一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法

专利名称:一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
，具体涉及用生物工程技术获得重组膦丝菌素乙酞转移酶的方法，其中包括bar基因的克隆、重组质粒的构建方法、工程菌的发酵表达方法以及重组膦丝菌素乙酞转移酶的分离与纯化方法。
背景技术：
随着转基因作物的商品化生产，其产品安全性及其是否对生态环境有影响引发了人们广泛关注。许多国家以立法或其它形式要求转基因产品在上市前必须进行标识，转基因产品的检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目。
转基因产品的检测主要从两个方面入手，一是核酸水平，即检测转基因产品中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测。其中以基于核酸水平定性或定量检测技术较为成熟。如中国发明专利公开号 CN1580782描述了可同时对转基因产品中常用的启动子、终止子、筛选标记基因、抗除草剂基因、抗虫基因等9个外源DNA序列进行检测分析的低密度基因芯片检测方法；中国发明专利公开号CN101343666A描述了用于抗虫转基因水稻多重PCR检测的试剂盒及检测方法；中国发明专利公开号CN1480538描述了一种基于PCR技术的转基因油菜籽及其加工产品中转基因成分的定量检测；中国发明专利公开号CN1769488描述了一种基于PCR技术的转基因大豆的检测方法及所用引物。但核酸检测技术的主要缺点是会出现假阴性或假阳性结果。 目前，基于蛋白质水平的检测技术较少，虽然市场上也有研制出的一系列相关的转基因靶标蛋白的快速检测试剂盒，但由于多数知识产权非国内所有，检测试剂价格昂贵。因此，积极研发具有我国自主知识产权的检测技术，不仅可以建立健全的转基因产品监管制度，而且可以在国际贸易中增强我国的国际竞争力。
对于蛋白质水平检测的免疫测定技术来说，首先要获得高产量的靶标蛋白，并且要保证蛋白的生物学活性，即可溶性和功能性，然后以此为抗原制备特异的抗体，再应用于转基因产品的测定。因此，如何获得高产量的靶标蛋白是关键。由于重组蛋白在理化性质和生物学活性上已日趋接近于天然蛋白质，人们利用各种高效表达系统进行制备足够的重组蛋白。其中，因大肠杆菌表达系统遗传背景清楚、培养条件简单、生长快、成本低、易大规模培养和拥有大量可利用的表达载体、宿主和纯化系统，是最为常用的表达系统。但不足之处在于，大肠杆菌中表达的重组蛋白因过量表达、环境胁迫、宿主代谢系统受干扰等原因， 靶标蛋白往往以不溶的无功能的包涵体形式存在。因此，大多数情况下都需要将无活性的蛋白质转变成有生物活性的可溶形式，传统方法是对包涵体进行变性复性处理，但这种方法费时费工，得率很低，而且需要根据每种蛋白的不同理化性质优化复性的条件，可能会影响到蛋白的完整性。随着对大肠杆菌中蛋白质折叠机制的深入研究，目前已发展了许多技术来提高重组蛋白表达的可溶性。
其中融合蛋白标签技术在增溶重组蛋白研究中应用广泛。蛋白标签技术不仅可以提高重组蛋白的表达量、可溶性和稳定性，而且能避免重组蛋白在细胞内的降解，简化蛋白质的纯化过程，便于目的蛋白的检测和纯化。其中由六个组氨酸聚合组成的His标签是经常使用的蛋白标签。它的原理是固定在基质上的金属元素能和组氨酸侧链间相互作用，使得含有连续几个组氨酸残基的多肽能有效的保留在色谱柱上，接下来通过调节咪唑的浓度洗脱基质材料，就可以把含有多聚组氨酸序列的多肽洗脱下来。该系统具有蛋白表达产率高、表达产物纯化方便以及利于抗体制备等优点。但目前大量的实验发现，即使通过融合标签蛋白仍有多数重组蛋白以包涵体形式存在，因此，需要通过另一些途径来进一步提高重组蛋白表达的可溶性。由于蛋白质种类繁多，理化性质各异，至今还没有找到一种通用的解决方法。
抗除草剂bar基因，编码膦丝菌素乙酞转移酶(PAT)，通过催化乙酰辅酶A与草胺磷游离氨基结合，使草胺磷失去活性。目前，应用转基因技术已将bar基因导入水稻、玉米、 油菜、大豆等作物中，其中一些转基因作物已大面积种植。但bar基因的表达产物详细的安全性评价资料甚少，其安全性评价成为制约转基因植物大面积推广的关键。因此，建立bar 基因表达蛋白的快速简便的检测方法，对含bar基因的转基因产品的蛋白检测技术的方法有重要意义。博慧杰等O007)采用大肠杆菌体外表达系统，通过His标签技术得到以包涵体形式存在于菌体中膦丝菌素乙酞转移酶。因此，进一步改进现有的试验技术方法，获取可溶性表达的膦丝菌素乙酞转移酶，显得非常重要。

发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，通过该方法可以快速得到大量、高纯度、可溶的重组膦丝菌素乙酞转移酶，该酶可作为抗原用以制备单克隆抗体，用于进行含膦丝菌素乙酞转移酶转基因产品的定性、 定量检测，为有效抗原筛选、诊断试剂的开发以及转基因作物安全性评价奠定基础。
所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征包括以下工艺步骤
1)设计bar基因PCR引物，上游引物barl核苷酸序列如SEQ No. 1所示，下游引物 bar2核苷酸序列如SEQ No. 2所示，采用引物barl和bar2，以质粒pDsBar 1300为模板进行PCR扩增，获得bar基因全长序列，bar基因全长序列如SEQ No. 3所示；
2)将得到的bar基因定向克隆到含有T7启动子的原核表达载体pET30a(+)中，构建重组质粒pET30a (+) -bar ；
3)将构建的重组质粒pET30a(+)-bar转入大肠杆菌BL21 (DE3)宿主菌中，构建工程菌 BL21/pET30a(+)-bar ；
4)将工程菌BL21/pET30a(+)-bar发酵培养，诱导融合蛋白表达，使工程菌内获得特异性表达蛋白；
5)将得到的特异性表达蛋白进行增加可溶性处理，然后进行分离提取，得到膦丝菌素乙酞转移酶粗制品；
6)将膦丝菌素乙酞转移酶粗制品进行分离纯化，即得到膦丝菌素乙酞转移酶纯
P
m ；
7)纯品经透析、冷冻干燥后，置于-70°C超低温冰箱中保存。
所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中 PCR反应条件为94°C预变性^iin ；94°C变性50s，55°C退火50s，72°C延伸50s，共30个循环；循环结束后72°C再延伸lOmin。
所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中工程菌BL21/pET30a(+)-bar在培养基中培养至OD6tltl为0. 6时，加入异丙基硫代-β -D-半乳糖苷至终浓度为ImM，然后在30°C低温下诱导表达4h，使工程菌内获得特异性表达蛋白。
所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于步骤幻中特异性表达蛋白进行增加可溶性处理具体步骤包括
a)发酵培养后的工程菌，用含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和20mM咪唑且pH为 8. O的低咪唑浓度结合缓冲液重悬细胞，再在菌体中加入溶菌酶、核糖核酸酶A、脱氧核糖核酸苷酶I，终浓度分别为100 μ g/mL、200 μ g/mL、20 μ g/mL,冰上作用20 30min ；
b)接着在上述溶液中依次加入二硫苏糖醇、N-十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠， 终浓度分别为2. 5 10mM、1 2. 5%和0. 2%，冰上作用20 30min，再进行冰上超声破碎 IOmin ；
c)破碎后在温度4°C下进行高速离心，离心速度为12000 14000r/m，离心10 20min后，弃沉淀取上清，然后在上清中加入终浓度为1 2%的聚乙二醇辛基苯基醚，过 0. 45 μ m滤膜后，得到膦丝菌素乙酞转移酶粗制品。
所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于步骤6)中膦丝菌素乙酞转移酶粗制品进行分离纯化具体步骤包括先将膦丝菌素乙酞转移酶粗制品与 M-NTA琼脂糖在4°C下结合1小时，再将该混合物装入空色谱柱；然后先用漂洗缓冲液洗柱，再用低咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱去除杂蛋白，最后用高咪唑浓度的洗脱缓冲液收集目的蛋白，即可获得膦丝菌素乙酞转移酶纯品。
所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的漂洗缓冲液含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和50mM咪唑，所述的低咪唑浓度的洗脱缓冲液含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和75 125mM咪唑，pH为8. 0，所述的高咪唑浓度的洗脱缓冲液含有 50mM NaH2PO4、300mM NaCl 和 150 250mM 咪唑，pH 为 8. O。
大肠杆菌表达的膦丝菌素乙酞转移酶经诱导表达后发现其主要以包涵体的形式存在于沉淀中。主要原因可能是其表达量过高，表达产物来不及形成正确的空间构象。因而，发生了大量聚集而形成包涵体。本发明的优点在于(1)通过降低培养温度诱导重组蛋白，降低无活性聚合体形成的速率，减少包涵体的形成；( 用二硫苏糖醇、N-十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠进行处理，结合超声破碎相结合的物理手段，洗涤除去菌体中的脂类和膜蛋白，使目的蛋白以可溶性形式最大限度地释放出来；C3)利用组氨酸蛋白标签融合表达重组蛋白，降低宿主对所表达产物的降解，提高膦丝菌素乙酞转移酶的稳定性，有利于后续的分离纯化；(4)所用的M-NTA Agarose蛋白纯化系统操作简单，依据6个组氨酸中咪唑基与M离子的螯合，使表达蛋白得到纯化，具有快速、特异的优点，且得到的蛋白纯度高；(5)在镍亲和层析过程中，上柱前向样品缓冲液中加入少量咪唑(终浓度20mM)是一个重要步骤，有助于减少非特异性蛋白与Ni-NTA组氨酸基质结合；(6)在蛋白挂柱后，使用含 75 125mM咪唑浓度的漂洗缓冲液冲洗层析柱，可以有效地去除非特异性结合蛋白，再用含150 225mM咪唑浓度的洗脱缓冲液冲洗层析柱，可以获得高纯度的重组蛋白；(7)纯化获得的重组膦丝菌素乙酞转移酶，其稳定性好、生物学活性较高；(8)紧邻插入序列上游含有肠激酶切割位点，用肠激酶切割融合蛋白，可将6个组氨酸标签完全去除；(8)目前尚未有市售的膦丝菌素乙酞转移酶，本发明专利对于获得高纯度的膦丝菌素乙酞转移酶有积极的帮助，并可用于转基因产品在蛋白水平的分子检测，对类似的外源蛋白的研发有重要的指导作用。


图1质粒pDsBar 1300总DNA中bar基因的PCR扩增图；
图 1 中 M 标准 DNA 分子标记(IOObp) ；1 质粒 pDsBar 1300 总 DNA ；
图2pET30a (+) -bar重组质粒的构建图；
图3为重组质粒pET30a⑴-bar的BamH I和Hind III双酶切鉴定图；
图3中Ml 标准DNA分子标记(IOObp) ；M2 标准DNA分子标记(λ DNA/Hind III)； 1 重组质粒pET30a(+)-bar双酶切产物；
图4为BL21/pET30a(+)-bar菌体中表达产物的检测图；
图4中M 低分子量蛋白质标准；1 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar诱导表达的菌体总蛋白；2 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar未诱导表达的菌体总蛋白；3 空载表达菌BL21/pET30a(+)诱导表达的菌体总蛋白；4 空载表达菌BL21/pET30a (+)未诱导表达的菌体总蛋白；
图5BL21/pET30a(+)-bar菌体中表达产物的可溶性分析图；
图5中M 低分子量蛋白质标准；1 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar诱导表达的上清；2 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar诱导表达的沉淀；3 重组表达菌BL21/ pET30a(+)-bar诱导表达的菌体总蛋白；4 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar未诱导表达的菌体总蛋白；5 空载表达菌BL21/pET30a(+)诱导表达的菌体总蛋白；6 空载表达菌BL21/ pET30a(+)未诱导表达的菌体总蛋白；
图6BL21/pET30a(+)-bar菌体中表达产物增溶性处理后的可溶性分析图；
图6中M 低分子量蛋白质标准；1 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar诱导表达的沉淀；2 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar诱导表达的上清；3 重组表达菌BL21/ pET30a(+)-bar诱导表达的菌体总蛋白；4 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar未诱导表达的菌体总蛋白；5 空载表达菌BL21/pET30a(+)诱导表达的菌体总蛋白；6 空载表达菌BL21/ pET30a(+)未诱导表达的菌体总蛋白；
图7为亲和层析过柱纯化收集产物的SDS-PAGE分析图；
图7中M 低分子量蛋白质标准；1 :50mM咪唑；2 :75mM咪唑；3 :100mM咪唑；4 125mM咪唑；5 :150mM咪唑；6 :175mM咪唑；7 :200mM咪唑；8 :225mM咪唑；9 :250mM咪唑第一次；10 :250mM咪唑第二次；
图8为纯化后重组膦丝菌素乙酞转移酶的SDS-PAGE分析图；
图8中M 低分子量蛋白质标准；1 纯化后的重组膦丝菌素乙酞转移酶；2 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar诱导表达的沉淀；3 重组表达菌BL21/pET30a (+)-bar诱导表达的上清；4 重组表达菌BL21/pET30a(+)-bar诱导表达的菌体总蛋白；5 重组表达菌BL21/ pET30a(+)-bar未诱导表达的菌体总蛋白；6 空载表达菌BL21/pET30a(+)诱导表达的菌体总蛋白；7 空载表达菌BL21/pET30a(+)未诱导表达的菌体总蛋白；
图9为蛋白质标准曲线图。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1 寡核苷酸引物的设计与合成
根据bar基因全长的核苷酸序列设计了一对引物，
上游引物barl CGGGATCCATGAGCCCAGAACGACGC, 5，端设计有 BamH I 限制性内切酶序列(划线部分)，其核苷酸序列如SEQ No. 1所示；
下游引物bar2 :CCCAAGCTTATCAAATCTCGGTGACGGGCAGG, 3，端设计有 Hind III限制性内切酶序列(划线部分)，其核苷酸序列如SEQ No. 2所示。
实施例2 =PCR扩增bar基因目的片段
以质粒pDsBar 1300总DNA为模板，采用引物barl和kir2扩增bar基因序列。 PCR反应体系为25μ L总体积中含有10/139反应缓冲液2.5“1^，25111^%(12，2. 5mM dNTP， 10 μ M 引物 barl，10 μ M 引物 bar2，质粒 DNA IOOng, 0. 5UTaq DNA 聚合酶，加 ddH20 补足体积 M 25 μ L0 PCR 反应条件为:94°C预变性 ^iin ；94°C变性 50s，55°C退火 50s，72°C延伸 50s， 共30个循环；循环结束后，72°C再延伸10min，PCR扩增结果如图1所示。结果表明，bar基因的PCR扩增产物在500 750bp之间有1条特异性条带，与预期的结果相符。
实施例3 重组载体的构建和序列测定
PCR产物经1 %的琼脂糖电泳分离后回收目的片段，纯化后的PCR产物和原核表达载体pET30a(+)各自进行BamH I和Hind III双酶切处理，分别回收带有双粘性末端的目的片段和表达载体。在T4连接酶的作用下，16°C连接池，构建原核表达质粒pET30a (+) -bar, 如图2所示。将重组质粒转化入E. coli DH5a感受态细胞中，挑取阳性克隆，抽提质粒，进行双酶切鉴定，如图3所示。重组质粒DNA在500 750bp之间和4361 6557bp之间分别有特异性的目的基因条带和pET30a(+)DNA载体条带，与预期结果相符。挑选阳性克隆交上海生物工程有限公司测定bar基因的序列。其核苷酸序列如SEQ No. 3所示，测序结果与文献报道的完全一致，bar基因片段的大小为552bp，且读码框正确，说明重组质粒构建成功。
实施例4 重组表达bar基因大肠杆菌BL21 (DE3)的构建
将重组质粒pET30a(+)-bar转化大肠杆菌BL21(DE!3)感受态细菌中，在含有Kan 的LB平板上培养过夜，然后挑取白色菌落抽质粒经电泳鉴定，得到BL21/pET30a (+) -bar表达工程菌。
实施例5 :BL21/pET30a(+)-bar表达工程菌的发酵培养
挑取BL21/pET30a(+)-bar单个菌落，接种于含终浓度为30 μ g/mL卡那霉素(Kan) 的LB液体培养基中(1L溶液中含有IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和10gNaCl，pH 7. 0),37 °C 过夜培养。第二天以2%接种量接入新鲜的含Kan终浓度为30 μ g/mL的LB液体培养基中， 37°C继续培养3 4h，至菌密度OD6tltl达到0.6。诱导之前取ImL样品，作为未诱导对照。在剩余的菌液中加入异丙基硫代-β -D-半乳糖苷至终浓度lmmol/L，继续培养4h，收获菌体。
实施例6 :BL21/pET30a(+)-bar表达工程菌发酵菌体中表达产物的检测
将对照和诱导表达后的菌体分别取ImL离心去上清，沉淀各自加入100 μ L的 2XSDS-PAGE电泳上样缓冲液重悬菌体，样品在100°C沸水锅中煮沸5min，取20 μ L进行 15%的SDS-PAGE电泳鉴定。结果可见，异丙基硫代_ β -D-半乳糖苷诱导与未诱导的重组菌相比，在30KDa附近明显增加了一条表达量较高的蛋白条带，产物表达量约占总菌体蛋白的50%以上，而空载体转化菌pET30a(+)诱导后在同一位置未出现相应的蛋白带，如图4 所示。
实施例7 重组基因工程大肠杆菌的保存
工程菌加3O %甘油，-7O度保存。
实施例8 重组膦丝菌素乙酞转移酶的可溶性分析
(1)菌体破碎与裂解将BL21/pET30a(+)-bar表达工程菌发酵菌体用Tris缓冲液(pH8.0)重悬沉淀。加入溶菌酶、核糖核酸酶A、脱氧核糖核酸酶I，终浓度依次为 100 μ g/mL、200 μ g/mL、20 μ g/mL,冰浴作用 20min。13000r/m, 4°C，离心 20min，分别收集沉
淀和上清。
(2)重组膦丝菌素乙酞转移酶可溶性的分析分别取上清和沉淀，各自加入 100 μ 1的2X SDS-PAGE电泳上样缓冲液，100°C煮沸5min，取20μ 1进行15%的SDS-PAGE 电泳鉴定。结果表明，上清和沉淀在靠近30KDa分子量处均产生了明显的表达条带，但是沉淀样品中重组膦丝菌素乙酞转移酶含量较高，说明其主要以包涵体形式存在，如图5所示。
实施例9 优化诱导表达条件提高重组膦丝菌素乙酞转移酶的溶解性
为了获得可溶性表达的重组膦丝菌素乙酞转移酶，先后采用了以下方法优化诱导表达条件⑴摇菌温度由37°C降至30°C和20°C; (2)缩短异丙基硫代-β _D_半乳糖苷诱导表达的时间，由4h降至池和Ih ； (3)降低异丙基硫代- β -D-半乳糖苷的浓度，由ImM降至0. 5mM和0. 25mM ； (4)升高异丙基硫代-β -D-半乳糖苷诱导前菌体的0D_值，由0. 6提高至0. 8和1. 0。除了摇菌温度下降能提高重组膦丝菌素乙酞转移酶的可溶性外，其它处理的效果均不明显，大部分重组膦丝菌素乙酞转移酶仍在沉淀中。说明温度较低有利于重组蛋白的可溶性增加。
实施例10 重组膦丝菌素乙酞转移酶的可溶性增强的处理
(1)菌体细胞裂解BL21/pET30a(+)-bar表达工程菌发酵培养，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度lmm0l/L，3(TC低温下诱导表达4h，收集菌体。用结合缓冲液 (50mM NaH2PO4,300mM NaCl、20mM咪唑)重悬细胞，每克菌体加2 5mL结合缓冲液，加溶菌酶、核糖核酸酶A、脱氧核糖核酸酶I，终浓度依次为100 μ g/mL、200 μ g/mL和20 μ g/mL, 冰浴20min。
(2)提高可溶性重组膦丝菌素乙酞转移酶效率的方案在细胞裂解液中加入二硫苏糖醇、N-十二烷基肌氨酸钠和0. 2%的脱氧胆酸钠，冰上超声破碎IOmin (每次超声8s，间隔6s)。4°C下，13000r/m,20min离心，分别收集沉淀和上清。将上清中加入2%的聚乙二醇辛基苯基醚，用0. 45 μ m滤膜过滤后进行过柱纯化。设计16种不同的试验方案对细胞裂解液进行处理，以寻找能提高蛋白可溶性的最佳方案。结果表明，N-十二烷基肌氨酸钠终浓度在1. 0% 2. 5%时，均能有效提高重组蛋白的可溶性，但为了防止其对重组膦丝菌素乙酞转移酶的活性造成影响，选择较低浓度1. 0% N-十二烷基肌氨酸钠；二硫苏糖醇终浓度在2. 5 IOmM时，能提高蛋白可溶性，其中5mM 二硫苏糖醇效果最好。此外，先加二硫苏糖醇比先加N-十二烷基肌氨酸钠的增溶效果要好，可能是二硫苏糖醇处理后促进了 N-十二烷基肌氨酸钠对菌体的裂解。超声破碎处理的时间越长越能提高蛋白的可溶性，但时间过长，可能会引起蛋白的降解，因此选择超声破碎lOmin。经过二硫苏糖醇、N-十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠处理后得到的上清液，在过柱前，不加入聚乙二醇辛基苯基醚处理较加入聚乙二醇辛基苯基醚处理得到的可溶性蛋白量少，说明，聚乙二醇辛基苯基醚有利于重组蛋白的挂柱，可以较少洗脱过程中重组蛋白的损失。
表1不同处理对重组膦丝菌素乙酞转移酶可溶性的影响
权利要求
1.一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征包括以下工艺步骤1)设计bar基因PCR引物，上游引物barl核苷酸序列如SEQNo. 1所示，下游引物bar2 核苷酸序列如SEQ No. 2所示，采用引物barl和bar2，以质粒pDsBar 1300为模板进行PCR 扩增，获得bar基因全长序列，bar基因全长序列如SEQ No. 3所示；2)将得到的bar基因定向克隆到含有T7启动子的原核表达载体pET30a(+)中，构建重组质粒 pET30a(+)-bar ；3)将构建的重组质粒pET30a(+)-bar转入大肠杆菌BL21(DE!3)宿主菌中，构建工程菌 BL21/pET30a(+)-bar ；4)将工程菌BL21/pET30a(+)-bar发酵培养，诱导融合蛋白表达，使工程菌内获得特异性表达蛋白；5)将得到的特异性表达蛋白进行增加可溶性处理，然后进行分离提取，得到膦丝菌素乙酞转移酶粗制品；6)将膦丝菌素乙酞转移酶粗制品进行分离纯化，即得到膦丝菌素乙酞转移酶纯品；7)纯品经透析、冷冻干燥后，置于-70°C超低温冰箱中保存；上述步骤幻中特异性表达蛋白进行增加可溶性处理具体步骤包括a)发酵培养后的工程菌，用含有50mMNaH2PO4,300mM NaCl和20mM咪唑且pH为8. 0的低咪唑浓度结合缓冲液重悬细胞，再在菌体中加入溶菌酶、核糖核酸酶A、脱氧核糖核酸苷酶I，终浓度分别为100 μ g/mL、200 μ g/mL、20 μ g/mL,冰上作用20 30min ；b)接着在上述溶液中依次加入二硫苏糖醇、N-十二烷基肌氨酸钠和脱氧胆酸钠，终浓度分别为2. 5 IOmMU 2. 5%和0. 2%，冰上作用20 30min，再进行冰上超声破碎 IOmin ；c)破碎后在温度4°C下进行高速离心，离心速度为12000 14000r/m，离心10 20min 后，弃沉淀取上清，然后在上清中加入终浓度为1 2%的聚乙二醇辛基苯基醚，过0. 45 μ m 滤膜后，得到膦丝菌素乙酞转移酶粗制品。
2.如权利要求
1所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中PCR反应条件为94°C预变性4min ；94°C变性50s，55°C退火50s，72°C延伸50s， 共30个循环；循环结束后72°C再延伸lOmin。
3.如权利要求
1所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中工程菌BL21/pET30a(+)-bar在培养基中培养至OD_为0.6时，加入异丙基硫代- β -D-半乳糖苷至终浓度为ImM，然后在30°C低温下诱导表达4h，使工程菌内获得特异性表达蛋白。
4.如权利要求
1所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于步骤6) 中膦丝菌素乙酞转移酶粗制品进行分离纯化具体步骤包括先将膦丝菌素乙酞转移酶粗制品与M-NTA琼脂糖在4°C下结合1小时，再将该混合物装入空色谱柱，然后先用漂洗缓冲液洗柱，再用低咪唑浓度的洗脱缓冲液洗脱去除杂蛋白，最后用高咪唑浓度的洗脱缓冲液收集目的蛋白，即可获得膦丝菌素乙酞转移酶纯品。
5.如权利要求
4所述的一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，其特征在于所述的漂洗缓冲液含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和50mM咪唑，所述的低咪唑浓度的洗脱缓冲液含有50mM NaH2PO4,300mM NaCl和75 125mM咪唑，pH为8. 0，所述的高咪唑浓度的洗脱缓冲液含有 50mM NaH2PO4,300mM NaCl 和 150 250mM 咪唑，pH 为 8. 0。
专利摘要
一种重组膦丝菌素乙酞转移酶的制备方法，属于生物技术领域：
。其包括以下步骤1)设计bar基因PCR引物，PCR扩增得到bar基因；2)构建重组质粒pET30a(+)-bar；3)构建工程菌BL21/pET30a(+)-bar；4)发酵培养，获得特异性表达蛋白；5)特异性表达蛋白进行增加可溶性处理；6)分离纯化膦丝菌素乙酞转移酶粗制品；7)保存。本发明设计合理，通过本发明可以快速得到大量、高纯度、可溶的重组膦丝菌素乙酞转移酶，该酶可作为抗原用以制备单克隆抗体，用于进行含膦丝菌素乙酞转移酶转基因产品的定性、定量检测，为有效抗原筛选、诊断试剂的开发以及转基因作物安全性评价奠定基础。
文档编号C12N15/54GKCN101864438 B发布类型授权 专利申请号CN 201010177058
公开日2012年6月20日 申请日期2010年5月19日
发明者刘连盟, 王玲, 黄世文 申请人:中国水稻研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan