与凡纳滨对虾Rab7具有结合活性的VP28蛋白片段的高效表达与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及与凡纳滨对虾蛋白分子Rab7结合的对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸，对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸的高效表达及在抗WSSV感染中的应用。本发明利用全基因合成技术,在不改变氨基酸序列的情况下,将编码VP28羧基端(VP28C)氨基酸的密码子改为大肠杆菌偏性密码子,将其构建入原核表达载体pBAD/gIIIA中，组成高效表达重组质粒pBAD/gIIIA-VP28C,然后转化大肠杆菌，经阿拉伯糖诱导，VP28C表达量占菌体总蛋白的40％以上,大大高于文献报道的表达水平,为大规模生产VP28C用于对虾白斑综合征病毒防治,减低生产成本提供基础。本发明还涉及VP28C在防治对虾白斑病中的应用。
【专利说明】与凡纳滨对虾Rab7具有结合活性的VP28蛋白片段的高效 表达与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因生物工程【技术领域】，具体涉及一种与凡纳滨对虾Rab7具有结合 活性的VP28蛋白片段，该蛋白片段的高效表达方法以及该VP28蛋白片段在防治对虾白斑 病中的应用。
【背景技术】
[0002] 对虾白斑杆状病毒（WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的 主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生 态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，给水产 养殖业造成严重的经济损失。因此针对对虾白斑综合征病毒的药物开发受到广泛关注。
[0003] 对虾为无脊椎动物，不具备特异性免疫系统，但近年的研究表明，对虾存在类免疫 (quasi-immune)应答机制，WSSV的重组蛋白可以诱导对奸产生抗病保护效应（Johnson, K. N., van Hulten, M. C. , Barnes, A. C. , 2008. "Vaccination" of shrimp against viral pathogens:phenomenology and underlying mechanisms.Vaccine 26, 4885 - 4892.； Litman, G. W. , Dishaw, L. J. , Cannon, J. P. , Haire, R. N. , Rastj J. P. , 2007. Alternative adaptive immunity in invertebrate. Current Opinion in Immunology 19, 526 - 534)〇 目前有关对虾白斑综合症病毒亚单位疫苗的研究大多围绕诱导产生高效免疫应答能 力的囊膜蛋白进行免疫接种方式来展开。VP28是WSSV的一个重要的囊膜蛋白，WSSV 的致病性与其密切相关（van Hulten，M. C.，Wstenberg，M.，and Goodal 1，S. D. 2002. Identification of two major virion protein genes of white spot syndrome virus of shrimp. Virology，266(2) :227-236)。VP28 参与 WSSV 的黏附与入侵过程（Yi，G.，et al. VP28of white spot syndrome virus is involved in the attachment and penetration into shrimp cells[J]. J. Biochem. Mol. Biol，2004, 37:726-734 ;陈文博， 谭珍一，刘庆慧，侯林，黄使.对虾白斑综合症病毒VP28基因的表达及其与血细胞的 结合.渔业科学进展.2009(4) :44-49)，进一步研究表明，VP28与对虾分子Rab7有互作 (Sritunyalucksana, K. , et al. PmRab7Is a VP28_Binding Protein Involved in White Spot Syndrome Virus Infection in Shrimp. Journal of Virology. 2006. 10734-10742), 但Rab7与VP28作用的关键区段并不清楚。Witteveldt等在原核系统中将VP28蛋白表 达，并利用该蛋白对对奸进行免疫，取得了较好的免疫效果（Witteveldt J，Cifuentes C C,Vlak J M, et al. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oral vaccination. Journal of Virology，2004, 78 (4): 2057-2061)。进一步的 试验表明在通过肌肉注射或者给对虾投喂混有VP28的饲料后，对虾感染WSSV后的存活 率明显上升（Jha R.K.，Xu Z.R.，Bai S.J.，Sun J.Y.，Li W.F.，Shen J. 2007. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral vaccine expressed in Pichia pastoris. Fish&shellfish immunology, 22:295-307 ； Satoh J. , Nishizawa T.Yoshimizu M. 2008.Protection against white spot syndrome virus (WSSV) infection in kuruma shrimp orally vaccinated with WSSV rVP26and rVP28. Diseases of Aquatic Organisms, 82:89-96 ;Caipang C. M. A. , Verjan N. , Ooi E. L. , Kondo H. , Hirono I. , Aoki T. , Kiyono H. , Yuki Y. Enhanced survival of shrimp, Penaeus (Marsupenaeus)japonicus from white spot syndrome disease after oral administration of recombinant VP28expressed in Brevibacillus brevis. Fish&Shellfish Immunology. 2008,25,315-320)。但目前采用原核表达技术重组表达 VP28时，目的蛋白VP28仅占包含体总蛋白的10%以下（陈文博，谭珍一，刘庆慧，侯 林，黄佳.对虾白斑综合征病毒vp28基因的表达及其与血细胞的结合.渔业科学进 展.2009, 30(4) :44-49)，由于目标蛋白的表达量低，生产成本高，限制了 VP28在防治对虾 白斑综合征病毒病中的应用。本发明生产的基因工程蛋白优点在于，重组蛋白表达量高， 使生产成本大大降低，且VP28C对凡纳滨对虾抗WSSV感染保护效果好。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种配体多肽，是与凡纳滨对虾蛋白分子Rab7结合的对虾 白斑综合征病毒VP28多肽，其特征是含VP28羧基端84个氨基酸，命名为VP28C。
[0005] 本发明的再一目的是提供一种对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸的高 效表达方法，即在不改变氨基酸序列的情况下，将编码VP28的基因密码子改为大肠杆菌偏 性密码子，从而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明首先提供一种与凡纳滨对虾蛋白分子Rab7具有结合作用的，编码对虾白 斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸的核苷酸片段，其序列为SEQ ID NO: 1 ;
[0007] 本发明还提供一种提高对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸表达量的核 苷酸片段，其序列为SEQ ID NO:2 ;
[0008] 本发明还提供一种重组表达质粒，是将上述的核苷酸片段插入到原核表达载体中 构建的；
[0009] 所述的原核表达载体优选为pBAD/gIIIA ;
[0010] 本发明还提供一种重组表达菌株，为携带有上述原核表达载体的大肠杆菌。
[0011] 本发明还提供一种表达对虾白斑综合征病毒VP28羧基端84个氨基酸的方法，是 用上述的重组表达菌株进行发酵来生产对虾白斑综合征病毒VP28蛋白。
[0012] 本发明的另一个目的是提供重组蛋白VP28羧基端84个氨基酸在对虾抗WSSV感 染中的应用技术。本发明生产的VP28羧基端84个氨基酸可通过注射、浸泡、口服等方式给 药，较佳通过对甲壳类口服或浸泡给药。
[0013] 本发明人工合成对于核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的对虾白斑综合征病毒VP28蛋 白的密码子进行优化的序列SEQ ID No: 2,将其分别插入原核表达载体pBAD/gIIIA多克隆 位点中，构建成高效重组表达质粒pBAD/gIIIA-VP28C，然后转化大肠杆菌ToplO，获得阳性 重组体。该重组体经培养及L-阿拉伯糖诱导表达，VP28C的表达量占菌体蛋白总量的40% 以上，明显高于相关文献报道的重组VP28蛋白表达的水平，为大规模发酵生产降低生产成 本提供可能。将表达的重组Rab7蛋白进行SDS-PAGE电泳并转引印于PVDF膜上，与标记的 VP28C作用，可见明显的结合活性，采用重组蛋白VP28C可提高凡纳滨对虾抗白斑综合征病 毒感染。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图I :vp28C的琼脂糖凝胶电泳图；
[0015] 其中：Lane M :DL2, 000DNA Marker ;Lane 1，2: PCR 产物；
[0016] 图2 :重组质粒的双酶切核酸电泳图，
[0017] 其中：Lane M : X-Hind III digest ;Lane 1:重组质粒双酶切?
[0018] 图 3 :SDS-PAGE 和 Western-bloting 分析重组 VP28C ;
[0019] 其中：Lane 1，蛋白分子质量标准；Lane 2，重组表达的VP28C ;Lane 3，重组表达 的VP28C经SDS-PAGE分离后，转印于PVDF膜上与anti-His抗体作用显色带。
[0020] 图 4 :SDS-PAGE 分析重组 VP28 ;
[0021] 其中：Lane 1，蛋白分子质量标准；Lane 2，未诱导重组菌VP28 ;Lane 2, 3，L-阿 拉伯糖诱导重组VP28 ;
[0022] 图5: Rab7蛋白与VP28C结合；
[0023] 其中：Lane I :VP28C与Rab7结合带（箭头示Rab7蛋白）；Lane 2:空载体对照。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件如 Sambrook 等，分子克隆：实验室手册 New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0025] 实施例1重组体的构建：
[0026] 对于核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的对虾白斑综合征病毒VP28蛋白（氨基酸序列 为SEQ ID NO: 3)的密码子进行如下突变，编码精氨酸的密码子变为CGT，编码苏氨酸的密 码子变为ACC，编码苯丙氨酸的密码子变为TTT，编码赖氨酸的密码子变为AAA，编码缬氨酸 的密码子变为GTT，编码天冬酰胺的密码子变为AAT，编码丝氨酸的密码子变为AGC，编码赖 氨酸的密码子变为AAA，编码异亮氨酸的密码子变为ATT，编码脯氨酸的密码子变为CCG，编 码丙氨酸的密码子变为GCA，编码谷氨酸的密码子变为CAA，编码甘氨酸的密码子变为GGT， 编码亮氨酸的密码子变为CTG，编码天冬氨酸的密码子变为GAT，编码酪氨酸的密码子变为 TAT，编码组氨酸的密码子变为CAT，改造后的核苷酸的序列为SEQ ID No :2。
[0027] 为了便于与载体进行连接，在序列的两端加上酶切位点NcoI和Xbal。将合成好的 基因片段vp28C用NcoI与XbaI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳及胶回收纯化后的酶切片段连 接至经NcoI与XbaI酶切处理过的pBAD/gIIIA载体上。酶切、连接所用试剂均为Fermentas 公司产品。酶切反应体系如表1所示。
[0028] 表1 :双酶切体系组成
[0029]
【权利要求】
1. 一种配体多肽，其特征在于，所述的配体多肽为对虾白斑综合征病毒VP28蛋白的片 段，其氨基酸序列为SEQ ID N0:3。
2. 编码权利要求1所述的配体多肽的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的 序列为 SEQ ID N0:1。
3. 如权利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID N0:2。
4. 一种重组表达质粒，其特征在于，所述的重组表达质粒是将权利要求3所述的核苷 酸片段插入到原核表达载体中构建的。
5. 如权利要求4所述的重组表达质粒，其特征在于，所述的原核表达载体为pBAD/ gIIIA〇
6. -种重组表达菌株，其特征在于，所述的重组表达菌株为携带有权利要求4所述的 重组表达质粒的大肠杆菌。
7. -种表达权利要求1所述的配体多肽的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要 求6所述的的重组表达菌株进行发酵生产的。
8. 权利要求1所述的配体多肽在制备对虾抗WSSV感染制品中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK104356210SQ201410579865
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】宋晓玲, 孙艳, 王秀华, 李玉宏, 黄倢 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所