专利名称:一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用。
背景技术：
葡萄酒的酿造主要是在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的作用下,采用自然发酵或者纯种发酵，将葡萄原料中的各种潜在品质和优势在酿造过程中充分表现出来。葡萄酒中适量的有机酸可以赋予葡萄酒清新、爽利的酸感；酸量过高则会使人感到尖涩、刺口甚至生硬，严重影响葡萄酒的口味。因此酸的含量和种类是生产特色优质葡萄酒的重要指标之一。优质葡萄酒中一般应含有6. 0-8. 5g/l的酸类物质。白葡萄酒中酸含量在5-9g/I，pH值在3. 1-3. 4之间；而红葡萄酒的酸含量在5-7§/1，？11值在3.3-3.6之间。葡萄酒中不同有机酸性质及浓度取决于酿酒酵母酿造特性、酿造工艺、葡萄原料等多种因素。由于生长年份、自然环境、生态条件、酿酒葡萄的品种特性及栽培方式的影响，葡萄原料的酸度往往较高，所以在葡萄酒酿造过程中常常面临降酸的问题。
通常的降酸方法包括化学降酸、物理降酸、调配降酸和生物降酸法四种。化学降酸主要是去除酒石酸，以使用酒石酸钾、碳酸钙、碳酸氢钙等化学试剂与酒石酸形成沉淀再通过过滤的方法除去沉淀，从而达到降酸的目的；物理降酸主要是通过冷冻或阴离子交换处理来调整酸的含量。化学降酸和物理降酸法对酒质的负面影响较大。调配降酸是在有经验的调酒师指导下用高酸度的葡萄原酒与低酸度的葡萄原酒按照一定的比例进行调配以得到酸度达标的葡萄酒。目前常用的生物法降酸主要是针对生理历代比较活跃的苹果酸进行的，其原理是利用微生物(酒类酒球菌)分解苹果酸从而达到降酸目的。发明专利“一种葡萄酒降酸酵母及其培养方法”(专利申请号CN200510041935. 5，公开号CN1721524)以酿酒酵母CICC1450及酒酒球菌SD-2a为亲株，应用原生质体融合技术构建的成一株可以进行苹果酸乳酸发酵的基因改良菌株。然而在一些葡萄产地(尤其是较寒冷地区)有些年份的某些葡萄品种酿制的葡萄酒在经历降苹果酸工序后酸度仍然较高，导致酿出的葡萄酒具有较强的后酸感，甚至是酸涩感。这样就会大大降低葡萄酒的品质和适口性。尤其在我国葡萄酒原料基地生产的葡萄，在大多数情况下不需要补酸，反而有一些原料需要进行降酸处理(比如在我国吉林通化、甘肃武威、河北沙城等产区)。
葡萄酒中的总酸度包括挥发性酸度和固定酸度，以固定酸度为主。固定酸主要由酒石酸、苹果酸、柠檬酸和琥珀酸等不挥发性酸构成。酒石酸、苹果酸和柠檬酸是葡萄中的主要酸类物质。其中酒石酸是葡萄的特征酸，其含量与栽培环境和葡萄品种有关，不宜于被微生物所利用；但其在葡萄酒中的含量受其钾盐和钙盐的形成的沉淀量的影响很大。苹果酸和柠檬酸具有“生酸味”，虽然它们在葡萄中的含量也很高，但由于它们在苹乳发酵后会被酒类酒球菌的代谢作用转化为酸味较弱的乳酸，因此其在葡萄酒中含量低。除此之外葡萄在发酵过程中会由酵母三羧酸循环(TCA)途径产生一些一元酸、二元酸和三元酸。这些酸均是TCA循环的中间产物，其中主要包括琥珀酸、丙酮酸、a -酮戊二酸和异柠檬酸等。
琥珀酸是酿酒酵母在酒精发酵过程中产生的最主要不挥发酸，其性质在老熟过程、中仍非常稳定，其在葡萄酒中的口味也最为复杂和特殊，是味感最为强烈的一种酸。刚入口时其酸感比酒石酸、苹果酸和柠檬酸淡，随后味感变浓，先咸后苦，并能促进唾液分泌。因此琥珀酸的含量会直接影响葡萄酒的口味和风格。
不同的酿酒酵母菌株代谢和积累苹果酸、柠檬酸、琥珀酸等TCA循环中间产物的能力有着显著的差异。而这种差异会继而影响后续苹乳发酵的进程，也正是这种差异造成了不同酿酒酵母菌株所酿葡萄酒会给品酒者的味觉带来不同的酸感。
利用微生物对葡萄酒进行降酸处理已经在葡萄酒酿造业得到普及。虽然经过苹果酸-乳酸发酵后的葡萄酒酸度得以降低，但有些葡萄酒由于产地、气候、栽培方式和葡萄品种等因素的影响，导致经过苹乳发酵的酒中酸度仍然较高，因此大大影响成品酒的质量。然而选用不同的酿酒酵母菌株却可以得到不同酸度的葡萄酒，为高酸葡萄酿造出低酸葡萄酒提供了可能。
我国葡萄种植面积广，吉林、辽宁、河北、山东、甘肃、新疆和云南等地都是重要的 葡萄产区。不同产区栽培的酿酒葡萄品质千差万别，导致高酸度葡萄原料难以生产出低酸度的优质葡萄酒。
发明内容
本发明的目的是提供一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用。
本发明提供的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),名称为NJZSC5,属于酵母属(Saccharomyces sp.),分离自河北省沙城县原产地葡萄产区赤霞珠葡萄表面，已于2010年04月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia为北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC No. 3732。
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NJZSC5CGMCC No. 3732,简称酿酒酵母NJZSC5 或 NJZSC5。
酿酒酵母NJZSC5可用于生产葡萄酒。所述葡萄酒可为干红葡萄酒、干白葡萄酒或佐餐葡萄酒。
本发明提供了一种生产葡萄酒的方法，是利用酿酒酵母NJZSC5对葡萄原料进行发酵，得到葡萄酒。酿酒酵母NJZSC5特别适于用酸度较高的葡萄原料生产葡萄酒。
利用NJZSC5生产出的葡萄酒优点在于当葡萄原料酸度偏高时，葡萄酒中总糖含量为l_3g/L，酒精度为9-14%，甘油含量为3-8g/L，总酸含量为5_7g/L，硫化氢、乙醛、乙酸和尿素等对葡萄酒风味或品质不利的代谢产物产量较低，柠檬酸和琥珀酸代谢能力较强，苹果酸利用率更高，总酯含量更高而总高级醇含量适中；葡萄酒酸度较低，PH较高，口感更为清爽、柔和，无艰涩感，酸甜口味更加平衡，层次感分明，极具特色；葡萄酒的挥发性香气成分平衡，葡萄本身的特征香气更加明显。NJZSC5应用于生产葡萄酒，可以缩短酒精发酵时间和苹乳发酵时间，使整个酿造周期大幅缩减(5-8d)，有利于提高葡萄酒的出品率和提高成品酒的品质。NJZSC5可解决高酸度葡萄产区和葡萄品种生产较低酸度优质葡萄酒的难题。
图I为NZJSC5在WL营养琼脂上的菌落形态。[0016]图2为NJZSC5在McClary培养基上28°C培养1_4周后，在显微镜中的形态。
图3和图4为实施例4的酒精发酵的发酵液的代谢物组和主成分分析结果。
图5和图6为实施例4的干红葡萄酒的代谢物组和主成分分析结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置五次重复实验，结果取统计平均值。
实施例中的培养基如下
模拟葡萄汁培养基由水和溶质组成，pH = 3.3 ;溶质的浓度如下葡萄糖， 200g/1000mL ;柠檬酸，6g/1000mL ;苹果酸 6g/1000mL，尿嘧啶，20mg/1000mL ;磷酸二氢钾， 750mg/1000mL ;硫酸钾，500mg/1000mL ;七水硫酸镁，250mg/1000mL ;氯化钠 200mg/1000mL ； 二水氯化钙，155mg/1000mL ； 一水硫酸锰，4mg/1000mL ；硫酸锌，4mg/1000mL ;碘化钾， lmg/lOOOmL ;五水硫酸铜,lmg/lOOOmL ;硼酸，lmg/lOOOmL ; 二水钥酸钠,lmg/lOOOmL ；六 水氯化钴，0. 4mg/1000mL ;肌醇，20mg/1000mL ;烟酸，2mg/1000mL ;泛酸钙 1. 5mg/1000mL ； 盐酸硫胺素 0. 25mg/1000mL ;盐酸吡哆辛 0. 25mg/1000mL ;生物素，0. 003mg/1000mL ； 脯氨酸，61. 5mg/1000mL ;谷氨酰胺,50. 7mg/1000mL ;精氨酸，37. 5mg/1000mL ;色氨酸， 18mg/1000mL ；丙氨酸，14. 7mg/1000mL ；谷氨酸，12mg/1000mL ；丝氨酸，7. 8mg/1000mL ； 苏氨酸,7. 8mg/1000mL ;亮氨酸,4. 8mg/1000mL ;天冬氨酸 4. 5mg/1000mL ;缴氨 酸，4. 5mg/1000mL ;苯丙氨酸，3. 9mg/1000mL ;异亮氨酸，3. 3mg/1000mL ;组氨酸， 3. 3mg/1000mL ；甲硫氨酸,3. 3mg/1000mL ;酪氨酸，1. 8mg/1000mL ;甘氨酸，1. 8mg/1000mL ； 赖氨酸，1. 8mg/1000mL ;半胱氨酸(cysteine), 1. 2mg/1000mL ;氯化铵,55. 8mg/1000mL ;麦 角甾醇，15mg/1000mL ;油酸钠，5mg/1000mL ;吐温_80，0. 5ml/1000mL。
YEPD培养基由水和溶质组成，自然pH值；溶质的浓度如下葡萄糖，20g/1000mL ； 蛋白胨，20g/1000mL ;酵母抽提物，10g/1000mL ;固体培养基加入20g/1000mL琼脂(微波炉 加热完全融化后灭菌)
WL营养琼脂培养基由水和溶质组成，pH = 6. 5 ;溶质的浓度如下酵母抽提 物，4g/1000mL ;胰蛋白胨，lg/1000mL ;葡萄糖，50g/1000mL ；KH2P04,0 . 5 50g/1000mL ；KC1,
0.425g/1000mL ；CaCl2,0. 125g/1000mL ；MgS04,0. 125g/1000mL ；FeCl3,0. 0025g/1000mL ； MnS04，0. 0025g/1000mL ;溴甲酚绿，0. 022g/1000mL。
McClary培养基由水和溶质组成；溶质的浓度如下葡萄糖，lg/1000mL ;KC1，
1.8g/1000mL ;无水乙酸钠，8. 2g/1000mL ;酵母膏，2. 5g/1000mL ;琼脂，20g/1000mL。
实施例中各个性能的测定方法如下
C02 失重称量法(M. S. Perez-Coellol, A. I. Briones Perez, J. F. Ubeda Iranzo and P.J. Martin Alvarez.Characteristics of wines fermented with different Saccharomycescerevisiae strains isolated from the LaMancha region. Food Microbio. 1999，16(6) :563_573)。
乙醒含量乙醒测定试剂盒(Acetaldehyde Assay Kit,Megazyme公司，爱尔兰)。[0028]甘油含量甘油测定试剂盒(Glycerol Assay Kit, Megazyme公司，爱尔兰)。
尿素含量尿素测定试剂盒(UreaAssay Kit, Megazyme公司，爱尔兰)。
总酯、总高级醇等香气物质含量SPME-GC-MS法；用Agilent 6890气相色谱(GC)和Agilent 5975质谱(MS)联用仪(Agilent，美国)检测(参见文献张明霞.葡萄酒香气变化规律研究——着重于关键酿造工艺对葡萄酒香气的影响[D].中国农业大学博士学位论文 2007)。
挥发酸含量(以乙酸计)滴定法，(GB/T 15038-2006)。
代谢物组和主成分分析核磁共振法(参见文献Son H. S.，Hwang G. S.，Kim K.M. . et al. 1H NMR-Based Metabolomic Approach for Understanding theFermentationBehaviors offfine Yeast Strains. Anal Chem. 2009,81 :1137-1145)。
pH 值pH 计法(GB/T 15038-2006)；
总糖含量(以葡萄糖计)直接滴定法(GB/T 15038-2006)。
酒精度密度瓶法(GB/T15038-2006)。
总酸含量(以酒石酸计)电位滴定法(GB/T 15038-2006)。
有机酸(苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸)含量液相色谱法(GB/T15038-2006)。
总SO2 含量直接碘量法(GB/T 15038-2006)。
游离SO2含量直接碘量法(GB/T 15038-2006)。
感官评定(GB/T15038-2006)。
比重测定比重计法。(参见文献RogersonF. , Symington C. A methodfor theestimation of alcohol in fortified wines using hydrometer Baumeandrefractometer Brix. Am J Enol Viticult. 2006，57(4) :486-490)。
实施例I、酿酒酵母NJZSC5的分离、纯化及其鉴定
酿酒酵母NJZSC5分离自河北省沙城县原产地葡萄产区赤霞珠葡萄表面。鉴定方法采用传统形态学鉴定、生理生化鉴定结合ATB ID 32C酵母自动鉴定系统(生物梅里埃公司，法国)，并辅以5. 8S-ITS rDNA PCR-RFLP和5. 8S-ITS rDNA序列分析；经鉴定为酿酒酵母的菌株以法国LAFF0RT公司生产的商业化活性干酵母Zymafiora F15 (以下均简写作F15)为对照菌株，进行试管发酵初筛、摇瓶发酵复筛、小型酿酒优选菌株筛选实验和优筛菌株中试规模酿酒实验，对菌株进行筛选。经过近五年的系统研究和反复筛选，得到具有独特降酸酿造特性的酿酒酵母菌株NJZSC5。
I、形态学鉴定
经过48h培养NJZSC5在YEDP固体培养基上生长的菌落为乳白色、圆形、有光泽、边缘整齐、粘稠、易挑起，显微镜下观察为细胞成圆形或卵圆形、多边芽殖、无假菌丝；在WL营养琼脂培养基上菌落特征为奶油色带绿色、菌落球形突起、表面光滑、不透明、奶油状，如图I所示；在McClary培养基上28°C培养1_2周后，在显微镜下观察有2_4个子囊孢子形成、孢子壁光滑，如图2所示。
2、生理生化鉴定
根据酵母属的分类检索表，选取对于酿酒酵母属种内区分比较重要的四项生理生化测试葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的发酵能力；纤维二糖和肌醇的同化能力；硝酸盐和L-赖氨酸的同化能力；抗放线菌酮能力。经过生理生化实验后发现，NJZSC5的碳源同化、氮源同化和放线菌酮生长实验的结果均与对照菌株CICC1450(标准商业对照菌株，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，以下均写作CICC1450)测试结果相同，具体结果见表I。
表I对照菌株和NJZSC5的生理生化实验结果
权利要求
1.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NJZSC5 CGMCC No. 3732。
2.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)NJZSC5 CGMCC No. 3732 在生产葡萄酒中的应用。
3.一种生产葡萄酒的方法，是利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) NJZSC5CGMCC No. 3732发酵葡萄原料，得到葡萄酒。
专利摘要
本发明公开了一株酿酒酵母及其在葡萄酒生产过程中降低酸度的应用。本发明提供了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NJZSC5 CGMCC No.3732。NJZSC5在酒精发酵过程中利用苹果酸和柠檬酸的能力强，积累琥珀酸的能力较弱，在苹乳发酵后乳酸含量更低。用NJZSC5生产葡萄酒，可使整个酿造周期大幅缩减(5-8d)，提高葡萄酒的出品率和成品酒的品质。NJZSC5可解决高酸度葡萄产区和葡萄品种生产较低酸度优质葡萄酒的难题。NJZSC5生产出的葡萄酒优点在于葡萄酒酸度较低，口感清爽、柔和，不艰涩，酸甜平衡，层次感分明，极具特色；挥发性香气成分平衡，葡萄本身特征香气更加明显。
文档编号C12G1/022GKCN101838615 B发布类型授权 专利申请号CN 201010174056
公开日2012年8月22日 申请日期2010年5月11日
发明者严斌, 梁恒宇, 苏宁, 谢喆, 陈晶瑜, 韩北忠 申请人:中国农业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (4),