醇能力，较原始菌株824提闻了 18%。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明的含有FaUSPAI基因表达单元的梭菌-大肠杆菌穿梭表达载体的构建图谱。
[0014]图2至图5为FaUSPAI梭菌转化子和原始菌种在不同浓度对丁醇的耐受性。
[0015]图6至图7为FaUSPAI转化子和原始菌种发酵后产物和生长情况。
【具体实施方式】
[0016]实施例1来源于极端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因的合成
[0017]在不改变氨基酸序列的前提下，根据梭菌特有的密码子特点，合成源极端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus 的泛应急蛋白 FaUSPA 基因(Genbank ZP_05570298.1),设计引物，并人工合成。引物序列如下，引物长度为60bp左右。
[0018]1.NI10=FAUSPA1-1:Tm=54, 60mer
[0019]GGA, TCC, ATG, AAG, GTC, CTC, GTC, TCC, TAT, GAT, GGT, TCT, GAA, GGT, GCT, AGA, GAA, GCT, CTC, AAG
【权利要求】
1.一种来源于极端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因,其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.包含权利要求1所述的来源于来极端嗜酸菌的泛应急蛋白FaUSPA基因的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，其特征在于，所述表达载体是以pS0S94载体为基础载体，将氯霉素抗性基因表达单元，梭菌CAC3645基因启动子、权利要求I所述的FaUSPA基因的阅读框表达单元和枯草杆菌pyruvate kinase基因终止子定向连接后替换PS0S94载体中的ctfAB及abc表达单元构建而成的。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，其特征在于，从PXYP251载体中扩增氯霉素表达单元，引物为 cml:5’ -AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5，-TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3，；扩增条件为 94 °C 30s, 60 °C 30s,72°C 60s ；25 循环。
5.根据权利要求3所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，其特征在于，从梭菌C.acetobutylicum ATCC824 中扩增 CAC3645 基因启动子，引物为 c3645z:5’ -TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3，，c3645f: 5，-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3 ’。扩增条件为940C 30s, 600C 30s,72°C 30s ;25 循环。
6.根据权利要求 3或5所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体，其特征在于，所述梭菌CAC3645基因启动子的碱基序列如SEQ ID N02所示。
7.根据权利要求3所述的大肠杆菌-梭菌穿梭表达载体,其特征在于,从枯草杆菌Bacillus subtilisl68 中扩增 PYK 基因终止子，引物为 pykl: 5’ -GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’，pyk2:5’ _CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCGCCG_3’ ；扩增条件为 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25 循环。
8.权利要求1所述的来源于来极端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因在提高梭菌丁醇耐受性中的应用。
9.权利要求1所述的来源于来极端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛应急蛋白FaUSPA基因在提高梭菌丁醇产量中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103898126SQ201210585227
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月28日 优先权日:2012年12月28日
【发明者】彭日荷, 姚泉洪, 田永生, 赵伟, 付晓燕, 朱波, 许晶, 高建杰, 韩红娟, 王波, 王丽娟, 韩静, 薛永 申请人:上海市农业科学院