检测i型干扰素生物学活性的细胞系及其应用的制作方法

专利名称：检测i型干扰素生物学活性的细胞系及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测动物I型干扰素的生物学活性的方法。更具体地，本发明涉 及一种基于鸡Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测动物的I型干扰素生物学活性 的方法。
背景技术：
干扰素(interferon, IFN)是重要的抗病毒活性物质，是机体非特异免疫系统的 重要组成部分，在动物和人类抗感染和肿瘤临床治疗上有着广泛的应用。但长期以来， 一直缺乏理想的IFN活性标准定量检测方法。传统的IFN活性定量手段主要包括1、 抗病毒活性检测法(antiviral assays, AVA),常用病毒为水疱性口炎病毒(Vesticular stomatitis virus ， VSV)禾卩月囟心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV[']。 AVA 有其局限性，敏感性和准确性低，并具有一定生物安全危险性，因此研究者不断探索 新的方法来替代AVA。 2、 ELISA"'a方法，检测IFN的活性尽管方便快捷，但只能检 测IFN的抗原性， 一些无生物学活性的类IFN蛋白会影响检测结果，所以并不可靠， 而且不同种的IFN需要不同的单抗，因此也影响其通用性。3、依据IFN具有的细胞 增殖抑制、细胞活性功能调节、细胞分化和免疫调节等特性建立的其它生物学方法， 均具有不同程度的局限性，或方法比较繁琐，或适用范围较窄。探索一种适用范围广 且准确敏感的方法对IFN的基础和应用研究具有重要现实意义[3—8]。
在哺乳动物、禽类和鱼类中，I型IFN发挥其抗病毒生物学功能的途径之一是经 由JAK-STAT信号转导途径激活Mx启动子(Mx promoter, Mxp)，表达的Mx蛋白(Mx protein)能够抑制负链RNA病毒复制[6'9—Mxp有较好的专一性，它不能被白细胞 介素(Interleukin)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)等其它细胞因子启 动[12'13]。
在已有的报告基因系统中，荧光素酶(luciferase， Luc)检测系统比氯霉素乙酰转 移酶(CAT)、 P—半乳糖苷酶(LacZ)等其它报告基因检测系统系统更具快捷敏感的 显著优势。采用Luc系统检测96个样品只需要几分钟即可完成，便于大通量检测；荧光素酶的检测量能低至10—2()niol，比CAT灵敏100倍，具有极高的敏感性，却安全无 放射性；检测线性范围宽，0.0002 — 200pg，可检测最小稀释度的样品。Luc报告基因 检测系统在受体活性、细胞内信号传导、mRNA加工、蛋白质折叠及蛋白-蛋白相互 作用等研究中广泛应用[14]。
本文构建了基于鸡Mxp和luc报告基因的IFN质粒检测系统，就其应用于检测禽 类如鸡、或哺乳动物如猪或牛的I型干扰素生物活性的敏感性与传统抗病毒活性检测 方法进行了比较研究。

发明内容
本发明的目的是提供一种基于Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测动物的I 型干扰素生物学活性的方法。
具体地，本发明涉及如下各项
1. 一种检测动物I型干扰素的生物学活性的方法，该方法包括以下步骤
1) 构建表达荧光素酶的重组质粒，该质粒包含Mx启动子和与该启动子可操作地 连接的编码荧光素酶的基因；
2) 将步骤l)中构建的重组质粒转染所述动物细胞；
3) 用待测的动物I型干扰素样品处理在步骤2)中获得的转染细胞，比较在处理 前后所述细胞的荧光素酶基因的表达水平。
2. 根据以上1所述的方法，其中所述Mx启动子是鸡Mx启动子。
3. 根据以上1或2所述的方法，其中所述动物是禽类如鸡、或哺乳动物如猪或牛。
4. 根据以上1或2所述的方法，其中所述I型干扰素是a或(3干扰素。
5. 根据以上1或2所述的方法，其中在步骤1 )中的鸡Mx启动子的序列如SEQ ID NO: 1所示。
6. 根据以上5所述的方法，其中在步骤l)中的重组质粒为pMxp-luc，其核苷酸 序列如SEQIDN0:2所示。
7. 根据以上1或2所述的方法，其中在步骤2)中的所述转染是稳定转染或瞬时 转染。
8. 根据以上1或2所述的方法，其中在步骤3)中的动物I型干扰素样品是重组 表达所述动物I型干扰素的细胞系的培养上清液或相应I型干扰素重组质粒转染哺乳 动物细胞的培养上清液。9. 根据以上8的方法，其中所述细胞系是BHK-21细胞或CHO细胞。
10. 根据以上1或2所述的方法，其中在步骤2)中获得的动物细胞是 MDBK-Mxp-Luc细胞系，其保藏编号为CGMCC 2416。
与所有已报道的基于Mx启动子一报告基因检测方法中相比，该检测方法所需时 间最短，可大幅度节约检测时间；与传统抗病毒定量检测方法相比，本发明的检测方 法具有快速简便、准确敏感、便于高通量检测等显著优势，在禽类乃至哺乳动物干扰 素生物学基础和应用研究及产业化过程中具有重要应用价值。
发明详述
干扰素是一种重要的抗病毒物质，对其生物学活性的定量检测具有重要的基础研 究和生产应用意义。Mx启动子是干扰素主要效应转录启动子之一，受I型IFN作用表 达Mx蛋白。
在一个实施方案中，本发明克隆了鸡Mx启动子(Mxp)，其序列与已报道的都不 同，有6个碱基的差异。在其下游连接荧光素酶(luciferase,luc)报告基因，构建成鸡 I型干扰素活性检测质粒pMxp-Iuc。以pMxp-luc瞬时转染DF-1鸡胚成纤维细胞系， 24小时后用鸡IFN-ot/p处理细胞，结果萤光素酶基因在Mx启动子作用下获得转录表 达；萤光素酶的表达量与干扰素的抗病毒活性有着良好的线性相关性，并在干扰素处 理细胞6个小时后就可以检测；对鸡IFN-ot和IFN-P检测的敏感性是分别是抗病毒活 性定量检测方法的10和100倍；检测的线性范围约为0.3 30AU/ml。
在另一个实施方案中，本发明克隆了鸡Mx启动子(Mxp)，在其下游连上了萤光 素酶(luciferase， Luc)报告基因。稳定转染pMxp-Luc至MDBK细胞中，筛选出同 时可用于检测牛、猪等动物的I型干扰素生物学活性的细胞克隆MDBK-Mxp-Luc。 MDBK-Mxp-Luc对不同来源(转染、CHO)的牛、猪IFN-a/卩检测范围约为0.5-100 AU/ml;并且重复性良好，批次内、批次间的变异系数分别不大于5.6%和9.2%，与已 报道的重复性最高报告基因检测方法相近;IFN处理后5 6 h萤光素酶表达水平最高， 12h降到l/5;整个检测过程可在14h内完成，是所有检测方法中最快的；操作安全， 整个过程没有用到病毒；检测简单准确，适用于高通量检测。MDBK-Mxp-Luc细胞还 可以作为研究病毒感染与牛I型IFN系统相互作用的分子机制的有力工具。
5附图简述


图1.鸡Mxp PCR和ChIFN-a和ChIFN-(3的ORF RT-PCR产物电泳图 M, DL2000标记(marker); 1,鸡Mxp; 2,鸡IFN-a; 3,鸡IFN-(3; 图2.使用VSV*GFP的pCA-ChIFN-a, pCA-ChIFN-p和pCAGGS转染上清的抗 病毒活性检测。表达pCA-ChIFN-a, pCA-CMFN-p和pCAGGS的转染BHK-21的上清 被分别命名为ChIFN-a,ChIFN-p和mock。病毒对照(VC)是不含IFN样品、但是也 加入VSV*GFP的孔。ChlFN-a和ChIFN-卩的抗病毒活性分别约为1025()禾卩104'45 AU/ml， 在pCAGGS的10倍稀释上清中未检测到抗病毒活性。* ()中的数字是IFN样品的稀 释倍数；
图3. Mxp启动萤光素酶转录表达质粒pMxp-luc的构建； 图4.以Mxp和萤光素酶报告基因系统检测鸡IFN-a/(3的生物学活性； 空白-对照(BC):不含IFN但是以同样方式转染。(A)所有样品稀释IOO倍；(B)所 有样品作IO倍系列稀释；
图5.牛、猪IFN-a/p的抗病毒活性滴定。病毒对照(VC)是不含IFN样品、但 是也加入VSV*GFP的孔。* ()中的数字是IFN样品的稀释倍数；
图6.瞬时转染验证IFN对Mxp的激活反应。基于瞬时转染验证IFN对Mxp的激 活反应。MDBK细胞于24孔细胞培养板中过夜生长至密度为70%，参照说明书以 Fugene6进行pMxp-Luc和pRL-tk共转染。转染后24小时，细胞用100倍稀释的BoIFN-p (A)禾口PoIFN-卩(B)处理，于37°(:及5% C02中培养6小时。然后，两种质粒表达的荧 光素酶用双荧光素酶检测系统(Dual-Luciferase assay system)检测。其中，pRL-tk表 达的海肾荧光素酶作为转染效率的内参。
图7. IFN处理MDBK-Mxp-Luc细胞后萤光素酶表达量的时间曲线。 MDBK-Mxp-Luc细胞在24孔板中过夜生长至单层汇合后，分别用100倍稀释的 BoIFN-a (A)、 BoIFN-pCHO (B)、 PoIFN-a (C)禾卩PoIFN-pCHO (D)处理，于37。C及5% C02 中培养，分别于2、 4、 5、 6、 8、 10和12小时用高亮荧光素酶检测系统(Bright-Glo Luciferase Assay System)检测荧光素酶的表达。设不加干扰素的空白对照孔(blank control, BC)。
图8. MDBK-Mxp-Luc检测猪、牛IFN-a禾Q IFN-(3的生物学活性。基于 MDBK-Mxp-Luc细胞分析BoIFN-a (A)、BoIFN-|3CHO (B)、PoIFN-a (C)和PoIFN-pCHO (D) 的生物学活性。MDBK-Mxp-Luc细胞在24孔板中过夜生长至单层汇合后，用10倍梯度稀释的干扰素样品处理，于37'C及5M C02中培养5小时后，用高亮荧光素酶检测 系统(Bright-Glo Luciferase Assay System)检测荧光素酶的表达。设不加干扰素的空 白对照孔(blank control, BC)。图中曲线旁的数字表示此稀释度干扰素的抗病毒活性 单位(AU/ml)。
具体实施例方式
下文将参考实施例和附图详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明， 而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例1.基于Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测鸡I型干扰素生物学活性的研 究
1材料与方法
1.1质粒、细胞株和病毒毒株
鸡胚成纤维传代细胞系(DF-1) (ATCC No. CRL-12203)为本实验室保存，含有 荧光素酶基因的质粒pGL3-Basic购自Promega公司。
稳定真核表达载体pCI-neo (pCN)购自Promega公司，neo在SV40早期启动子 的控制下表达。CHO-K1细胞株商购自ATCC (ATCC No. CCL-61)， CHO-K1细胞于 含10%FBS的DMEM-Ham，sF12 (DF12)培养基(invitrogen)中培养。
pMD8-T载体购自TaKaRa公司；克隆质粒pBluescript II KS(+)购自invitrogen公
司；原核表达质粒pET-32a(+) (Novagen公司)、传代牛肾细胞系(MDBK) (ATCC No.
CCL-22)和BHK-21细胞(ATCC No. CCL-10)均由本实验室保存；原代鸡胚成纤维
细胞(Chicken embryo fibroblasts, CEFs)采用10日龄的SPF鸡胚常规方法[15]制备；
表达增强绿色荧光蛋白重组水疱性口炎病毒(VSV*GFP)商购自中国农业部哈尔冰兽
医研究所，或者可以按照参考文献[151通过反向遗传技术构建，MDBK细胞系滴定PFU
(plaque forming unit)后一70'C保存;新城疫LaSota株病毒(CCVC NO. AV1615)商
购自中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统(CCCCM)下属的兽医微生物菌种保藏
管理中心(CVCC，北京)，由本实验室保存，CEFs滴定PFU后一7(TC保存备用。 1.2试剂与仪器
双萤光素酶检测试剂(Dual-Luciferase assay system, Promega)购自Promega公司。 T4 DNA聚合酶购自MBI公司。Ni-NTA琼脂糖亲和树脂、硝酸纤维素膜购自Pierce 公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、鱼皮蛋白购自Sigma公司；高亮萤光素酶 检测试剂(Bright-Glo Luciferase assay system)购自Promega公司；各种限制性内切酶和Ex-Taq酶都购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自MBI公司；质粒中量提取试剂 盒购自Qiagen公司；转染试剂Fugene6购自Roche公司；96孔白色板(96 well white plate)购自Corning公司；荧光倒置显微镜为LEICA公司产品；Microplate Fluorescence Reader (FLx800)为Bio-Tek公司产品，可检测发光和荧光；CEQ8000自动测序仪为 Beckman公司产品。Grace's培养基、DMEM培养基、Trizol和M-MLV反转录试剂盒 购于Iiwi加gen公司。荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉生物技术公司。 DAB显色试剂盒购自博士德公司。
1.3 Mxp基因克隆及其启动hie报告基因转录表达质粒的构建
根据GenBank鸡Mxp序列(GenBank Accession No. Z23167),设计引物，上游弓l 物为5'-ccc gaattc teg gtg tea cat ccacac ggt，引入了 ￡coiH酶切位点；下游引物为 5'-ccc etc gag ctg cca gag tea cac age aag，弓|入為I酶切位点。常规方法提取CEFs基 因组，采用Ex-Taq酶进行PCR， PCR产物胶回收后￡coi I和I双酶切克隆到￡coi I禾口屈o I双酶切的pBluescript II KS(+)中得到pBlue-Mxp， CEQ8000自动测序仪测序。 pIRES2-eGFP (购自Clontech)以I单酶切后，用T4 DNA聚合酶平端化，再以 屈o I酶切，切掉CMV启动子，胶回收载体片段；pBlue-Mxp以Sma I和I双酶切 下的Mxp片段，与如前述处理的pIRES2-eGFP载体片段连接，以Mxp替换 pIRES2-eGFP载体的CMV启动子，获得质粒pMxp-IRES-eGFP， pGL3-Basic以I 和Z&a I双酶切下Luc，克隆至同样I禾卩I双酶切的pMxp-IRES-eGFP,构建成 luc报告基因转录质粒pMxp-luc(质粒pMxp-luc的DNA全序列如SEQ ID NO: 2所示)。
pMxp-luc采用中量制备试剂盒制备用于转染。
1.4 IFN表达质粒的构建
从GenBank获取鸡IFN-ot (ChIFN-a)或IFN-p (ChIFN-P)的ORF序列(ChIFN-a GenBank Accession No. U07868; ChIFN-(3 GenBank Accession No. AY974089),设计引 物。ChIFN-a的上游引物为5'-TGCCACCATGGCTGTGCCTGC AAG-3';下游引 物为5'-TGGGAGGTGCGTTTGGGGCTAAGT陽3'。 ChlFN-J3的上游引物为5'-TGC CAC CAT GAC TGC AAA CCA TCA G-3，；下游引物为5'陽ACT CAC TGG GTG TTG AGACGTT-3'。两种上游引物均在起始密码子ATG前加入了利于表达的Kozak序歹廿。
CEFs待生长至100%左右时,按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1.0 接种新城疫LaSota株病毒。感染后8个小时收细胞，用Trizol(invitrogen)提取总RNA， 进行RT-PCR。扩增的ChlFN-a/卩PCR产物克隆到pMD18-T载体，获得质粒 pMD18-CMFN-a和pMD18-CWFN-卩，并测序鉴定。
把pMD18-ChIFN-a和pMD18-ChlFN-p分别以5*a/ IAY&a I和1双酶切下
ChIFN-a和ChIFN-卩的ORF片断分别亚克隆至以lo I/A/7ze I和￡coi I/^o I双酶切的
质粒pCAGGS[16，17]，获得真核表达质粒pCA-ChIFN-a和pCA-ChIFN-卩。 1.5瞬时转染
8分别以pCA-ChIFN-a、 pCA-ChlFN-(3和pCAGGS，按照Fugene 6按操作说明书转
染至BHK-21细胞，于转染后48小时收获细胞培养上清，分别命名为ChlFN-a、ChlFN-P
和mock，分装并于一7(TC保存备用。 1.6抗病毒活性滴定
IFN抗病毒活性定量检测的操作步骤见参考文献[15]，具体如下DF-1细胞于％ 孔细胞板中生长至密度为90%，弃上清，每孔加IO倍梯度稀释IFN样品10(^1，每个 稀释倍数设3个平行对照孔，37。C及5XC02培养条件下处理24h后，弃上清，用含 2%FBS的DMEM稀释VSV+GFP，按每孔300 PFU (100^1)加入病毒稀释液，同时 设未经转染上清处理，只加病毒液的病毒对照(Virus Control, VC) L。不加干扰素 和病毒的孔，作为空白孔(Blank Control ， BC)。接毒后至VC孔的CPE( cytopathic effect) 约为100%时，荧光倒置显微镜下观察GFP表达及病毒感染复制情况。最后所有孔每 孔加入50|il细胞裂解液(cell lysis buffer, CLB)
，于摇床上裂解15min释放细胞内的GFP，用Microplate Fluorescence Reader(敏 感性设置为70，激发光485 nm，吸收光528 nm)检测每孔绿色荧光蛋白的相对表达 水平。判定以BC孔校0，以VC孔为参照，每mL中，以表达绿色荧光数减少为 VC孔50X的平均最高稀释度为一个抗病毒活性抑制单位(Antiviral Unit, AU)，计算 具体如下。
基于VSV*GFP检测方法是计算半数病毒复制抑制的稀释倍数，方法如下若绿
色荧光蛋白相对荧光值(Relative Fluorescence Units, RFU)用F表示，以BC孔校0，
则50%病毒复制抑制的荧光值(F50) 二F (VC) /2，按下面公式计算IFN的抗病毒活
性单位logu)[每mL中IFN抗病毒活性单位(AU) ]-[F50—F(小于F50孔)]/[F(高于
F50孔)一F(小于F50孔)]+logK)[小于F50孔的稀释倍数]。 1.7萤光素酶活性检测
DF-1细胞于24孔细胞培养板培养过夜至密度约为60% ，用Fugene 6共转染转染
pMxp-luc和pRL-TK (商购自Promega公司)，二者的比例为l吗l吗，其中pRL-TK
质粒表达海肾萤光素酶，作为转染效率的内参。转染后24小时用IO倍梯度稀释的上
述转染细胞上清ChIFN-a、 ChIFN-p和mock处理DF-1，每稀释梯度设3个平行孔，
同时设未经转染上清处理但同样转染的空白对照(Blank Control, BC)。 6小时后参照
双萤光素酶检测试剂说明书检测DF-1内两种萤光素酶的表达水平。
2结果
2.1 ChlFN-a/p的克隆及其表达产物抗病毒活性检测
以CWFN-a和ChIFN-p的ORF特异引物进行RT—PCR，分别从CEFs扩增出588bp 和612bp的产物(图1的B和C)与预期结果相符，经测序鉴定证实获得了 ChIFN-a 和ChIFN-(3完整基因。再分别将ChIFN-cx和ChIFN-卩完整ORF克隆至高效真核表达质粒pCAGGS"6"]中，构建成pCA-CMFN-a、 pCA-ChIFN-(3。分别以pCA-ChIFN-a、 pCA-ChIFN-(3或pCAGGS转染BHK-21细胞，于转染后4 h后换液，再48小时收获 细胞培养上清，分别命名为ChIFN-a、 ChIFN-p和mock，其抗病毒活性采用VSV*GFP 于DF-1细胞进行抗病毒活性滴定(图2)。结果，细胞转染收获上清ChIFN-a和CWFN-f3 的抗病毒活性分别约为1025Q (316)、 104'45 ( 2.8X 104) AU/ml， mock的10倍稀释度 未检测到抗病毒活性；VSV+GFP系统对CMFN-a和ChIFN-p检测下限分别为103(0.32 AU/ml)禾D 105 (0.28AU/ml)稀释倍数。
2.2 Mxp启动luc转录表达质粒pMxp-luc的构建及其对ChlFN-a/p刺激的激活反应
从CEFs基因组扩增的鸡Mxp启动子PCR产物片段约470bp (图1的A)，与预期 结果相符，序列测定结果与已报导的序列[13]有6个碱基的差异，但其中IFN应答的关 键基因序列(ISRE)为5'-AGT TTC GTT TCT，完全一致。进一步先以Mxp替换 pIRES2-eGFP的CMV启动子，再用萤光素酶报告基因替换IRES-eGFP，构建成 pMxp-luc，使萤光素酶在Mxp的控制下表达(图3)。
pMxp-luc转染CEFs细胞中，经ChIFN-a和ChIFN-p处理后，Mxp被有效激活， luc获得表达(图4的A); ChIFN-a检测下限为104倍(3.6X l(T2 AU/ml)稀释，CMFN-p 的检测下限高达107倍(2.8X10—3 AU/ml)稀释度，分别是上述VSV*GFP检测下限的 10倍和100倍，检测的敏感性与抗病毒定量检测相比显著提高(图4的B)。从图7 (B)还可以估计ChIFN-a的检测线性范围为0.32 30 AU/ml， ChIFN-(3检测的线性范 围约为0.28 28 AU/ml。
3讨论和结论
IFN-a/卩主要作用于I型IFN受体，激活JAK1和TYK2,促使STAT蛋白的酪氨 酸磷酸化，并形成STAT1-STAT2-IRF9复合物，即IFN刺激基因因子3 (IFN-stimulated gene factor 3， ISGF3)， ISGF3转运到核内结合到ISRE，转录表达各种抗病毒蛋白[18]。 因此ISRE是I型IFN发挥生物学功能的关键。本研究中CMFN-a和ChlFN-(3作用于 pMxp-luc的ISRE转录表达萤光素酶，萤光素酶的表达量与IFN的抗病毒活性成良好 的线性相关。
病毒复制抑制试验是目前检测干扰素的生物学活性的传统方法。传统方法抗病毒 活性的判定标准主要有三种方法，病毒复制抑制(Virus yield-Reduction Assay, VYRA)、 噬斑减少分析(Plaque Reduction Assay, PRA)、细胞病变抑制(Cytopathic Effect Reduction Assay, CPERA)等方法。但三种方法都存在误差较大、重复性差、精确度 低和、耗时长和安全性差等缺点[5'19]。
本研究建立的Mxp-luc检测系统显示出诸多方面的优越性点，整个过程完全避免 VSV等活病毒的使用，没有生物安全的顾虑；检测程序简化，时间大大縮短，在IFN处理细胞后约6个小时即可完成检测，因此检测速度快；萤光素酶的表达可以通过仪 器检测精确量化，不仅提高了 IFN定量的准确性，而且便于大量样品的高通量操作；
比ELISA方法相比，Mxp-luc系统检测的是IFN的激活M邻的能力，不存在假阳性； 本实验中Mxp-luc检测ChIFN-a和ChIFN-p的敏感性分别为VSV*GFP检测敏感性的 10倍和100倍，显示了其在检测敏感性上的优越性；Mxp-luc检测系统具有IFN刺激 反应专一性，其它细胞因子如白细胞介素(interleukin)，肿瘤坏死因子(Tumor necrosisfactor )、 白细胞一巨嗜细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)等均对其不产生干扰[1|'12]。
由于本研究是基于转染的方法，因此步骤繁琐，背景也较高，但是如果把Mxp-luc 框架稳定转染至细胞中，建立稳定检测细胞系，那么将显著减少操作步骤，从准备细 胞到完成检测只需要15小时左右，相比较于抗病毒检测的40-48小时，大大节约了检 测时间；同时检测结果会更稳定可靠。
结论，本研究克隆了鸡Mxp启动子，建立了基于Mxp启动荧光素酶基因转录表 达质粒pMxp-luc的IFN生物活性检测系统，用于检测包括鸡在内的动物的I型干扰素 的生物学活性。
实施例2.报告基因分析定量检测猪、牛I型扰素生物学活性 1材料与方法
1.1质粒、细胞株和毒株
同实施例1 1.2试剂与仪器
同实施例1
1.3猪和牛IFN-a/p的基因克隆及真核表达质粒的构建
从GenBank获取猪和牛IFN-a的序列(猪IFN-a的Genbank Accession No. X57194; 牛IFN-a的Genbank Accession No. Z46508),设计引物。BoIFN-a (牛IFN-a)的上游引 物为5'-GGCCACCATGGCCCCAGCCTGGTCC;下游引物为5'-CCAGGTGTG TGG TCA GTC CTT TC。PoIFN-a (猪IFN-a)的上游引物为5'-CTG AAT TCG CCA CCA TGGCCCCAACCTC，引入五coi I酶切位点；下游引物为5'-GGC TCG AGT CAC TCCTTCTTCCTG，引入J^oI酶切位点。上游引物中都在起始密码子ATG前引入了 利于真核表达的Kozak序列。
PK15 (ATCC No. CCL-33)和MDBK细胞密度为90%左右时，按MOI为1.0接 种新城疫LaSota株病毒(CCVCNO.AV1615),感染后8个小时，收细胞并提取总RNA 做RT-PCR扩增BoIFN-a和PoIFN-a ORF基因。PCR产物克隆到pMD18-T载体获得 质粒pMD18-BoIFN-a和pMD18-PoIFN-a，并测序鉴定后，用双酶(对应于各个引物设计的酶切位点)切下IFN-a片断，并克隆到同样双酶切割的质粒pCAGGS上，分别 获得真核表达质粒pCA-BoIFN-a和pCA-PoIFN-a。
从GenBank获取BoIFN-p (牛IFN-(3)的0RF序歹ll(GenBank Accession No. E00139), 设计引物。上游引物为5，-TGCCACCATGACCTACCGGTGCCTC，下游引物为5'-ACA GGT GGG AGA TGT TCA GTC AC，上游引物在起始密码子ATG前加入了利于 真核表达的Kozak序列。
传代牛肾细胞系(MDBK) (ATCCNo.CCL-22)细胞生长至密度为90%左右时， 按感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1.0接种新城疫LaSota株病毒(CCVC NO.AV1615)。 8h后收细胞，用Trizol (Invitrogen公司)提取总RNA，进行RT-PCR。 扩增的BoIFN-|3 PCR产物克隆到pMDl8-T载体获得质粒pMDl 8-BoIFN-{3，通过测序 鉴定。
从质粒pMD18-BoIFN-p以IAY5" I双酶切下BoIFN-)3的ORF片断，克隆至以 屈o I/W/je I双酶切的质粒pCAGGS，获得瞬时真核表达质粒pCA-BoIFN-(3。
从质粒pMD8-BoIFN-|B以SaI/Xba I双酶切下BoIFN-(3的ORF片断，以T4 DNA 聚合酶平滑化末端后克隆至SmaI酶切的稳定真核表达质粒pCI-neo (在本文中也称为 pCN) (Promega公司)，获得稳定真核表达质粒pCN-BoIFN-(3。
从GenBank获取PoIFN-卩(猪IFN-卩)的ORF序歹U(Genbank Accession No. S41178), 设计引物。上游引物为5，-TGCCACCATGGCTAACAAGTGCATC,下游引物为5，-AGC CAC AGG GGG GAG ATG TTC AGT，上游引物在起始密码子ATG前加入了利于 真核表达的Kozak序列。
PK15细胞生长至密度为90%左右时，按感染复数(multiplicity of infection, MOI) 为1.0接种新城疫LaSota株病毒。8h后收细胞，用Trizol提取总RNA，以上述引物进 行RT-PCR 。扩增的PoIFN-P PCR产物亚克隆到PMDl 8-T载体获得质粒 pMD18-PoIFN-(3，测序鉴定。
从质粒pMD18-BoIFN-(3以￡coi I/Sal I双酶切下BoIFN-(3的ORF片断，分别亚克
隆至以I/iVfe I双酶切的质粒pCAGGS，或亚克隆至以T4 DNA聚合酶平滑化末端
后克隆至Sma I酶切的质粒pCN，获得瞬时真核表达质粒pCA-PoIFN-(3和稳定真核表
达质粒pCN-PoIFN-(3。 1.4重组IFN
瞬时转染
以pCA-BoIFN-a、 pCA-PoIFN-a和pCAGGS,按照Fugene 6按操作说明书转染至 BHK-21细胞，于转染后16 h换液，继续培养48h收获细胞培养上清，分别命名为 BoIFN-apcA、 PoIFN-apCA禾卩mockpCA。
稳定转染
源自CHO细胞的BoIFN-Pcho和PoIFN-Pcho的制备参照转染试剂Fugene 6操作说明书转染pCN-BoIFN-p或pCN-PoIFN-p至CHO-K1 细胞。转染后24小时，按1:8的比例进行细胞传代，用含有800fig/mlG418的压力筛 选培养液筛选培养细胞，10 14天后，用克隆环圈住具有新霉素抗性的细胞克隆集落， 胰酶消化下后依次于96孔、24孔和6孔细胞培养板扩大培养。筛选出的不同细胞克 隆按照0.5xl(^个细胞接种于6孔细胞培养板中生长至密度为100%后24小时，收取 细胞培养上清，分别如上用VSV*GFP进行抗病毒活性滴定，选择表达水平最高的克 隆按限稀释法再进行单细胞克隆，按上述步骤筛选表达量最高的克隆后，扩增并按常 规方法冻存细胞，分别命名为CHO-BoIFN-p和CHO-PoIFN-p，含有重组BoIFN-p和 重组PoIFN-P的细胞培养上清分别命名为BoIFN-I5cho和PoIFN-pCHO。本发明的阳性 CHO细胞克隆(CHO-BoIFN-卩，中国仓鼠卵巢细胞(C7z/"e;ye//a附加r CKw^ Ce〃))于 2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC， 中国，北京)，保藏号为CGMCC No. 2415 。本发明的阳性CHO细胞克隆(CHO-PoIFN-p， 中国仓鼠卵巢细胞(C/i/wwi/flwWerCKw^Ce//))于2008年3月25日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC,中国，北京)，保藏号为CGMCC No. 2412。
以上收获的重组干扰素都分装后于—70'C保存。 1.5抗病毒活性滴定
IFN抗病毒活性滴定步骤基本同实施例1，不同的地方是干扰素样品先稀释1000 倍，然后再4倍梯度稀释。 1.6 Mxp的克隆与检測质粒的构建
同实施例1。
1.7稳定转染整合Mxp-Luc的MDBK细胞系的建立
方法参考文献4],主要步骤如下:参照转染试剂Fugene 6操作说明书转染pMxp-Luc 至MDBK细胞。转染后24小时，按1:10的比例进行细胞传代，用含有600 pg/ml G418 的压力筛选培养液筛选具有新霉素抗性的细胞克隆。筛选出的细胞克隆扩增培养后， 接种到24孔板中生长至密度为100%时，用含有5%FBS的DMEM 100倍稀释的 BoIFN-卩oro处理6小时后，用高亮萤光素酶检测系统检测荧光素酶的表达，设未用IFN 处理的对照孔，选择表达水平最高的克隆再进行一次单细胞克隆筛，并按上述步骤筛 选诱导表达水平最高的克隆，扩增培养并冻存，作为检测I型干扰素的细胞系，命名 为MDBK-Mxp-Luc。本发明的阳性MDBK细胞克隆(MDBK-Mxp-Luc，马-达氏牛肾 细胞(MW/"-Da^y 6ov/"e ^frieyce〃))于2008年3月25日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2416。 1.8 Mxp-Luc分析方法
基于转染的方法参照Fugene 6按操作说明书共转染pMxp-Luc和pRL-TK至24 孔细胞板中的MDBK细胞，二者的比例为l:l，转染后24小时，加入以含有5XFBS 的DMEM100倍稀释的IFN样品，每个样品设3个平行孔，细胞于37'C及5%C02培 养6小时后参照双萤光素酶检测系统说明书检测MDBK内两种萤光素酶的表达。
基于MDBK-Mxp-Luc细胞系的方法使细胞于24孔板中过夜生长至密度约100%时，分别加入以含5XFBS的DMEM10倍梯度稀释的IFN样品40(Hi1，于37'C及5 %。02培养5小时后，参照高亮萤光素酶检测系统说明书检测细胞内萤光素酶的表达。 每个稀释度都设2个平行孔，设未用IFN处理的空白孔(Blank Control, BC)。
2结果
2.1抗病毒活性滴定
转染收获的细胞上清BoIFN-apCA、 PoIFN-apCA; CHO-BoIFN-p、 CHO-PoIFN-(3稳
定细胞系的细胞培养上清BoIFN-pcHo、 PoIFN-PcHo都先稀释1,000倍后，再4倍梯度
稀释，采用VSV+GFP于MDBK细胞进行抗病毒活性滴定。结果如图5， BoIFN-apCA、
BoIFN-Pcho、 PoIFN-apCA、禾卩PoIFN-(3CHO的抗病毒活性分别约为207,058、 102,316、
154,452、和366,745 AU/ml。
2.2 Mxp基因的克隆和检测质粒的构建
见实施例1。
2.3稳定整合Mxp-Lnc的MDBK细胞克隆的筛选和鉴定
为了获得稳定整合Mxp-Luc的MDBK细胞克隆，在600pg/ml G418的压力筛选下 共进行了两次单细胞克隆，确保整合的稳定性。同时对每次筛选出的克隆用BoIFN-PcHo 处理后，检测荧光素酶的表达，以从众多G418阳性克隆中选出一株敏感的细胞克隆， 命名为MDBK-Mxp-Luc (CGMCC No. 2416)，并用含有400吗/ml G418和5%FBS的 DMEM培养传代。
2.4 Mxp-Luc对猪、牛IFN-a/|J生物学活性的检测
为了验证Mxp是否可以被猪、牛的IFN激活，把pMxp-Luc和pRL-TK共转染至 MDBK细胞后24小时，分别加入100倍稀释的BoIFN-Pcho和PoIFN-pCHO处理细胞6 个小时，参照双萤光素酶检测系统说明书检测MDBK内两种萤光素酶的表达，其中海 参萤光素酶的表达作为转染效率的内参(图6)，结果表明Mxp能够分别被BoIFN-PcHo 和PoIFN-Paro激活，表达量是空白对照的20倍到25倍。同时虽然本实验中MDBK 的转染效率不到1% (数据未显示)，但萤光素酶的微量表达仍然能够被检测到，显示 了其极高的敏感性。
为了确定干扰素处理MDBK-Mxp-Luc细胞的时间，分别于加入100倍稀释的 BoIFN-apCA、 BoIFN-Pcho、 PoIFN-apCA和PoIFN-pcH。样品后的2、 4、 5、 6、 8、 10和 12小时检测IFN刺激Mxp表达的萤光素酶，每个时间点都做3个平行孔，设未用IFN 处理的空白孔(Blank Control, BC)。结果，BoIFN-a、BoIFN-pCHO、PoIFN-a和PoIFN-(3CHO 在刺激Mxp表达萤光素酶上都相似，于5 — 6小时左右达到峰值(图7)，因此选择5 小时作为此后检测中IFN样品处理细胞的时间。
以MDBK-Mxp-Luc检测10倍梯度稀释的BoIFN-apCA、 BoIFN-pCHO、 PoIFN-apCA、 和PoIFN-|3CHO，于刺激5个小时后检测萤光素酶的表达，结果(图8)显示MDBK-Mxp-Luc对所有IFN样品的检测范围在约0.1和100 AU/ml之间，并且在0.5 和100 AU/ml活性范围内，萤光素酶的表达量和IFN活性近似线性关系。 MDBK-Mxp-Luc系统检测IFN活性的下限(表1)禾卩AVA (VSV*GFP)比较，除了 PoIFN-卩cho， MDBK-Mxp-Luc检测方法要比抗病毒活性定量检测方法的敏感性要略高。 IO倍稀释的转染对照上清、阴性CHO培养液，几乎对Mxp没有激活，而IO倍稀释 的野生型杆装病毒感染的上清，对Mxp有较高激活，可能是由于杆装病毒一过性感染 的结果，IOO倍稀释的就几乎没有激活。
由于没有猪和牛IFN标准品(WHO),所以为了检验MDBK-Mxp-Luc检测方法的 重复性，本研究通过计算BoIFN-Pcho和PoIFN-Pcho比值的变异系数来实现。把 BoIFN-(3cHo分别进行IOO倍(A)和100,000倍(B)稀释，把PoIFN-pCHO进行1,000 倍(C)禾n 1000,000倍(D)稀释。其中样A和C的活性较高(60~100AU/ml)，为 MDBK-Mxp-Luc检测线性范围的上限；样B禾卩D的活性较低(0.6 1.0AU/ml)，为 MDBK-Mxp-Luc检测线性范围的下限。分别以MDBK-Mxp-Luc在同一批次内和不同 批次间检测样A、 B、 C和D各10次，检测并计算萤光素酶表达量比值(RLUAyc和 RLUB/D)的变异系数，由表2可知，在同一批次，MDBK-Mxp-Luc检测高活性 BoIFN-)3cho和PoIFN-(3cho的比惶(RLUa;c)为1.13±0.063，变异系数为0.056;检测 低活性(RLUB/D)为1.15±0.044，变异系数为0.038。对于不同批次间的检测，相应的 RLUA/c为1.10±0.100，变异系数为0.092; RLUB/o为1.12±0.094，变异系数为0.084。
表1 MDBK-Mxp-Luc和AVA检测敏感性的比较
BoIFN-aBoIFN-P面PoIFN-aPoIFN长Ho
AVA (VSV*GFP)107_a106—106—106+
MDBK-Mxp-Luc107+b106+106+106+
分别用MDBK-Mxp-Luc和AVA (使用VSV*GFP)方法分析BoIFN-a, BoIFN-pCHO, PoIFN-a和PoIFN-Paro的生物学活性。结果表明，前者比后者敏感性略高。图中数值 表示干扰素样品的稀释倍数。
a表示此稀释度干扰素的生物学活性"不能够"被检测出。 b表示此稀释度干扰素的生物学活性"能够"被检测出。
表2 MDBK-Mxp-Luc检测的重复性
RLUa/c (IFN的高生物活性， 600~1020AU/ml)RLUB/D (IFN的低生物活性， 0.6~1.0AU/ml)
平均值标准偏差变异系数平均值标准偏差变异系数
测定间1.13 0.063 5.6%1.150.044 3.8G/o
(Intraas say) 测定间1.10 0.100 9,2%1.120.094 8.4%
BoIFN-卩oro分别以10倍(A)和100,000倍(B)稀释，PoIFN-pCHO分别以1,000倍(C)和1000,000倍(D)稀释。那么，A和C样的抗病毒活性较高(600~1020AU/ml)， B和D 样的抗病毒活性较低(0.6~1.0AU/ml)。用MDBK-Mxp-Luc分别同一批次内和批次间 对A、 B、 C和D样检测10次，计算A和C、 B和D的比值，分别用RLU(相对荧光 单位)A/C和RLUB/D表示，然后分别计算上述比值的平均值、标准差和变异系数。
3讨论
IFN-a/|3主要作用于I型IFN受体，激活JAK1和TYK2，促使STAT蛋白的酪氨 酸磷酸化，并形成STAT1-STAT2-IRF9复合物，即IFN刺激基因因子3 (IFN-stimulated gene factor 3， ISGF3)， ISGF3转运到核内结合到含有ISRE的DNA调节序列，刺激 超过100种IFN刺激基因(ISGs)的转录，诱导出"抗病毒状态"。因此ISRE是I型IFN 诱导出抗病毒状态的关键。哺乳动物IFN-a/p效应基因内有序列为 5'-A7GGTTTCNo-2)TTTCC/T-3'的 ISRE 基序，而鸡 Mxp 内的序列 5'-AGTTTCGTTTCT-3'符合上述序列的特征。因此，鸡Mxp不但适用于鸡I型IFN的 检测，也适用于哺乳动物I型IFN生物活性的检测，本文证实鸡Mxp能够用于牛、猪 IFN-a/卩的生物学活性检测。
本研究建立的MDBK-Mxp-Luc检测系统显示出诸多方面的优越性整个过程完全 避免VSV等活病毒的使用，没有生物安全的顾虑；萤光素酶的表达可以通过仪器检测 精确量化，不仅提高了 IFN定量的准确性，而且便于高通量操作，变异系数小于10%， 大大优于抗病毒检测的重复性(15% — 59%)。此外，在约0.1 100AU/ml之间，干扰 素活性与萤光素酶的表达成正相关，在约0.5 100AU/ml之间，成线性相关，在线性 范围内只需要一个稀释度就能够得出检测结果，减少了工作量。
再与ELISA方法相比，MDBK-Mxp-Luc系统检测的是IFN激活Mxp的能力，不 存在假阳性；本试验对不同来源的牛、猪IFN-ot/p的检测表明，总体来讲 MDBK-Mxp-Luc检测方法比抗病毒活性定量分析(VSV*GFP)的敏感性略高，具有 一定优越性。
除以上优点外，与报道的报告基因检测系统相比较，I型干扰素剌激Mx启动子的 时间与萤光素酶的表达量的关系明显不同。已有的报道使用人、鼠、鱼的Mx启动子 和氯霉素乙酰转移酶(CAT)、 Luc和人生长激素(hGH)等报告基因，在vero、 MDBK 或CHSE等细胞上检测人、鼠、鱼或牛的I型干扰素，干扰素处理后48h，报告基因的 表达仍然在增加， 一般选择24h或48h作为干扰素处理细胞的时间，整个检测所需时 间最少22小时[3-7'2()'21]。对于MDBK-Mxp-Luc分析系统，干扰素刺激5 6 h，萤光素 酶的表达就已达到最高峰，并且在12h降低了5倍，这与以往所有的报道都不相同。 整个检测可在14个小时内完成，是己报道的基于Mx启动子和报告基因检测方法中最 快的，相比较于抗病毒活性检测方法的40-48小时，更是大大节约了检测时间。本方 法中鸡Mx启动子和其它启动子刺激时间差异的根本原因是什么？可能是由于本研究克隆的鸡Mxp启动子碱基序列特殊性，或启动子结构上的不同，也可能是由于其它未 知原因，但无论如何，对这些未知的探索将会增进我们对干扰系统进化及诱导机制的 了解。
在一些病毒感染的过程中，病毒表达的某些蛋白(如牛呼吸道合胞病毒和流感的 NS蛋白、尼帕病毒和新城疫病毒的V蛋白等)通过阻断I型IFN的信号转导通路来 抵御宿主的进攻，而ISRE在I型IFN抑制病毒感染复制中是一个重要的枢纽，因此 MDBK-Mxp-Luc细胞系还作为研究病毒感染与牛I型IFN系统相互作用的分子机制的 有力工具。
结论，本研究建立了敏感、准确、快速、简便和安全的猪、牛I型干扰素报告基 因分析方法，可用来替代费时费力的传统AVA方法。
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3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 550权利要求
1.一种检测动物I型干扰素的生物学活性的方法，该方法包括以下步骤1)构建表达荧光素酶的重组质粒，该质粒包含Mx启动子和与该启动子可操作地连接的编码荧光素酶的基因；2)将步骤1)中构建的重组质粒转染所述动物细胞；3)用待测的动物I型干扰素样品处理在步骤2)中获得的转染细胞，比较在处理前后所述细胞的荧光素酶基因的表达水平。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述Mx启动子包含I型干扰素应答的关键 基因序列(ISRE) 5'-AGTTTCGTTTCT，优选是鸡Mx启动子。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述动物是禽类如鸡、或哺乳动物如猪 或牛。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述I型干扰素是(x或P干扰素。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤l)中的鸡Mx启动子的序列如 SEQ ID NO: 1所示。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中在步骤l)中的重组质粒为pMxp-luc，其核 苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
7. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤2)中的所述转染是稳定转染或 瞬时转染。
8. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤3)中的动物I型干扰素样品是 重组表达所述动物I型干扰素的细胞系的培养上清液或相应I型干扰素重组质粒转染 哺乳动物细胞的培养上清液，优选处理转染细胞5至6小时，优选所述细胞系是BHK-21 细胞或CHO细胞。
9. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤2)中获得的动物细胞是 MDBK-Mxp-Luc细胞系，其保藏编号为CGMCC 2416。
10. MDBK-Mxp-Luc细胞系，其保藏编号为CGMCC 2416。
全文摘要
本发明涉及一种检测动物I型干扰素的生物学活性的方法。更具体地，本发明涉及一种基于Mx启动子和萤光素酶报告基因定量检测动物如鸡、牛和猪的I型干扰素生物学活性的方法。与所有已报道的基于Mx启动子—报告基因检测方法中相比，该检测方法所需时间最短，可大幅度节约检测时间；与传统抗病毒定量检测方法相比，具有快速简便、准确敏感、便于高通量检测等显著优势，在禽类乃至哺乳动物干扰素生物学基础和应用研究及产业化过程中具有重要应用价值。
文档编号C12Q1/66GK101603076SQ200810109949
公开日2009年12月16日 申请日期2008年6月11日 优先权日2008年6月11日
发明者步志高, 陈伟业 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所