表达鸡β干扰素的CHO细胞系及其应用的制作方法

专利名称：表达鸡β干扰素的CHO细胞系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达脊椎动物卩干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述 动物(3干扰素的基因。更具体地，本发明公开了表达鸡(3干扰素的CHO 细胞系。本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产鸡P干扰素标准品的方 法以及通过该方法获得的的鸡P干扰素，其具有极高的比活性和稳定性， 可用作鸡卩干扰素生物学活性检测时的标准品和用于鸡传染性疾病的预防 和治疗。
背景技术：
I型干扰素是脊椎动物天然免疫系统的重要组成部分，为现代医学的 重要研究领域。如今，病毒感染宿主时逃避干扰素等天然免疫的机制成为 研究热点[1-3]，这为病毒防治在理论上提供有力支持。鸡马立克氏病 (marek's disease virus ， MDV) [4'5]、鸡贫血病毒(Chicken anaemia virus ) [6]、传染性粘液囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV ) [6'7]、新 城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV) [8'9]、禽流感病毒(Avian Influenza virus, AIV) [1"2]等病毒在感染宿主时，破坏I型干扰素系统都为它们突 破宿主免疫系统的一个重要的机制。
I型干扰素在人的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B) [13'14]、慢性丙型 肝炎(chronic hepatitis C) [15]、多发性硬化症(multiple sclerosis) [16〗、月中
瘤疾病[17'18]及其它疾病19'2()]的治疗中发挥了重要作用。鸡I型干扰素对 MDV則、NDV[22]、 AIV问等常见鸡病毒病的治疗具有良好的前景。目前， 国内的鸡I型干扰素的生产主要采用原核[24]和酵母表达系统[25]。
因此，不管是I型干扰素相关的基础研究还是临床使用，都需要高活 性、天然的I型干扰素样品，此外还需要对其生物学活性进行准确、便捷 的定量。干扰素的定量需要稳定的标准品，目前农业部颁布的兽用生物制 品质量标准中的脊椎动物天然鸡白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导鸡白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性较低，约为
10000 AU* mL—1。哺乳动物细胞表达的脊椎动物干扰素是与其它表达系统 相比能够正确折叠、糖基化和翻译后修饰，因此更稳定、比活性更高、更 适合作为标准品，而目前缺乏源于哺乳动物细胞的脊椎动物鸡的IFN-(3标 准品。综上，获得高水平哺乳动物细胞表达的脊椎动物鸡I型干扰素具有 重要的基础研究和应用研究意义。

发明内容
本发明的一个目的是建立高效表达鸡IFN-P的CHO-K1细胞表达系
统。 .
具体地，本发明涉及如下各项
1. 一种表达鸡(3干扰素的CHO细胞系(Chinese Hamster Ovary Cell, 中国仓鼠卵巢细胞)，其含有(或表达)编码鸡P干扰素的基因。
2. 根据权利要求l所述的CHO细胞系，其中所述鸡|3干扰素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述编码鸡p干扰素的 基因如SEQ ID NO: 1所示。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码鸡(3 干扰素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No. 2414的CHO细胞系。
6. —种生产鸡P干扰素标准品的方法，该方法包括
1) 培养根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系；
2) 从所述的CHO细胞系的培养液中提取P干扰素，用作鸡P干扰素 的标准品。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCC No. 2414的CHO细胞系。
8. 根据权利要求6或7的方法生产的鸡p干扰素标准品。
9. 一种试剂盒，其包含根据权利要求6或7的方法生产的鸡卩干扰素 标准品，该试剂盒可以用于鸡传染性疾病的预防和治疗或者用于鸡P干扰10.根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的鸡(3 干扰素在制备药物中的应用，所述药物用于鸡传染性疾病的预防和治疗。 所述疾病特别是禽流感病毒引起的疾病。
更具体地，在本发明的一个实施方案中，把鸡P干扰素(ChIFN-p) 的ORF基因克隆至真核稳定表达载体pCI-neo (ChIFN-p在高效启动子 CMV控制下表达)，并稳定转染至CHO-K1细胞，经G418压力筛选和2 次单克隆，筛选出可稳定表达重组ChlFN-(3的CH0-K1细胞克隆 (CHO-ChIFN-P)。本发明的一株阳性CHO细胞克隆(CHO-ChIFN-P，中 国仓鼠卵巢细胞(C7n'""e/Za脂^ Ovw^ "//))于2008年3月25日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国，北 京)，保藏号为CGMCCNo.2414。在25ci^的细胞瓶(5ml培养液)中， 重组ChIFN-P的累积表达水平达到6.9xl04 AU/ml，每天的表达量可达 4.3x104 AU (antiviral units) /ml或0.043AU/个细胞。CHO-ChIFN-卩细胞 可在无G418压力筛选下稳定表达至少20代。表达的重组ChIFN-p可以诱 导原代鸡胚成纤维细胞(CEFs)表达鸡Mx蛋白。此外，其还可以完全保 护CEFs细胞抵抗1000 TCIDsq的禽流感病毒(H5N1亚型强毒株)的感染。 综上，本发明中CHO-ChIFN-p细胞稳定、高效表达的重组ChFN-P具有 天然鸡I型干扰素的生物学活性，具有良好的基础和应用研究价值。
本发明的专利性
新颖性
与已经使用的表达脊椎动物鸡卩干扰素的技术相比(目前干扰素表达 所采用的表达系统主要是原核、酵母表达系统，使用CHO表达脊椎动物 鸡P干扰素的国内外未见报道)，表达的技术路线完全不同。表达的产物 在折叠、糖基化、翻译后修饰、稳定性、比活性上要大大优于已有的技术 手段(原核、酵母)。
创造性
1、与已有的原核和酵母表达系统比较，本发明CHO表达系统表达出 的干扰素在蛋白的折叠、糖基化等翻译后修饰上最接近于天然干扰素，比 活性更高，约是原核的10倍；2、由于我们的目的是表达最接近天然活性的干扰素，而农业部颁布的 兽用生物制品质量标准中的天然鸡白细胞干扰素是以鸡新城疫病毒诱导
鸡白细胞获得的，制作工艺和产品成分复杂，最终产品的活性约10000AU mU1。与此相比较，本发明的表达系统的ChIFN-P的表达水平是其70 倍或以上，且工艺简单、产品成分容易控制，具有极大的优越性。
综上因此以CHO表达的鸡卩干扰素与原核和酵母表达的相比较具 有极大的优越性和创造性。
附图简述


图1.重组ChIFN-卩在CHO-ChIFN-卩细胞中的表达；
图2.传代次数对CHO-ChIFN-p细胞表达重组ChIFN-卩的影响；
图3.免疫印迹检测ChlFN-(3cHo诱导CEFs细胞Mx蛋白的表达。在用 ChlFN-(3cHo刺激后在CEFs细胞中的Mx蛋白的表达是剂量依赖型的。在 缺少(0)或存在(6.9X10-2至6.9x103 AU/ml， A至F)的ChIFN-(3CH0下刺激 CEF细胞，并通过Western blotting分析，A, 6.9X l(r2; B, 6.9X 10"; C, 6.9; D, 6.9X 101; E, 6.9xl02; F, 6,9xl03;
图4, ChIFN-(3CH0 (A至D)和mockCHO (E)上清液的抗病毒活性滴定。 CHO-ChIFN-(3细胞和CHO-K1细胞的上清液分别被命名为ChIFN-PcHo和 mockcHo，CMFN陽卩cHo稀释l()3倍(A)， K)4倍(B), 105倍(0, 106倍(0), mockpCA 稀释10M咅(E)，并且不含IFN但加入病毒对照的孔被设定为病毒对照(F);
图5. CHO-ChIFN-卩细胞表达的重组CWFN-卩体外抗病毒活性。用10 倍稀释的CWFN-卩cho (68961 AU/ml)处理CEFs 24小时，用1000 TCID50 H5N1亚型禽流感病毒SW101毒株和SW103毒株攻击，感染后48小时， 稀释103倍的ChIFN-pCHO(69 AU/ml)可以完全抵抗SW101毒株和SW103 毒株的感染，但是104和105倍稀释不能；
图6.鸡卩干扰素的氨基酸序列(SEQIDNO:2);
图7.编码鸡卩干扰素的基因(SEQIDNO:l);
图8.质粒pCN-ChlFN-(3的核苷酸序列，其中1171-1779位(斜体部 分)是ChIFN-P基因，1165-1170 (双下划线标记部分)是Kozak序列。
具体实施例方式
下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例 说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利 要求具体限定。
实施例.高效稳定表达重组鸡P干扰素的CHO表达系统的构建及生物活
性检测
1材料与方法
1.1质粒、细胞株和毒株
鸡红血球采自SPF鸡(商购自哈尔滨兽医研究所)并按常规方法制备; 新城疫F48e9毒株商购自哈尔滨兽医研究所，于原代鸡胚成纤维细胞
(Chicken embryo fibroblasts, CEFs)上滴定半数组织培养感染剂量(Tissue Culture Infectious Dose50 ， TCID50) ; H5N1亚型禽流感病毒SW101毒株
(SW101)和SW103毒株(SW103)毒株商购自哈尔滨兽医研究所。 稳定真核表达载体pCI-neo (pCN)购自Promega公司，neo在SV40 早期启动子的控制下表达。CHO-K1细胞株商购自ATCC (ATCC No. CCL-61), CHO-K1细胞于含10%FBS的DMEM-Ham，s F12 (DF12)培 养基(invitrogen)中培养。pMD18-T载体购自TaKaRa公司；原核表达质 粒pET-32a(+) (Novagen公司)、BHK-21细胞(ATCC No. CCL-10)均由 本实验室保存；原代鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts, CEFs) 采用10日龄的SPF鸡胚常规方法^制备；表达增强绿色荧光蛋白重组水 疱性口炎病毒(VSV*GFP)由本实验室参考文献通过反向遗传技术构建 [26];新城疫LaSota株病毒(CCVC NO. AV1615)商购自中国微生物菌种 保藏管理委员会组织系统(CCCCM)下属的兽医微生物菌种保藏管理中 心(CVCC)，由本实验室保存，CEFs滴定PFU (plaque forming unit)后 -7(TC保存备用。
1.2试剂与仪器T4 DNA聚合酶购自MBI公司。Ni-NTA琼脂糖亲和树脂、硝酸纤维 素膜购自Pierce公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、鱼皮蛋白购自 Sigma公司；高亮萤光素酶检测试齐U (Bright-Glo Luciferase assay system) 购自Promega公司；各种限制性内切酶和Ex-Taq酶都购自TaKaRa公司； T4 DNA连接酶购自MBI公司；质粒中量提取试剂盒购自Qiagen公司； 转染试剂Fugene6购自Roche公司;96孔白色板(96 well white plate)购 自Corning公司；荧光倒置显微镜为LEICA公司产品；Microplate Fluorescence Reader (FLx800 )为Bio-Tek公司产品，可检测发光和荧光； CEQ8000自动测序仪为Beckman公司产品。Grace's培养基、DMEM培养 基、Trizol和M-MLV反转录试剂盒购于Invitrogen公司。荧光素(FITC) 标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物技术公司。DAB显色试剂盒购自博 士德公司。
1.3干扰素基因克隆和质粒构建
从GenBank获取鸡IFN-卩(ChIFN-卩)的ORF序列(GenBank Accession No. AY831397 )，设计引物。ChIFN-卩的上游引物为5'-TGC CAC CAT GAC TGCAAACCATCAG隱3，；下游引物为5'画ACT CAC TGG GTG TTG AGA CGTT-3'。上游引物在起始密码子ATG前加入了利于表达的Kozak序列。
CEFs待生长至100%左右时，按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1.0接种新城疫LaSota株病毒。感染后8个小时收细胞，用Trizol (invitrogen)提取总RNA，进行RT-PCR。扩增的ChIFN-卩PCR产物克隆 到pMD18-T载体，获得质粒pMD18-ChlFN-P，并测序鉴定。
把pMD18-CMFN-卩以￡co/ I双酶切下ChlFN-(3的ORF片断分别 亚克隆至以五coi IAY7w I双酶切的质粒pCAGGS[27'28]，获得真核表达质粒 pCA-ChIFN-(3。
从质粒pMD18-ChlFN-(3以&oiI双酶切下ChIFN-P的ORF片断，
以T4 DNA聚合酶平滑化末端克隆至Sma I酶切的质粒pCN，获得稳定真 核表达质粒pCN-ChIFN-(3。
1.4抗病毒活性滴定IFN抗病毒活性定量检测的操作步骤见参考文献P6]，具体如下CEFs 细胞于96孔细胞板中生长至密度为90%，弃上清，每孔加10倍梯度稀释 IFN样品100)il，每个稀释倍数设3个平行对照孔，37"C及5。/^C02培养条 件下处理24h后，弃上清，用含2°/(^88的0]^￡]^稀释￥8￥*0 ，按每 孔30000 PFU (lOOjil)加入病毒稀释液，同时设未经转染上清处理，只加 病毒液的病毒对照(Virus Control, VC)孑L。不加干扰素和病毒的孔，作 为空白孔(Blank Control, BC)。接毒后至VC孔的CPE (cytopathic effect) 约为100%时，荧光倒置显微镜下观察GFP表达及病毒感染复制情况。最 后所有孔每孔加入50pl细胞裂解液(cell lysis buffer, CLB)
,于摇床上裂解15min释放细胞内的 GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏感性设置为70，激发光485 nm， 吸收光528 nm)检测每孔绿色荧光蛋白的相对表达水平。判定以BC孔 校0，以VC孔为参照，每mL中，以表达绿色荧光数减少为VC孔50X 的平均最高稀释度为一个抗病毒活性抑制单位(Antiviral Unit, AU)，计 算具体如下。
基于VSV*GFP检测方法是计算半数病毒复制抑制的稀释倍数，方法 如下若绿色荧光蛋白相对荧光值(Relative Fluorescence Units, RFU)用 F表示，以BC孔校0，则50%病毒复制抑制的荧光值(F50) =F (VC) /2，按下面公式计算IFN的抗病毒活性单位Iog,o[每mL中IFN抗病毒活 性单位(AU) ]二[F50—F(小于F50孑L)]/[F(高于F50孑L)一F(小于F50孑L)] 十logK)[小于F50孔的稀释倍数]。.
1.5瞬时转染
按照Fugene 6 (Roche公司)按操作说明书转染pCA-ChIFN-卩和 pCAGGS至BHK-21细胞(ATCC No. CCL-10)(于含5%FBS的DMEM 中培养，培养条件为37'C及5XC02)，于转染后16 h换新鲜培养基，继 续在相同条件下培养48h收获细胞培养上清，分别命名为ChlFN-(3pCA和 mockpCA，分装并于-7(TC保存备用。
1.6稳定转染首先确定筛选培养基中合适的G418 (invitrogen)浓度，方法如下 24孔细胞培养板接种每孔1000个CH0-K1细胞，并加G418使其浓度分 别为100、 200、 300 1200吗/ml，选择能在10—14天把细胞彻底杀死的 孔作为G418的筛选浓度。
参照转染试剂Fugene 6操作说明书转染pCN-ChIFN-(3至CHO-K1细 胞。转染后24小时，按1:8的比例进行细胞传代，用含有800 jig/ml G418 的压力筛选培养液筛选培养细胞，10 14天后，用克隆环圈住具有新霉素 抗性的细胞克隆集落，胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养 板扩大培养。筛选出的不同细胞克隆按照0.5"06个细胞接种于6孔细胞 培养板中生长至密度为100%后24小时，收取细胞培养上清，分别如上用 VSV*GFP进行抗病毒活性滴定，选择表达水平最高的克隆按有限稀释法 再进行单细胞克隆，按上述步骤筛选表达量最高的克隆后，扩增并按常规 方法冻存细胞，命名为CHO-ChIFN-P，含有重组ChlFN-(3的细胞培养上 清命名为ChIFN-卩cHo。将CH0-ChIFN-(3于2008年3月25日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保 藏号为CGMCC No. 2414。
1.7鸡Mx蛋白多克隆抗体的制备
I型IFN发挥其抗病毒生物学功能的途径之一是经由JAK-STAT信号 转导途径激活Mx启动子(Mx promoter, Mxp)，表达的Mx蛋白(Mx protein)能够抑制负链RNA病毒复制；Mxp有较好的专一性，它不能被 白细胞介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF) 等其它细胞因子启动。通过对鸡、鸡和牛的Mx蛋白氨基酸序列进行同源 性分析，发现有部分同源性，主要位于Mx蛋白的N端，因此设计引物扩 增鸡Mx蛋白的N端序列，长810bp，并克隆到原核表达载体pET-32a(+)， 表达的原核蛋白经Ni-NTA免疫小鼠制备的多抗，用于这三种动物的Mx 蛋白的检测。
新城疫病毒MOI为1.0感染细胞密度为约为100X的CEFs，待细胞病 变达60%—80%时收获细胞，用Trizol提取总RNA，并用括号中的引物 (上游引物为5，-GGG GAT ATC AGC AAT CAG ATG GCT TTC-3，，引入￡coi V酶切位点；下游引物为5，-TTT GTC GAC TGG GAT GAC CTC GTT TTG-3，引入I酶切位点)进行RT-PCR，扩增鸡Mx蛋白ORF的前半 部分基因片段，PCR产物以&o/ I双酶切后克隆到五coR VAS""/ I
双酶切后的pET-32a(+)上，获得鸡Mx蛋白的原核表达质粒，鸡Mx蛋白 表达框架与载体上的His标签融合。质粒转化到大肠杆菌BL21中，用 0.5mM IPTG于37"C诱导3小时后，SDS-PAGE电泳检测融合蛋白表达。 表达产物参照Ni-NTA琼脂糖亲和树脂纯化说明书纯化后，透析除去尿素。 以纯化的鸡Mx蛋白原核表达蛋白按常规方法免疫BALB/C小鼠(商 购自维通利华公司)，免疫前断尾采血，分离免疫前小鼠血清，然后按常 规程序免疫小鼠并采血分离血清，于-2(TC保存备用。
1.8 Mx蛋白的诱导表达
CEFs细胞于6孔板中生长至单层汇合，分别加入梯度稀释的重组 ChIFN-(3CH0， 37。C及5%0)2孵育24小时后，用胰酶(amresco)消化细 胞，3000rpm离心5min后收集细胞，加入lxSDS上样缓冲液lOOpl混匀， 于沸水中煮20min后，进行SDS-PAGE电泳并转印到硝酸纤维素膜，5% 鱼皮蛋白(PBST配制)封闭过夜，以PBST 1:100稀释鸡Mx蛋白小鼠多 抗为一抗，PBST 1:5,000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG为二抗， DAB显色3 5分钟后加去离子水终止。
1.9抗病毒活性研究
CEFs细胞于96孔板生长至90%密度时，弃去培养液，加入10倍梯 度稀释的重组ChlFN-pcHo40(^1， 37。C及5XC02孵育24小时后，弃去培 养液，以含2XFBS的DMEM稀释病毒，每孔分别加入1000 TCID5()( 100|il) 的SW101和SW103(于生物安全P3级实验室操作)，继续于37t:及5%C02 培养，设未用IFN处理而加入同样病毒的病毒对照孔(virus control, VC) 和未加干扰素和病毒的空白对照孔(blank control, BC)，至VC孔的CPE 为90% 100%左右时，观查干扰素处理孔干扰素对NDV和AIV复制的 抑制情况。以上实验组、对照组各设3个平行。2结果
2.1 ChIFN-p稳定表达质粒的构建
以ChIFN-卩的ORF特异引物进行RT—PCR，从CEFs扩增出612bp 的产物，与预期结果相符，经测序鉴定证实获得了CMFN-(3完整基因。再 将ChIFN-卩完整ORF克隆至高效真核表达质粒pCAGGS中，构建成 pCA-ChIFN-卩。以pCA-ChIFN-卩或pCAGGS转染BHK-21细胞，于转染 后4h后换液，再48小时收获细胞培养上清，分别命名为ChlFN-(3pCA和 mockpCA，其抗病毒活性采用VSV*GFP于CEFs细胞进行抗病毒活性滴定。 结果，细胞转染收获上清ChIFN-PpCA的抗病毒活性约为10445 (2.8X 104) AU/ml， mockpCA的10倍稀释度未检测到抗病毒活性；VSV*GFP系统对 ChlFN-(3检测下限分别为105 (0.28AU/ml)稀释倍数。
从质粒pMD18-ChlFN-卩以I/Wa I双酶切下ChIFN-卩的ORF片断， 亚克隆至同样Sfl/ IAYZ^ I双酶切的质粒pCN，获得稳定真核表达质粒 pCN-ChIFN-P，其中ChIFN-(3在CMV启动子的控制下表达。
2.2稳定表达重组ChIFN-卩的CHO-K1细胞克隆的筛选
为了确定筛选培养基中合适的G418浓度，于24孔板中每接种1000 个CHO细胞，G418浓度在700 800|ig/ml之间时，细胞于10 — 14天全 部死亡。因此选择800吗/ml作为今后实验中CHO细胞的压力筛选培养基 的G418浓度。
转染pCN-ChIFN-(3至CHO-K1细胞后，只有稳定整合的基因才能稳定 转录，用含有800吗/mlG418的压力筛选培养基筛选具有新霉素抗性的细 胞集落并扩大培养，通过检测各细胞克隆培养上清的抗病毒活性，筛选出 表达量最高的克隆。此后再进行一次单细胞克隆筛选，最后获得单纯、稳 定表达的细胞克隆，液氮存种，命名为CHO-ChIFN-p。此后CHO-ChIFN-p 细胞以含有400吗/ml G418的压力筛选培养基进行传代。将该 CHO-ChIFN-P于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2414。
2.3重组ChIFN-p在CHO-ChIFN-P细胞中的表达
CHO-ChIFN-卩(CGMCC No. 2414)细胞于含有10%FBS的DMEM培养 基中培养，按l:7传代至25cn^底面积的细胞培养瓶(每瓶加培养液5ml， 长满后约5><106个细胞)，待细胞长满后，用3ml PBS洗细胞2次，换新 鲜培养液，然后分别于24、 48和72小时取样，每次取10(Hi1。所取含有 重组ChIFN-p的细胞培养上清命名为ChIFN-(3CH0，阴性CHO-K1细胞培 养上清命名为mockcHo，每次取的样品冻存于-7(TC备用。所有样品以 VSV*GFP在CEFs细胞上于同一批次进行抗病毒活性滴定，结果如图1 所示，最高的累积表达量可达6.9xl04AU/ml， 24 48 h的表达量可达 4.3x104 AU/ml，此时每个细胞每天能够表达约0.043 AU的重组ChlFN-[3， 此后培养液中的重组ChIFN-P —直维持在约6.5xl04 AU/ml左右，不再增 加。
2.4 CHO-ChlFN-(5细胞表达水平与传代次数的关系
CHO-ChIFN-P细胞分别在含有G418 (400昭/ml)的筛选培养基和不含 有G418的培养基培养传代，于25 cn^的细胞瓶中、37'C及5XC02条件 下培养，每3天到4天传一代，基本每周传代2次。分别于第0、 5、 10、 15和20代取样，每种培养条件下的细胞做3个重复。取样前，上述两种 培养条件下的CHO-ChlFN-(3细胞以相同细胞密度接种，待细胞形成汇合 单层时，再继续培养24小时取样，样品保存于-70'C，最后于同一批次进 行抗病毒活性滴定。结果表明(图2)， CHO-ChlFN-P细胞的重组ChlFN-(3 表达量水平非常稳定，无论是否有G418压力存在，可稳定表达至少20代。
2.5重组ChIFN-p的生物学活性研究
把68961 AU/ml的ChIFN-(3CH0 (以VSV*GFP于CEFs细胞上滴定其 抗病毒活性，图4)进行10倍梯度稀释(即6.9xl0—2、 6.9xl0—1、 6.9、 6.9xl01、 6.9xl()2和6.9x103 AU/ml)，分别刺激CEFs细胞24小时，收获CEFs细胞。然后以鸡MX蛋白小鼠多抗(制备参见"材料与方法"部分)为一抗，羊 抗鼠IgG为二抗进行免疫印迹检测鸡MX蛋白的表达，结果如图3所示
CMFN-(3CH0能够诱导出可检测到的Mx蛋白(分子量约78kDa)下限为6.9 AU/ml，且在6.9 6.9xl03AU/ml范围内，诱导出的Mx蛋白量和 ChIFN長Ho活性单位成正相关，显示了 ChIFN-卩cHo具有良好的I型干扰
素生物学活性。
抗病毒活性滴定结果(图4)和Mx蛋白的诱导结果(图3)两者相符 合，表明CHO-ChIFN-卩细胞表达的重组ChIFN-p具备天然I型干扰素的 生物学功能。
2.6 CHO-ChIFN-p细胞表达的重组ChIFN-p体外抗病毒活性研究
为了研究ChIFN-pcHo的体外抗病毒的能力，以10倍梯度稀释的 ChIFN-PcHo (68961 AU/ml)处理CEFs细胞24小时，然后分别感染1000 TCIDso禽流感SW101毒株(强毒，鸡致死)和禽流感SW103毒株(弱毒， 鸡不致死)。对于禽流感两株毒，接毒后48小时检测HA。结果(图5) 表明1()3稀释倍数(6.9xl01 AU/ml)能够完全抑制1000TCID50的SW101 和SW103毒株感染CEFs细胞。对于两种毒来说，并且即使再培养几天， 相应的完全抑制孔也无HA效价(数据未显示)，说明ChlFN-(3cHo能够给 予CEFs细胞充分的保护，以抵御1000 TCIDso禽流感强毒和弱毒病毒的感 染。
3讨论
本实验建立的CHO-ChIFN-卩细胞能够稳定高水平表达重组ChIFN-卩， 累积表达的最大水平可达约6.9xl04 AU/ml，每天表达水平可达约 4.3><104AU/ml，平均每个细胞每天能够表达约0.043 AU的重组ChIFN-(3。 表达重组BoIFN-(3的CHO-BoIFN-(3细胞是在G418的压力筛选下筛出的， 但是经过细胞单克隆筛选出的克隆，无论在有无G418的培养液中传20代， 表达能力基本不变，表明ChIFN-p的表达框架己稳定整合至CHO-K1细胞的基因组中。
CHO-ChIFN-卩细胞表达的重组ChIFN-卩处理原代鸡胚成纤维细胞细 胞后，以鸡Mx蛋白鼠多抗为一抗进行免疫印迹，检测出鸡Mx蛋白被诱 导表达，且与重组ChIFN-卩的抗病毒活性成正相关。这些都表明了 CHO-ChlFN-(3细胞表达的重组ChIFN-卩具有I型干扰素的生物功能，具有 良好的天然鸡IFN-P生物学活性。
哺乳动物细胞表达的IFN-(3的糖基化和折叠与天然的完全相同，且正 确的糖基化对于IFN-(3的活性和稳定性至关重要。本研究CHO-K1细胞稳 定表达的重组ChIFN-P具有良好的热及振荡等稳定性(数据未显示)，且 具有极高的比活性，既使上清浓縮10倍也不能在SDS-PAGE胶上看到表 达的重组ChlFN-(3条带(数据未显示)即使浓縮IO倍进行免疫印迹也没 有检出上清中的重组ChlFN-)3 (数据未显示)。
此外，本研究表达的重组ChlFN-j3 (6.9xl01 AU/ml)能够完全抑制 1000TCID50 H5N1亚型禽流感毒株SW101 (强毒株，鸡致死)禾Q SW103 (弱毒株，鸡不致死)体外感染原代鸡胚成纤维细胞，表明了其具有临床 治疗应用的价值。
结论，本研究建立的CHO-ChIFN-P细胞表达的重组ChIFN-p具有天 然鸡I型IFN相同的生物学功能，表达的重组ChIFN-卩抗病毒活性可达 6.9xl04AU/ml，且具有极高的比活性和稳定性，可作为鸡IFN-P生物学活 性检测时的标准品，在病原一宿主细胞的感染一抗感染天然免疫相关基础 研究中具有重要的应用价值，同时具有良好临床应用前景。参考文献 Weber F, Kochs G， Haller O. Inverse interference: how viruses fight the interferon system [J]. Viral Immunol, 2004, 17(4):498-515 Stetson D B, Medzhitov R. Type I interferons in host defense [J]. Immunity, 2006, 25(3):373-381 Sen G C. Viruses and interferons [J]. Annu Rev Microbiol, 2001， 55:255-281 Quere P， Rivas C， Ester K, et al. Abundance of IFN-alpha and IFN-gamma mRNA in blood of resistant and susceptible chickens infected with Marek's disease virus (MDV) or vaccinated with turkey herpesvirus; and MDV inhibition of subsequent induction of IFN gene transcription [J]. Arch Virol, 2005, 150(3):507-519 Kaiser P, Underwood G， Davison F. Differential cytokine responses following Marek's disease virus infection of chickens differing in resistance to Marek's disease [J]. J Virol, 2003, 77(l):762-768 Ragland W L, Novak R, El-Attrache J， et al. Chicken anemia virus and infectious bursal disease virus interfere with transcription of chicken IFN-alpha and IFN-gamma mRNA [J]. J Interferon Cytokine Res, 2002, 22(4):437-441 Eldaghayes I, Rothwell L, Williams A, et al. Infectious bursal disease virus: strains that differ in virulence differentially modulate the innate immune response to infection in the chicken bursa [J]. Viral Immunol, 2006, 19(1):83-91 Huang Z, Krishnamurthy S, Panda A, et al. Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and ftmctions as an alpha interferon antagonist [J]. J Virol， 2003, 77(16):8676陽8685 Park M S， Shaw M L， Munoz-Jordan J， et al. Newcastle disease virus (NDV)-based assay demonstrates interferon-antagonist activity for the NDV V protein and the Nipah virus V, W， and C proteins [J]. J Virol, 2003, 77(2):1501-1511 Kochs Q Koerner I, Thiel L, et al. Properties of H7N7 influenza A virus strain SC35M lacking interferon antagonist NSl in mice and chickens [J]. J Gen Virol， 2007, 88(Pt 5): 1403-1409 Li Z, Jiang Y, Jiao P， et al. The NSl gene contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses [J]. J Virol, 2006, 80(22):11115-11123 Dauber B, Heins G， Wolff T. The influenza B virus nonstructural NSl protein is essential for efficient viral growth and antagonizes beta interferon induction [J]. J Virol, 2004， 78(4):1865-1872 Zhao L S. [Problems and strategies during interferon therapy for hepatitis B] [J]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi, 2006, 14(5):378-379[14]Vilar Gomez E, Gra Oramas B, Arus Soler E, et al. [Sequential combination therapy
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〈110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 〈120〉表达鸡P干扰素的CHO细胞系及其应用
<130> IB083069
〈160〉 2
〈170> Patentln version 3. 1
〈210> 1
〈211〉 612
〈212〉 腿
〈213〉 鸡
<400〉 1
atgactgcaaaccatcagtctccagggatgcacagcatcctactgctcttgcttctgcca60
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gctcacctcagC8LtC^C83atacttcagatccatccacaacttcctacagcac犯c犯c480
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gacacactcatacaatggatgaaaagtcgagctcctctcacagcctcatccaaacgtctc600
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〈210> 2 〈211〉 203 〈212> PRT <213〉 鸡 〈400〉 2
Met Thr Ala Asn His Gin Ser Pro Gly Met His Ser lie Leu Leu Leu1 5 Leu Leu Leu Pro Ala Leu Thr Thr 20
Ala Asn
10
Phe Ser Cys Asn
Thr 25
Lys Ser Leu Gin
15
His Gin Asp Ala Asn Phe Ser Trp 35 40 Thr Ala Pro Pro Pro Pro Gin Pro Cys Pro Gin
50 55 Pro Phe Pro Glu Thr Leu Leu Lys Ser Lys 65 70 lie Thr Thr Leu Arg lie Leu Gin
Gin 60
Lys Lys Gin Ala
Thr Leu Arg 85
Pro His Thr Pro Lys His Trp lie 100
Gin His
His
Asp 75
Phe Asn Met Leu
Leu 90
Arg Thr Arg His
Asn Gin lie 115
Thr Arg Ser
Asp 105
His Leu Glu Gin
Ser 95 Leu
Tyr lie His 120
Gin Gly Thr Arg Ser Gin Arg Arg Gly Pro Arg
130 135 lie Asn Lys Tyr Phe Arg Ser lie His Asn 145 150 Tyr Ser Ala Cys Thr Trp Asp His
Ala Cys Thr 165
Phe Arg His Val Asp Thr Leu lie 180
Leu Thr Ala Ser Ser Lys Arg Leu 195 200
Val
Asn 140
Leu Gin His Asn
Phe 155
Leu Gin Ala Arg
Arg 170
Trp Met Lys Ser
Gin 185
Asn Thr Gin
Arg 190
Asp 175 Ala
Arg
His 30
Leu Gin Asn
Leu 45
Asp Val Thr Phe
Ala
80
Ser
Leu
Ser 110
Phe Val Asn
Cys 125
Ala His Leu Ser
Asn 160 Cys
Pro
权利要求
1.一种表达鸡β干扰素的CHO细胞系，其含有编码鸡β干扰素的基因。
2. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述鸡p干扰素的氨基 酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其中所述编码鸡P干扰素的 基因如SEQ ID NO: l所示。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的CHO细胞系，其中在所述编码鸡卩 干扰素的基因之前加入了 Kozak序列。
5. 根据权利要求1所述的CHO细胞系，其是保藏号为CGMCC No. 2414的CHO细胞系。
6. —种生产鸡(3干扰素标准品的方法，该方法包括1) 培养根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系；2) 从所述的CHO细胞系的培养液中提取(3干扰素，用作鸡(3干扰素 的标准品。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述CHO细胞系是保藏号为CGMCC No. 2414的CHO细胞系。
8. 根据权利要求6或7的方法生产的鸡p干扰素标准品。
9. 一种用于鸡卩干扰素定量的试剂盒，其包含根据权利要求6或7的 方法生产的鸡p干扰素标准品。
10. 根据权利要求1至5中任何一项所述的CHO细胞系生产的鸡卩 干扰素在制备药物中的应用，所述药物用于鸡传染性疾病的预防和治疗。
全文摘要
本发明公开了表达脊椎动物β干扰素的CHO细胞系，其含有编码所述动物β干扰素的基因。更具体地，本发明公开了表达鸡β干扰素的CHO细胞系。本发明还涉及利用上述CHO细胞系生产脊椎动物β干扰素标准品的方法以及通过该方法获得的鸡β干扰素，其具有极高的比活性和稳定性，可用作鸡β干扰素生物学活性检测时的标准品和用于鸡传染性疾病的预防和治疗，具有重要的应用前景和市场前景。
文档编号C12N15/22GK101603034SQ200810109950
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月11日 优先权日2008年6月11日
发明者步志高, 陈伟业 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所