专利名称：一种用aflp指纹技术鉴定青菜品种的方法
技术领域：
本发明涉及AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。
背景技术：
传统的青菜品种鉴定方法主要是对植株形态进行观察，但由于大部分青菜品种苗期相似, 要到成株才开始表现品种的特性，所以从植株形态对青菜品种进行鉴定往往需要几个月的时 间。
AFLP技术是一项分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组
DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的 限制性位点序列，作为引物结合位点。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的 可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另 一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可 做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，它是一种新的而且有很 大功能的DNA指纹技术。近年来，随着该技术的逐渐成熟，在品种鉴定及辅助育种上得到 了具体的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是 (1)基因池DNA的来源
从不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取及纯化方法采用CTAB 法，其过程为取0.1g青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入750^x1 CTAB提取液后转入 1.5ml离心管中；然后65"C水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯 仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在12000r/min 条件下离心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4°C 条件下离心15min;离心转速为12000r/min，离心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加入 双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于一2(TC冰箱中备用。
(2) AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计
接头的碱基序列 EcoR I接头 5'〉CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA〈5'Mse I接头 5'>GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT〈5'
预扩增引物
EcoR I预扩引物序列5'> GAC TGC GTA CCAATT CA< 3， Mse I 预扩引物序列5'> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3'
选扩增引物
Mse I扩增引物用FAM标记 Pri證E GAC TGC GTA CCAATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTAACA G
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/ Msel-2: GAT GAG TCC TGA GTA ACA C
Primer E GAC TGC GTA CCAATT CAA G / MseI-6: GAT GAG TCC TGA GTA ACT C
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/ Msel-8: GAT GAG TCC TGA GTA ACT T
P匿r E GAC TGC GTA CCAATT CAC A/ Msel曙5 GAT GAG TCC TGA GTA ACT A
(3) AFLP反应条件
A、酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA 4|J (50ngVl)， Adapter(il (Mse I接头50 pmoles/fiL, EcoR I接头5 pmoes/|JL)， EcoRI /Mse I 2^1 (4u/pl每种)，10xReaction buffer 2.5pl, 10mM ATP 2.5^1， T4 Ligase lpl Gu/^il), AFLP-Water 7pl ，混匀离心数秒，37。C保温5h ，8。C保温4h， 4°C 10h;
B、 预扩增在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)模板DNA2pl，预扩引物 1(il(50ng/)xl每种)，dNTPs lpl(幽M)， 10xPCR buffer 2.5nl， Taq DNA polymease 0.5^1 (2u/pl)， 水18^1,离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮变性94'C2mm，(变性94°C 30s, 复性56°C 30s，延伸72°C 80s.)延伸72°C 5min;
C、 选择性扩增将预扩产物l: 20稀释,作为选扩模板。选择性扩增休系在0.2ml
离心管中，按下列方式加入体积(25pl体系)预扩增稀释样品2^1， 10xPCR buffer 2.5^1， dNTPS 0.5nl(10mM)， EcoRI引物(5ng/|il)， Mse I引物1^1 (30—1)， Taq酶0.5^1 (2u/pl)， H20 17.5^il，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环1轮扩增参数94°C 30s， 65。C 30s， 72'C80s，以后每轮循环温度递减0.7"C，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94°C 30s， 55。C 30s， 72°C 80s;
D、 扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V),电泳大 约1小时，小片段会先跑到胶的底部,测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。
(4) AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建
A、 GENESCAN软件分析用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安 装胶图的MATRIX,选择合适的内标即SIZE STANDARD,分析得到结果；
B、 通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选 择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD,点击分析，导出结果并将 结果保存为XLS格式；
C、 EXCEL转换将表内的数值不为O转换为1，数值为0的不转换，从而生成由"O"和"l"
组成的原始矩阵；
D、 EXCEL转换生成的0， l矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱； (5)青菜品种的鉴定
将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。 以上述AFLP扩增的结果为依据，构建青菜不同品种的标准DNA指纹图谱。 本发明与背景技术相比，构建了一个客观、科学、准确的青菜品种鉴定技术体系，特别 是以标准样品的0， 1矩阵图构建标准的青菜DNA指纹图谱，克服以往用电泳图直接比较可 能产生的误差。该发明为保护青菜育种产权、新品种登录、鉴定品种的真实性和纯度提供技 术保障。
图1是引物Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTA ACAG扩增的10个青菜品种AFLP电泳图谱
图2是引物Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTA
ACAG扩增的10个青菜品种AFLP的0， 1矩阵指纹图谱
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一歩说明 实施例1
(1)基因池DNA的来源
分别从抗热605、矮抗青、特矮青、黑油冬儿、早油冬儿、迟油冬儿、苏州青、矮萁苏州 青、黑叶五月慢、五月慢10个不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取 及纯化方法采用CTAB法，其过程为取O.lg青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入750W CTAB 提取液后转入1.5ml离心管中；然后65'C水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在 12000r/min条件下离心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA， 于4。C条件下离心15min;离心转速为12000r/min，离心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加入双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于一2(TC冰箱中备用。 (2) AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计
接头的碱基序列-EcoR I接头 5'〉CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA〈5'
Mse I接头 5'〉GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT〈5'
预扩增引物
EcoR I预扩引物序列5 ，> GAC TGC GTA CCA ATT CA< 3 ， Msel 预扩引物序列5，>GATGAGTCCTGAGTAAC<3，
选扩增引物
Mse I扩增引物用FAM标记
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT C AA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTA ACA G (3) AFLP反应条件
A、 酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA 4|il (50ng/|il)， Adapter 1^1 (Mse I接头50 pmoles/(xL, EcoR I接头5 pmoles/pL)， EcoRI /Mse I 2^1 (4u/(xl每种)，10xReaction buffer 2.5pl， 10mM ATP 2.5pl， T4 Ligase (3u/pl)， AFLP-Water7pl ,混匀离心数秒，37。C保温5h ，8'C保温4h， 4°C 10h;
B、 预扩增在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)模板DNA2ial，预扩引物 ljil(50ng/pl每种)，dNTPs lpl(10mM)， 10xPCR buffer 2.5^1， Taq DNA poly画se 0.5^K2u/(il)， 水18pl，离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮变性94。C2min，(变性94°C 30s， 复性56°C 30s，延伸72°C 80s.)延伸72。C 5min;
C、 选择性扩增将预扩产物l: 20稀释,作为选扩模板。选择性扩增体系在0.2ml
离心管中，按下列方式加入体积(25pl体系)预扩增稀释样品2^1， 10xPCR buffer 2.5^， dNTPS 0.5(xl(10mM)， EcoRI引物l^il (5—1), Msel引物l^il (30ng/Vl)， Taq酶0.5^1 (2u/nl)， H20 17.5|al，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环1轮扩增参数94°C 30s， 65°C 30s， 72'C80s，以后每轮循环温度递减0,7'C，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 80s;
D、 扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V),电泳大约1小时，小片段会先跑到胶的底部,测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生 成。
(4) AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建
A、 GENESCAN软件分析用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安 装胶图的MATRIX,选择合适的内标即SIZE STANDARD,分析得到结果；
B、 通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选 择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD,点击分析，导出结果并将 结果保存为XLS格式；
C、 EXCEL转换将表内的数值不为0转换为1，数值为0的不转换，从而生成由"0"和"1" 组成的原始矩阵；
D、 EXCEL转换生成的0， l矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱； (5)青菜品种的鉴定
将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例2
(1) 基因池DNA的来源
分别从抗热605、矮抗青、特矮青、黑油冬儿、早油冬儿、迟油冬儿、苏州青、矮萁苏州 靑、黑叶五月慢、五月慢10个不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取 及纯化方法采用CTAB法，其过程为取O.lg青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入75(^1 CTAB 提取液后转入1.5ml离心管中；然后65'C水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等休积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在 12000r/min条件下离心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA， 于4。C条件下离心15min;离心转速为12000r/min，离心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加 入双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于一2(TC冰箱中备用。
(2) AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计
接头的碱基序列 EcoR I接头 5'>CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA<5'
Msel接头 5'>GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT<5'
预扩增引物
EcoR I预扩引物序列5 ，> GAC TGC GTA CCA ATT CA< 3' Mse I 预扩引物序列5 ，> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3 ，选扩增引物
Mse I扩增引物用FAM标记 Primer E GAC TGC GTA CCAATT CAA G/ MseI-2: GAT GAG TCC TGA GTAACA C (3) AFLP反应条件
A、 酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA 4^1 (50ng/nl)， Adapter lpl (Mse I接头50 pmoles/(aL, EcoR I接头5 pmoles/VL)， EcoRI/Mse I 2pl (4u4d每种)，10xReaction buffer 2.5^1， 10mM ATP 2.5(xl， T4 Ligase l^il (3u/|_il)， AFLP-Water7pl ，混匀离心数秒，37。C保温5h ，8'C保温4h， 4°C 10h;
B、 预扩增在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)模板DNA2pl，预扩引物 l|xK50ng/Vl每种)，dNTPs lnl(10niM)， 10xpCR buffer 2.5^1' Taq DNApolymease 0.5^1 (2一)， 水18^1,离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮变性94°C 2min，(变性94°C 30s， 复性56"C 30s，延伸72°C 80s.)延伸72°C 5min;
C、 选择性扩增将预扩产物l: 20稀释，作为选扩模板。选择性扩增体系在0.2ml
离心管中，按下列方式加入体积(25^U休系)预扩增稀释样品2nl， 10xPCR buffer 2.5W， dNTPS 0.5nl(10mM)， EcoRI引物lpl (5ng/|il)， Mse I引物l)J (30ng/|il)， Taq酶0.5^1 (2岸)， H20 17.5^1，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环1轮扩增参数94°C 30s, 65'C 30s， 72°C 80s，以后每轮循环温度递减0.7°C，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 80s;
D、 扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V),电泳大
约1小时，小片段会先跑到胶的底部,测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生 成。
(4) AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建
A、 GENESCAN软件分析用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安 装胶图的MATRIX,选择合适的内标即SIZE STANDARD,分析得到结果；
B、 通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打丌Binthere软件，导入数据，选 择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD,点击分析，导出结果并将 结果保存为XLS格式；
C、 EXCEL转换将表内的数值不为O转换为1,数值为0的不转换，从而生成由"O"和"l" 组成的原始矩阵
D、 EXCEL转换生成的0， l矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱； (5)青菜品种的鉴定将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例3
(1) 基因池DNA的來源
分别从抗热605、矮抗青、特矮青、黑油冬儿、早油冬儿、迟油冬儿、苏州青、矮萁苏州 青、黑叶五月慢、五月慢IO个不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取 及纯化方法采用CTAB法，其过程为取O.lg青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入75(^1 CTAB 提取液后转入1.5ml离心管中；然后65'C水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在 12000r/min条件下离心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA, 于4'C条件下离心15min;离心转速为12000r/min,离心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加 入双蒸水溶解DNA,经DNA纯度检测证实纯化度，存于一20'C冰箱中备用。
(2) AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计
接头的碱基序列 EcoR I接头 5'>CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA<5'
Mse I接头 5'〉GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT<5'
预扩增引物
EcoRI预扩引物序列5'>GACTGC GTACCAATTCA〈3' Mse I 预扩引物序列5，> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3' 选扩增引物
Mse I扩增引物用FAM标记 Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G / Msel-6: GAT GAG TCC TGA GTA ACT C
(3) AFLP反应条件
A、 酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA 4)il (50ng/(al)， Adapter l(J (Mse I接头50 pmoles/jxL, EcoR I接头5 pmoles/,uL)， EcoRI /Mse I 2^1 (4uVl每种)，10xReaction buffer 2.5^1， 10mM ATP 2.5^1， T4 Ligase l^il (3u/pl)， AFLP-Water 7|il ，混匀离心数秒，37。C保温5h ,8。C保温4h， 4°C 10h;
B、 预扩增在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)模板DNA2)11，预扩引物 lnl(50ng/|al每种)，dNTPs l|J(10mM)' lOPCR buffer 2.5^d， Taq DNApolymeasc 0.5|il(2u/nl)， 水18pl,离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮变性94'C2min，(变性94°C 30s， 复性56°C 30s，延伸72。C 80s.)延伸72'C 5min;C、 选择性扩增将预扩产物l: 20稀释,作为选扩模板。选择性扩增怀糸在0.2ml
离心管中，按下列方式加入体积(25^d体系)预扩增稀释样品2^1， IOxPCR buffer 2.5^1, dNTPS O，(lOmM)， EcoRT引物(5ng/W)， Mse I引物lpl (30ng/fil), Taq酶0.5|al (2u/pl)， H20 17.5^1，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环1轮扩增参数94°C 30s， 65°C 30s， 72°C 80s,以后每轮循环温度递减0.7°C ,扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 80s;
D、 扩增产物的聚丙烯酰胺电泳预电泳20-30min，点样，电泳2.5h(电压1200V)，电泳大 约1小时，小片段会先跑到胶的底部,测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。
(4) AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建
A、 GENESCAN软件分析用GENESCAN3.1软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安 装胶图的MATRIX,选择合适的内标即SIZE STANDARD,分析得到结果
B、 通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选 择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZl STANDARD,点击分析，导出结果并将 结果保存为XLS格式；
C、 EXCEL转换将表内的数值不为O转换为1，数值为0的不转换，从而生成由"O"和'T' 组成的原始矩阵；
D、 EXCEL转换生成的O， l矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱； (5)青菜品种的鉴定
将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
权利要求
1、用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法，其特征在于其步骤如下(1)基因池DNA的来源从不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。(2)AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列接头的碱基序列EcoR I接头5′＞CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA＜5′Mse I接头 5′＞GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT＜5′预扩增引物EcoR I预扩引物序列5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’Mse I 预扩引物序列5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’选扩增引物Mse I扩增引物用FAM标记Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3GAT GAG TCC TGA GTA ACA GPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-2GAT GAG TCC TGA GTA ACA CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-6GAT GAG TCC TGA GTA ACT CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-8GAT GAG TCC TGA GTA ACT TPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAC A/MseI-5GAT GAG TCC TGA GTA ACT A(3)AFLP反应条件A、酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接头50pmoles/μL，EcoR I接头5pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每种)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μl，混匀离心数秒，37℃保温5h，8℃保温4h，4℃10h；B、预扩增在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)模板DNA 2μl，预扩引物1μl(50ng/μl每种)，dNTPs 1μl(10mM)，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl(2u/μl)，水18μl，离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮变性94℃2min，(变性94℃30s，复性56℃30s，延伸72℃80s)延伸72℃5min；C、选择性扩增将预扩产物1∶20稀释，作为选扩模板。选择性扩增体系在0.2ml离心管中，按下列方式加入体积(25μl体系)预扩增稀释样品2μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPS0.5μl(10mM)，EcoRI引物1μl(5ng/μl)，Mse I引物1μl(30ng/μl)，Taq酶0.5μl(2u/μl)，H2O 17.5μl，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环1轮扩增参数94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94℃30s，55℃30s，72℃80s；(4)AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建A、电泳大约1小时，测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。B、GENESCAN软件分析用GENESCAN软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安装胶图的MATRIX，选择合适的内标即SIZE STANDARD并设置软件合适的分析参数，分析得到结果；C、通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD，点击分析，导出结果并将结果保存为XLS格式；D、EXCEL转换将表内的数值不为0转换为1，数值为0的不转换，从而生成由“0”和“1”组成的原始矩阵；E、EXCEL转换生成的0，1矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱；(5)青菜品种的鉴定将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
全文摘要
本发明公开了一种用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。在AFLP指纹技术的基础上，以特定不同青菜品种的基因池为模版，以限制性内切酶EcoR I和Mse I酶解，然后酶切片段跟含有与其共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点来设计引物，并以特定引物对青菜不同品种的预扩增、选择性扩增共两次扩增为依据，构建青菜品种的标准DNA指纹图谱，将待定的青菜品种样本与标准图谱相比较，以鉴定待测样品的品种真实性。本发明为保护青菜育种产权、新品种登录、鉴定品种的真实性和纯度提供技术保障。
文档编号C12Q1/68GK101633950SQ20081010889
公开日2010年1月27日 申请日期2008年5月28日 优先权日2007年8月30日
发明者李红斌, 宏 王, 王世恒 申请人:杭州市农业科学研究院