专利名称：肝脏x受体激动剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种肝脏X受体(Liver X receptor, LXR)激动剂(agonist)
的筛选方法，以及利用此方法筛选得肝脏X受体的激动剂。
背景技术：
核受体(nuclear receptor ， NR )为具有诱发转录活性的超级家族 (superfamily )，肝脏X受体(Liver X receptor, LXR)属于核受体的成员之 一，其含量以肝脏与脂肪组织(adipose tissue)为最多，LXRs在人体内负责 调控胆固醇(cholesterol )、脂肪酸(fatty acid)和葡萄糖(glucose)的代谢与 平衡，且其为代谢脂质和脂蛋白质的重要调控因子。在哺乳动物中存在有两种 结构相近^f旦表达形式不同的LXRs:肝脏X受体alpha (liver X receptor alpha, LXR-a)以及肝脏X受体beta (liver X receptor beta, LXR-卩)(Willy, P, J" Umesono, K.， Ong, E. S.， Evans, R. M., Heyman, R. A., and Mangelsdorf, D. J. 1995. LXR, a nuclear receptor that defines a distinct retinoid response pathway. Genes Dev. 9 (9) :1033-45.)，其中，LXR-a主要分部于肝脏和代谢旺盛的组 织如肾脏、小肠、脂肪组织和巨噬细胞等少数器官组织，而LXR-P则普遍存 在于各组织。
典型的核受体作用方式是当专一性小分子配体(ligand)与核受体结合后， 改变核受体蛋白质结构，使其能与靶基因启动子的特定序列结合，从而促进该 基因表达，此传讯过程称为活化；而活化LXR以调控脂肪代谢过程为LXR受 体先与另 一种受体类维生素AX受体RXR ( retinoic X receptor, RXR)形成异 质双体(dimer)后，再通过前述胆固醇前驱物的活化，而进入细胞核内，并 结合至靶基因的启动子上具有特殊辨识序列的LXR反应区(LXR response element, LXRE),进而调控脂肪和胆固醇新陈代谢，降低血管中的胆固醇沉 淀；此外，LXR所活化的基因产物，已知在巨噬细胞及其他周边组织可以造 成月旦固醇的回流运输(reverse cholesterol transport )，而^f吏过量的胆固醇得以形成高密度脂蛋白(HDL) (Steffensen, K.R. and Gustafsson,丄A. 2004 .Putative metabolic effects of the liver X receptor (LXR). Diabetes. 53 Suppl 1 :S36-42.)， 高密度脂蛋白具有抗炎、抗氧化、抗血栓形成和NO诱导的多种特性，也可有 效降低心血管疾病及动脉粥状硬化的发生率。
LXR激动剂(agonist)是一种可以和LXR结合，且启动LXR功能并增 加LXR讯息靶基因表达的物质，例如胆固醇前驱物(oxysterol)是活化LXR 的天然激动剂，其包含22-羟基胆固醇(22 (R)勿droxycholesterol )、 24-羟 基胆固醇(24 ( S ) -hydroxycholestero X 27-羟基胆固醇(27-hydroxycholesterol), 以及胆固醇酸(cholestenoic acid )等氧化态的胆固醇4汙生物；人工合成的 T0901317是强效的LXR激动剂，其化学全名为N-(2,2,2-三氟乙基)-N-[4 -[2,2，2_三氟-1-羟基三氟曱基)乙基]苯基]-苯磺酰胺 (N-(2,2，2-trifluoroethyl)-N-[4 - [2，2,2-trifluoro-l-hydroxy-l画(trifluoromethyl) ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide )。
相关动物实验研究发现LXR的激动剂的使用除有助于治疗动脉硬化 (atherosclerosis)及心血管疾病夕卜(cardiovascular disease), 其也具有抗发炎 效果，且对于糖尿病(diabetes ) ( Proctor, G., Jiang, T., Iwahashi， M.， Wang, Z., Li, J. and Levi, M. 2006. Regulation of renal fatty acid and cholesterol metabolism, inflammation, and fibrosis in Akita and OVE26 mice with type 1 diabetes. Diabetes. 55( 9 ):2502-9.)和阿兹海默症(Alzheimer's disease ) ( Koldamova, R. P.， Lefterov, I. M.， Staufenbiel, M., Wolfe, D., Huang, S., Glorioso, J. C., Walter, M., Roth， M. G. and Lazo, J. S. 2005 .The liver X receptor ligand T0901317 decreases amyloid beta production in vitro and in a mouse model of Alzheimer's disease. J Biol Chem.ll, 280 ( 6 ) :4079-88.),甚至癌症治疗(Fukuchi, J.， Kokontis, J. M., Hiipakka, R.A., Chuu， C.R and Liao, S. 2004. Antiproliferative effect of liver X receptor agonists on LNCaP human prostate cancer cells. Cancer Res. Nov 1， 64 ( 21 ) :7686-9.)也 具有功效。因此，若能建立一种可筛选出活化LXR的激动剂的方法，将有助 于动脉粥状硬化、心血管疾病与阿兹海默症的治疗以及糖尿病的预防，并可应 用于抗发炎上。 发明内容为可快速有效地找出能活化LXR的激动剂，本发明提供一种LXR激动剂 的筛选方法，并通过该筛选方法评估升麻(W/w'zcwM C/m/ci^^ e )中草药是否 可有效活化LXR的表达，以筛选出具有LXR活化功用的激动剂，进而达到预 防或治疗动脉粥状^^更化与心血管疾病等目的。
筛选方法构建部份，是将可同时表达肝脏X受体alpha配体的结合区域 (LXR-a ligand binding domain, LXR-a LBD )与GAL-4脱氧核糖核酸结合 区(GAL-4 DNA binding domain, GAL-4 BD )的融合蛋白质(fosion protein )， 以及可受GAL-4上〉游启动序歹'J (GAL-4 upstream activation sequence, GAL-4 UAS)调控的报告基因例如分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase, SEAP )构建形成a-SEAP表达质粒;f^并将该a-SEAP表达质粒转染(transfect) 至宿主细胞例如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell, CHO-kl )中， 进行LXR激动剂的筛选时，将待测样品加入宿主细胞培养基，接着检测培养 基中报告基因的表达量，对比加入待测样品时的报告基因的表达量与未加入待 测样品时的报告基因的表达量，当待测样品的报告基因的表达量高于未加入待 测样品的报告基因的表达量时，则表示待测样品为LXR的激动剂。
进而利用本发明构建的筛选方法检测升麻是否为LXR的激动剂，其中， 升麻是毛t科升麻属(cimicifugeae)植物，其主要用药部位为地下根茎，古 医书记载升麻具有清热解毒、镇痛、抗浮肿、镇静与透斑渗等效用，主治风热 头疼、牙痛、咽喉肿痛及子宫脱垂等病症。4企测时，首先将欲用作筛选测试样 品的升麻生药材的干燥根皮或茎以及商品化的升麻科学中药，分别以水与有机 溶剂进行萃取，由此取得含有生物活性成分的升麻生药材与升麻科学中药的水 萃取物或有机溶剂萃取物。其中，有机溶剂可包括醇类(例如甲醇、乙醇或丙 醇)、酯类(例如乙酸乙酯)、烷类(例如己烷)或卤烷(氯甲烷、氯乙烷)， 但并不以此为限，其中较佳者为醇类，更佳为70%乙醇。
接着在筛选方法中的该宿主细胞培养时，加入前述制备好的升麻生药材以 及升麻科学中药的水萃取物与有机溶剂萃取物。当待测样品中含有可与肝脏X 受体配体的结合区域相结合的配体时，便会驱动分泌型碱性磷酸酶报告基因的
表达，因此通过分析分泌型碱性磷酸酶的活性表达量，即可评估升麻生药材以 及升麻科学中药是否能有效活化LXR，进而得知升麻生药材以及升麻科学中药是否为LXR的激动剂。
通过前述以转染有a-SEAP表达质粒的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-kl)的 筛选平台，可快速且有效地评估各种待测样品是否具有活化LXR-a的功效， 且由实验结果也证实升麻生药材以及升麻科学中药的水萃取物与有机溶剂萃 取物皆可有效活化LXR-a,因此升麻生药材以及升麻科学中药是LXR-a的激 动剂，并可用以促使LXR-a驱动其下游基因的表达，进而调控脂肪和胆固醇 新陈代谢，达到预防及治疗动脉粥状硬化与心血管疾病的目的，且也可应用于 阿兹海默症的治疗、糖尿病的预防以及抗发炎方面。
以下将配合附图进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用 以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何本领域技术人员，在不脱离 本发明的精神和范围内，可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当以在 后的权利要求所界定者为准。
图1是本发明实施例a-SEAP表达质粒的示意图。
图2是本发明实施例用LXR激动剂筛选方法^r测升麻科学中药的水与 70%乙醇粗萃取物的分泌型碱性磷酸酶的活性倍率结果。
图3是本发明实施例利用LXR激动剂筛选方法检测升麻生药材的水与 700/。乙醇粗萃取物的分泌型碱性磷酸酶的活性倍率结果。
图4是本发明实施例升麻科学中药水粗萃取物经Sephadex LH-20管柱进 行胶体过滤层析所得180管分液于254 nm吸收光波长下的分布图。图中数字 1 14是依据主要吸收峰与吸收光波长由180管分液再分成14管分液的管数， 数字下方的横线为各14管分液的包含范围。
图5是本发明实施例升麻科学中药水粗萃取物经Sephadex LH-20分离纯 化所得180管分液再分为14管分液后，以LXR激动剂筛选方法检测14管分 液的分泌型碱性磷酸酶的活性倍率结果。
具体实施例方式
制备转染有能筛选LXR激动剂的a-SEAP表达质粒的细胞抹，并在培养 该细胞抹时，分别在其培养液中加入空白对照组、阴性对照组、阳性对照组 T0901317以及待测样品，当待测样品为LXR的激动剂时，便会驱动a- 8表达质粒上报告基因的表达。其中，本发明实施例所测试的样品是升麻
(c/m/cz/z《a racemoM )生药材与升麻科学中药的水萃耳又物与有机溶剂萃耳又物， 其是将升麻生药材以及升麻科学中药，利用公知萃取方式，以水或有机溶剂进 行萃取，由此取得升麻生药材以及升麻科学中药的水萃取物或有机溶剂萃取 物。萃取时所用有机溶剂可包括醇类(例如曱醇、乙醇或丙醇)、酯类(例如 乙酸乙酯)、烷类(例如己烷)或卣烷(例如氯甲烷、氯乙烷)，但并不以此为 限。其中较佳者为醇类，更佳者为乙醇。而由本发明下述具体实施例中报告基 因增加的表达量，证实升麻生药材以及升麻科学中药的水萃取物与有机溶剂萃 取物皆能有效活化LXR，且由阳性对照组T0901317活化LXR的程度，也可 知本发明所构建的a-SEAP表达质粒筛选平台，确实可有效且准确评估出能有 效活化LXR的激动剂，这对于快速筛选可活化LXR的激动剂将有莫大帮助。 现对前述测试方法详尽说明如下 实施例1:
构筑a-SEAP表达质粒
为能快速筛选得可活化LXR的激动剂，本发明实施例是构建一种可筛选 LXR激动剂的a-SEAP表达质粒，该表达质粒包含可同时表达肝脏X受体alpha 配体的结合区域(LXR-aLBD)与GAL-4脱氧核糖核酸结合区(GAL-4 BD ) 的融合蛋白质(flision protein),以及受GAL-4上游启动序列(GAL-4 UAS ) 调控的分泌型碱性磷酸酶(SEAP )。
其中，分泌型碱性磷酸酶(SEAP)是由人类胎盘碱性磷酸酶(placental alkaline phosphatase, PLAP)经修饰而得，SEAP报告基因的最大优点为可分 泌至细胞外例如细胞培养基中，因此，可以直接取部份细胞培养基进行非破坏 性的酶活性分析，且分析完毕还可再做其他研究用途。
GAL4为酵母菌的转录活化子(transcriptional activator )，其可净争录启动半 乳糖苷酶基因gall,以活化半乳糖的新陈代谢。GAL4是由功能相对独立的且 在结构上可以分开的位于N端的GAL-4脱氧核糖核酸结合区(GAL-4 BD) 以及位于C端的GAL-4转录活化结构域(GAL-4 activation domain GAL-4 AD ) 共同构成。其中GAL-4脱氧核糖核酸结合区(GAL-4 BD)可识别位于GAL4 效应基因的GAL-4上游启动序列(GAL-4 UAS )，并可与之结合；而GAL-4转录活化结构域(GAL-4 AD )则可与转录复合物中其他成分结合，启动GAL-4 上游启动序列的下游基因的转录。
构建a-SEAP表达质粒咏是以人类肝脏数据库(human liver cDNA library ) 为模板(template),同时利用引物LXR-a-LBD-2-F ( SEQ ID NO: 1)与 LXR-a-LBD-l-R ( SEQ ID NO: 2 )进行聚合酶链式反应(PCR),这些引物的 序列如下
(1 )正向引物(forward primer): LXR-a-LBD-2-F ( SEQ ID NO: 1 )
5 ，-AAGGATCCCTGTCAGAAGAACAGATC-3 ，；以及 (2 )反向引物(reverse primer): LXR-a-LBD-1陽R ( SEQ ID NO: 2 )
5 ，-AAAAGCTTTTCG TGCACATCCCAG AT-3'
将PCR复制的产物经过纯化之后，以BamH I与HindIII限制性内切酶处 理，并接合至已预先以BamH I与HindIII限制性内切酶处理的pCMV-BD (购 自stratagene ),形成pCMV-BD LXR-a LBD;接着以phRL-TK (购自Promega) 为模板，mTK-l-F ( SEQ ID NO: 3 )与mTK-2-R (SEQ ID NO: 4)为引物，进 行聚合酶链式反应，这些引物的序列如下 (3)正向引物:mTK-l-F (SEQ ID NO: 3)
5,画AAGTCG ACGGCCCCGCCCAGCGTCTTGT画3 ，；以及 (4 )反向引物mTK画2-R ( SEQ ID NO: 4 )
5，-AGATCTGCGGCACGCTGTTGACGCTGTTAAGCGGGTCGCTGCAG-
3，
将PCR复制的产物经过纯化之后，接合至pGEM easy vector (购自 Promega )，再经Sph I与Sal I限制性内切酶作用后接合至pG5SEAP vector(购 自BD Biosciences);再以上述pG5SEAP (含TK)为模板，利用引物SEAP cassette F与Beta-lactamase R进4亍聚合酶链式反应，这些51物的序列如下 (5 )正向引物SEAP cassette F ( SEQ ID NO: 5 )
5 ，-TACCGGTTCACACAGGAAACAGCTATGACC-3 ，；以及 (6 )反向引物(3-lactamase R ( SEQ ID NO: 6 ) 5 ，-GGGCGAC ACGGAAATGTTGAATACTC-3'
PCR产物经过纯化之后，以DraIII限制性内切酶作用后，接合到同样以DraIII限制性内切酶处理的pCMV-BD LXR-a LBD中，该PCR产物是插置于 该质粒的复制起始点fl ori处，如此即为a-SEAP表达质粒构建(请参阅图1 )。 实施例2:
LXR激动剂筛选方法的构建
本发明前述构建的a-SEAP表达质粒可进一步用于筛选LXR激动剂的方 法中，该方法包含下述步骤
(a) 构建表达质粒，该表达质粒至少包括肝脏X受体alpha配体结合区 域(LXR-a ligand binding domain )的序歹'j、 GAL-4脱氧核糖核酸结合区域(DNA binding domain )的序列、可受该GAL-4脱氧核糖核酸结合区域辨识的GAL-4 上游启动序歹'J ( GAL-4 upstream activation sequence )以及可受该GAL画4上游 启动序列调控的报告基因(reportergene);
(b) 将该表达质粒转染(transfect)至宿主细胞； (c )在该宿主细胞培养基中加入待测样品；
(d)检测培养基中该报告基因的表达量；
(e )对比加入该待测样品时的该报告基因的表达量与未加入该待测样品 时的该报告基因的表达量；以及
(f)当步骤(e)中该待测样品的该报告基因的表达量高于未加入该待测 样品的该报告基因的表达量，则表示该待测样品含有可与肝脏X受体alpha配 体结合区域(LXR-a LBD )相结合的配体(ligand),并判定该待测样品为可活 化肝脏X受体(LXR)的激动剂。
其中，步骤(a)的表达质粒可为本发明所构建的a-SEAP表达质粒，或 其他包含步骤(a)所述这些序列元件(element)的表达载体；报告基因可为 本发明的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)或其他容易被测知的表型且具备灵敏、 可定量与可一再分析等特点的报告基因例如P-galatosidase或如荧光素酶 (luciferase)的荧光蛋白等，并不以此为限。在步骤(b)，宿主细胞可表达 GAL-4脱氧核糖核酸结合区域(GAL-4 BD)与肝脏X受体alpha配体结合区 域(LXR-a LBD)蛋白质。在步骤(c),当待测样品中含有可与肝脏X受体 alpha配体结合区域(LXR-a LBD)相结合的配体时，GAL-4脱氧核糖核酸结 合区域(GAL-4 BD )会与GAL-4上游启动序列(GAL-4 UAS )相结合，进而驱动a-SEAP表达质粒上报告基因的表达，并利用报告基因的表达与否评估待 测样品是否可活化LXR,因此通过本发明建立的筛选方法可快速筛选检测得 LXR的激动剂。 实施例3:
LXR激动剂筛选方法的测试
本实验是通过实施例2所建立的LXR激动剂筛选方法，以人工合成的 T0901317强力激动剂评估该方法的可行性，并检测升麻是否为LXR的激动剂。 将前述制备好能筛选LXR激动剂的a-SEAP表达质粒转染至细胞抹中，并在 培养该细胞株时，分別在其培养液中加入阳性对照组T0901317以及下述制备 好的升麻生药材与升麻科学中药的粗萃取物，当这些待测样品中含有可与肝脏 X受体alpha配体结合区域(LXR-a LBD )相结合的配体时，便会驱动a-SEAP 表达质粒上报告基因的表达，再侦测报告基因表达量以得知这些待测样品是否 为活化LXR的激动剂。其实验细节说明如下 (1 )升麻活性成分的萃取
本试验分别采用升麻生药材与升麻科学中药进行粗萃取。其中，取生升麻 生药材的干燥根皮或茎压碎研磨，此升麻生药材的品种包含三叶升麻 (C7附/《wga /zerac/ezyb//o Kom.)、 兴安升麻(C/m/czy^ga da/zwWco ( Turcz.) Maxim.)或升麻(C7/w'c一伊/o幼Wa L.)，其中，三叶升麻分布于东北各地， 兴安升麻分布于东北、华北与华中各地，升麻分部于华南、华中、华北和华西 各地；同时取商品化升麻科学中药(购自顺天堂科学中药)，该升麻科学中药 是由升麻(C7w'cz/w伊/o幼'^ L.)所组成的单方，其中l克的升麻科学中药含 0.68克的浸膏(升麻经熬煮去除部份水分后留下的物质)以及0.32克的赋形 剂，再将这两种升麻分别以水及有机溶剂进行粗萃取。水萃取部份，加入药材 的IO倍体积的二次去离子水(ddH20)，以旋转的方式进行混合，4小时后请争 置于4。C冰箱，隔天离心取上清液，所得的萃取液冷冻干燥后计算回收率；有 机溶剂萃取部份，加入药材的10倍体积的70%乙醇，以旋转的方式进行混合， 4小时后静置于4X:水箱，隔天离心取上清液，所得的萃取液冷冻干燥后计算 回收率。将经粗萃取过后的升麻生药材与升麻科学中药的水萃取物与乙醇萃取 物储藏备用，以在后续筛选时用作待测样品。(2 )利用LXR激动剂筛选方法检测升麻萃取物是否为活化LXR的激动
剂
将前述a-SEAP表达质粒转染至中国仓鼠卵巢细胞4朱(CHO-kl)中，并 将转染成功的细胞林培养于适当的培养基中，置入二氧化碳培养箱于37。C下 培养5小时后，分别加入浓度为0.1吗/ml、 1吗/ml及10吗/ml的前述制备好 的升麻生药材与升麻科学中药的水粗萃取物与乙醇粗萃取物，同时以细胞无转 染a-SEAP表达质粒且无添加任何药物的培养基为空白对照组(mock control )、 无添加任何药物的培养基为阴性对照组(negative control),并以添加有2 fiM T0901317 (购自Merck, USA )的培养基为阳性对照组，其中T0901317的化学 全名为N-(2，2，2-trifluoroethyl)-N画[4-[2，2，2-trifluoro画l-hydroxy画1-(trifluoromethyl) ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide，研究证实T0901317为LXR-a与LXR-J3的 激动剂，其可通过活化LXR受体与RXR受体间的异质双体化 (heterodimerization dimer)过程，而诱发ABC 1基因转化胆固醇运输的表达， 这可促进胆固醇自肠道细胞中释出，进而抑制肠道吸收胆固醇，达到抗动脉粥 状硬化的目的，故试验中是将其当作阳性对照组以测试本发明所构建的LXR 激动剂筛选方法的效用。
在培养基中加入上述待测物质并处理24 48小时后，收集各培养液，以进 行细胞存活率与分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因活性的侦测。其中细胞 存活率是以MTT分析法进行的，此方法是一种生物学上常用以测定细胞存活 率或增殖作用的方法，其主要依赖活细胞内线粒体中的琥珀酸脱氢酶的作用将 MTT的四唑盐(tetrazolium)转为蓝色的产物MTT曱膊(formazan)，堆积于 细胞中，当加入DMSO将其溶解，则可利用测OD值得知细胞还原MTT的能 力(formazan形成量)，此OD值代表了线粒体的活性，即活细胞数目。测 试时，取前述处理后的细胞，在避光的环境下于加入2.5 mg/ml的MTT,反应 4小时后再于每一孔内加入100 )il的lysis buffer终止反应。最后以酶标仪在 570 nm吸光波长下测定其吸光值，以此计算细胞的存活率。
分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告基因活性通过检测其吸收光方式测得， 该方法收取培养液至1.5 ml微量离心管内，以65。C加热5分钟，于10,000 rpm 转速下离心15分钟，接着将各个样品加入96孔板测试活性，基于各受测样品表达活性可能高低不一，为避免当受测样品可能因其表达活性较高时，若取样 体积过多会使测得吸收值超过线性范围，或者当测样品可能因其表达活性较差 时，若取样体积过少会造成无法测得吸收值的状况，因此该试验中每一个样品 分别取低、中和高三种量进行分析，且也可达重复三次的试验目的，每一个样
品取三种体积分别为10^1、 20^1和50^1，再加入二次去离子水(ddH20)至总 体积为100 (il，最后加入100 ^呈色剂(含40 mg pNPP的8 ml 2倍SEAP缓 沖液)，以动力学模式(kinetic mode )利用酶标仪于A4q5吸收波长下每5分钟 测一次共测60分钟，并以下列式子计算得分泌型碱性磷酸酶(SEAP )活性变 化
分泌型碱性磷酸酶活性(mU/ml) =[ ( 60分钟的A4G5吸光值-0分钟的A405 吸光值)/60/0.04] x ( 1000/样品体积)
其中lmU ( milliunits )是等于每分钟0.04的A4Q5吸光值的增加量。此外， 本发明为确认分泌型碱性磷酸酶活性的数值高低是源自于药物的作用而非细 胞数不同所产生的差异，所测出的活性需以细胞存活率标准化，亦即将测得的 分泌型碱性磷酸酶活性除以MTT的OD值，即为每单位细胞活性，也就是分 泌型碱性磷酸酶活性的标准化。并求得实验组所测得数值与阴性对照组的数值 间的比值，此即为活化LXR因子的活性倍率(activation fold),其结果如图2 与图3所示。
请同时参阅图2与图3,图2为利用LXR激动剂筛选方法检测升麻科学 中药的水与70%乙醇粗萃取物的分泌型碱性磷酸酶的活性倍率结果；图3为利 用LXR激动剂筛选方法检测升麻生药材的水与70%乙醇粗萃取物的分泌型碱 性磷酸酶的活性倍率结果。由图2中可知，各浓度的升麻科学中药的水及乙醇 粗萃取物所测得的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性倍率皆相对高于阴性对照 组(N),这表示这些萃取物都可活化LXR,增进其表达量，其中又以浓度为 10pg/ml的升麻科学中药水粗萃取物的活性倍率数值为最高，其所呈现的分泌 型碱性磷酸酶(SEAP)活性倍率约为阴性对照组的两倍。由图3中可知，除 浓度为O.l吗/ml的升麻生药水粗萃取物的活性倍率与阴性对照组相近外，其 他浓度的升麻生药的水及乙醇粗萃取物所表达出的分泌型碱性磷酸酶(SEAP ) 活性倍率皆较高于阴性对照组，这表示升麻生药水粗萃取物的浓度大于0.1吗/ml时，方能有效活化LXR的表达，而浓度为0.1 |ig/ml~10 |ig/ml的升麻生 药乙醇粗萃取物则皆可活化LXR,增进其表达量，其中又以浓度为10吗/ml 的升麻生药乙醇粗萃取物的活性倍率数值为最高，其所呈现的分泌型碱性磷酸 酶(SEAP)活性倍率约为阴性对照组的1.7倍。这些结果显示升麻科学中药 与升麻生药的水与乙醇粗萃取物含有可与肝脏X受体alpha配体结合区域 (LXR-aLBD)相结合的配体，因此其可用作活化LXR的激动剂。另一方面，由图2与图3中可观察到，相对于阴性对照组，本身即为LXR组，此预期中的活性倍率结果显示，本发明利用转染有cc-SEAP表达质粒的中 国仓鼠卵巢细胞(CHO-kl )所建立的LXR激动剂筛选方式，确实可有效筛选 出能活化LXR的激动剂，且于该筛选方法中，只要待侧样品的报告基因的活 性倍率高于阴性对照组，和/或该待侧样品在不同浓度时所表现活性与其浓度 高低成正相关时，即可判定该待测样品为可活化LXR的激动剂。此外，同时比较升麻科学中药与升麻生药的水与乙醇粗萃取物的活性倍率 时，可发现浓度为10吗/ml升麻科学中药水粗萃取物所呈现的分泌型碱性磷 酸酶(SEAP )活性倍率显著高于其他这些萃取物，因此，本发明是将此10吗/ml 升麻科学中药水粗萃取物以胶体过滤层析作进一步的分离纯化，之后再针对每 一分液(fraction )进行LXR激动剂的筛选试验，找出升麻萃取物中可活化LXR 的有效成分。(3 )利用LXR激动剂筛选方法检测升麻科学中药水萃取物中所含可活化 LXR的有效成分本试验是取10g升麻科学中药回溶于100ml水中进行萃取，萃取后离心 所得的上清液冷冻干燥后净重为2.4g,再回溶于8ml水后，以SephadexLH-20 管柱进行胶体过滤层析，该Sephadex LH-20是依据管柱内所充填的胶体孔径 及萃取物分子量大小以达到分离效果。SephadexLH-20管柱预先以3倍体积的 去离子水进行平衡，然后于管柱中加入体积为8 ml且浓度为300吗/ml的升麻 科学中药水粗萃取物，以二次去离子水(ddH20)为冲堤液以0.5 ml/min的流 速进行分离纯化，并将滤出物以每管5毫升的体积量分管收集，共收集180 管的分液(fraction )。分别取前述所收集的各分液200 pi置入石英盘中，以酶标仪(ELISA reader)于254 nm吸光波长下测定其吸光值，各分液的254 nm 吸光波长分布图如图4所示，再依据图4中254 nm吸光波长的分布状态，若 可以明显区分成不同区域即视为一主要吸收峰，再由所呈现的主要吸收峰，将 这180管的分液再归纳分成14个分液，这14个分液的主要吸收峰分布范围及 其OD254数值如表1所示，并将浓度为0.01呢/ml的这14个分液以LXR激动 剂筛选方法检测各分液是否含有可活化LXR因子的有效成分，测得各分液的 分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性，并以浓度为0.01吗/ml的升麻科学中药水 粗萃取物的分泌型碱性磷酸酶活性数值为基准，求得各分液所测分泌型碱性磷 酸酶活性数值与升麻科学中药水粗萃取物的分泌型碱性磷酸酶活性数值间的 比值，此即为各分液的活化LXR因子的活性倍率(activation fold),其结果如 图5所示。表1 14个分液的主要吸收峰分布范围及其OD254数值请参阅图5,该图为升麻科学中药水粗萃取物经Sephadex LH-20分离纯化 所得各分液，以LXR激动剂筛选方法检测后的分泌型碱性磷酸酶活性倍率结 果。由图中可知，经Sephadex LH-20分离纯化后的升麻科学中药水萃取物各 分液中，除分液11至14的活性倍率与升麻科学中药水粗萃取物相近外，其他 各分液(分液1至10)所呈现的活性倍率皆相对高于升麻科学中药水粗萃取 物，其中又以分液6的分泌型碱性磷酸酶活性倍率为最高，其活性倍率约为升 麻科学中药水粗萃取物的2倍，此结果显示，升麻科学中药水粗萃取物经 Sephadex LH-20分离纯化后所得的分液6 (即180管分液中的第58管~第66 管的收集液)具有较佳活化LXR的功效。因此，具有活化LXR功效的升麻生药材的水与70%乙醇粗萃取物、升麻 科学中药的水与70%乙醇粗萃取物以及上述分液6可诱发LXR下游基因的表 达，进而达到预防动脉粥状硬化及心血管的目的；此外，含可有效活化LXR 成分的这些物质也可用作活化LXR的激动剂，并制备成医药组成物，以将其 应用于抗动脉粥状硬化、预防糖尿病以及抗发炎等医学方面。其中，前述医药 组成物除包含有效剂量的该些物质之外，尚可包括药学上可接受的载体。载体 可为赋形剂(如水)、填充剂(如蔗糖或淀粉)、黏合剂(如纤维素衍生物)、 稀释剂、崩解剂、吸收促进剂或甜味剂，但并未仅限于此。本发明医药组成物 可依一般公知药学的制备方法生产制造，将前述这些物质的有效成分剂量与一 种以上的载体相混合，制备出所需的剂型，此剂型可包括锭剂、粉剂、粒剂、 月交嚢或其它液体制剂，-f旦未以此为限。序列表<110>国鼎生物科技股份有限公司 <120〉肝脏X受体激动剂的筛选方法<130> OITW083318<160> 6<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 26<212> DNA <213>人工序列<220><223>以人类肝脏数据库(human liver cDNA 1 ibrary)为模板的正向引物<400> 1aaggatccct gtcagaagaa cagatc 26<210> 2<211> 26<212〉 ■ <213>人.丁序列<220><223>以人类肝脏数据库(human liver cDNA library)为模板的反向引物<400> 2aaaagctttt cgtgcacatc ccagat 26<210〉 3<211> 28<212〉 DNA <213>人工序列<220〉<223>以phRL-TK为模板的正向引物 <400〉 3aagtcgacgg ccccgcccag cgtcUgt 28<210> 4<211〉 44<212> DNA <213>人工序列<220〉<223〉以phRL-TK为模板的反向引物 <400> 4agatctgcgg cacgctgttg acgctgttaa gcgggtcgct gcag 44<210〉 5<211〉 30<212> DNA <213〉人工序列<220><223>以pG5SEAP为模板的正向引物 <■〉 5taccggttca cacaggaaac agctatgacc 30<210> 6<211> 26<212> DNA <213〉人工序列<220〉<223〉以pG5SEAP为模板的反向引物 <400〉 6gggcgacacg gaaatgttga atactc 2权利要求
1.一种肝脏X受体alpha(liver X receptor alpha，LXR-α)激动剂(agonist)的筛选方法，其步骤包含(a)构建一种表达质粒，该表达质粒至少包括肝脏X受体alpha配体结合区域(LXR-αligand binding domain)的序列、GAL-4脱氧核糖核酸结合区域(DNA binding domain)的序列、可受该GAL-4脱氧核糖核酸结合区域辨识的GAL-4上游启动序列(GAL-4 upstream activation sequence)以及可受该GAL-4上游启动序列调控的报告基因(reporter gene)；(b)将该表达质粒转染(transfect)至宿主细胞；(c)在该宿主细胞培养基中加入待测样品；(d)检测培养基中该报告基因的表达量；(e)对比加入该待测样品时的该报告基因的表达量与未加入该待测样品时的该报告基因的表达量；以及(f)当步骤(e)中该待测样品的该报告基因的表达量高于未加入该待测样品的该报告基因的表达量，则表示该待测样品含有可与肝脏X受体alpha配体结合区域相结合的配体(ligand)，并判定该待测样品为可活化肝脏X受体alpha的激动剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述报告基因的产物为能被侦测 及量化的酶或焚光蛋白。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述报告基因为分泌型碱性磷酸 酶(secreted alkaline phosphatase ， SEAP )。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，所述报告基因的表达量通过酶标 仪(ELIS A reader)分析。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵 巢细胞(Chinese hamster ovary cell, CHO画kl )。
7. —种升麻萃取物用以制备可活化肝脏X受体alpha (liver X receptor alpha LXR-a)的药物的用逸该升麻萃取物分离自升麻(i^/zowa生药或升麻科学中药。
8. 根据权利要求7所述的用途，其中，所述升麻生药选自由三叶升麻(C7m/"/， /^rac/e*//a Kom.)、兴安升麻(CVm/"/， tfoW/ca ( Turcz.) Maxim.)以及升麻(CV附/"/wga/o幼Wa L.)所组成的组中。
9. 根据权利要求7所述的用途，其中，所述升麻科学中药为由升麻 (CV附/"/wga L.)所组成的单方。
10. 根据权利要求8或9所述的用途，其中，所述升麻萃取物为醇类萃取物。
11. 根据权利要求IO所述的用途，其中，所述醇类为乙醇。
12. 根据权利要求11所述的用途，其中，所述乙醇浓度为70%。
13. 根据权利要求8或9所述的用途，其中，所述升麻萃取物为水萃取物。
14. 一种用于活化肝脏X受体alpha (liver X receptor alpha, LXR-a )的激 动剂(agonist )，其至少包括有效剂量的升麻(i /z/2r0ma CV/w'"/wgae)生药乙醇 萃取物以及医学上可接受的载体，其中，所述升麻生药选自由三叶升麻(CVw/"/wga /7erac/ez》/z'a Kom.)、兴安升麻(CV附/"y^a tfo/w/r/ca ( Turcz.) Maxim.)以及升麻(C/w/cz/wgo/o"zV/a L.)所组成的组中。
15. —种用于活化肝脏X受体alpha (liver X receptor alpha, LXR-a)的 激动剂(agonist),其至少包括有效剂量的升麻科学中药水萃取物以及医学上 可接受的载体，其中，所述升麻科学中药为由升麻(C7w/c诉/伊/o"/^L.)所 组成的单方。
16. —种可活化肝脏X受体alpha (liver X receptor alpha, LXR-a)的升麻 (i /2/加ma C/w/cz/wgae )萃取物的制备方法，其步骤包含(a) 取300 |ig/ml升麻科学中药水萃取物8 ml经Sephadex LH-20胶体 过滤层析以0.5 ml/min流速进行，并将滤出物以每管5毫升的体积量分管收集 而得到180管分液(fraction),其中，所述升麻科学中药为由升麻(CV/w'cz/wga /oW(iaL.)所纟且成的单方；(b) 通过酶标〗义(ELISA reader)于254 nm吸收光波长下测定这些分液 的吸光值，再划分成14管分液；以及(c )利用如权利要求1的肝脏X受体(LXR)激动剂(agonist)的筛选方法检测该14管分液的报告基因表达量，以获得可活化肝脏X受体(LXR) 的第6管分液。
17. —种用于活化肝脏X受体alpha (liver X receptor alpha, LXR-a )的激 动剂(agonist),其至少包括有效剂量的如权利要求16所述的第6管分液以及 医学上可接受的载体。
全文摘要
本发明是涉及一种肝脏X受体(LXR)激动剂(agonist)的筛选方法，尤其是涉及一种利用本发明构建的α-SEAP表达质粒所建立的筛选平台以供筛选可活化LXR的激动剂的方法；同时利用此方法筛选得升麻生药与升麻科学中药的水及酒精萃取物为LXR的激动剂。
文档编号C12Q1/68GK101592648SQ200810109808
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者刘胜勇, 温武哲, 郭茂田 申请人:国鼎生物科技股份有限公司