专利名称：七鳃鳗解偶联蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及七鳃鳗解偶联蛋白(uncoupling protein, UCP)分子克隆及功能研究。二、 背景技术线粒体的主要功能是参与能量代谢。当线粒体进行呼吸时，呼吸链传递电 子的同时，将质子从线粒体基质泵到膜间隙，形成线粒体跨膜电位。质子通过 驱动ATP合成酶合成ATP，从而回到线粒体基质，形成氧化与磷酸化的偶联。 定位于线粒体内膜的UCP能使线粒体膜间隙的质子回漏到基质中，从而降低线 粒体的膜电位，使氧化与磷酸化解偶联。目前共发现5个UCP家族成员，由于 UCP4和UCP5与其余3个成员同源性较远，是否为UCP家族成员仍有争论。氧化磷酸化解偶联是恒温动物产热以维持自身体温的机理之一。UCP1参与 恒温动物的非颤栗性产热已得到公认(Enerback S. et. al. Nature 387: 90 - 94， 1997)。尽管有许多研究表明，UCP2和UCP3可能参与ATP的合成、调节 活性氧(reactive oxygen spicies, ROS)的生成、参与脂肪酸的代谢等 (Vida:i-Puig AJ. et. al. J Biol Chem 275: 16258 - 16266, 2000. Arsenijevic D. et. al. Nat Genet 26: 435 - 439, 2000. Jos印h JW. et. al. J Biol Chem 279: 51049 - 51056， 2004. Jaburek M. et. al. J Biol Chem 279: 53097 - 53102， 2004)。但是，目前它们的功能仍有争论。如果我们能够寻找到UCP进化的祖先， 明确其功能，然后沿动物进化路线，脊索动物-圆口纲动物-鱼类-两栖类-爬行类 -啮齿类-人，逐一阐明不同进化层次动物UCP的功能，对我们了解变温动物向恒 温动物进化过程中，UCP功能的变化，以及这种变化对变温动物向恒温动物进化 的影响，无疑是有益的。UCP与多种疾病相关。如，糖尿病、心血管疾病以及肿 瘤等(Zhang CY et al Cell 105: 745 - 755， 2001. Murrav AJ et al Lancet 364: 1786-1788, 2004. Mills EM et al J Biol Chem 277:27385-27392,2002)。 了解七鳃鳗(圆口纲动物)UCP的功能有助于我们更深刻理解哺乳类和人的UCP 的功能，因此，有助于我们以UCP作为靶点，制备治疗这些疾病的药物。七鳃鳗属于圆口纲动物，在演化过程中占有重要地位。 一些器官的起源与发 育以及获得性免疫的起源等，均出现于此进化阶段。因此，是研究这些课题的理 想动物。弄清七鳃鳗是否具有UCP，以及UCP在七鳃鳗代谢过程中的作用，将有 助于我们理解七鳃鳗的代谢特点及生理习性。为进一步研究在组织和器官的起源 与发育、获得性免疫的起源、尤其是代谢的演化打下基础。 三、发明内容本发明的目的是克隆七鳃鳗的UCP基因并对其功能进行研究。七鳃鳗UCP序列acgcggggacaggacgaagtcgtcaagcactcccacacttcccactggcatctcgcttcttCC3CC3CC3ccatcacagc3gC3gC3gC3gctcgcatsggccgggctggtctccaggcac卿cggcgccctgctggaggaggacttctcgcccagcaactcgagtcgggggagcggsctggctgtgtttcgcggactgc犯caggatcgtattatgcgcttaaagagtcgcgtccccaccactcttatgga卿agccctggtccaagaattctgccaaacggtccactacagtgaaagggacgcgtttcgggsgtcttgatgagctgsgaacccttttcccatcaagatttcgggcagagtacacctacctgcatcttcatcacatcagtcccgctaccgcc3ccactaccacctctacc33ccctccgctcatttcgtgCt3t犯3atacattcagaattaggcttttttcacgttaacgttttgga犯tatccgccgcaagtcaacataacacgctcgcacagagggg已咖tggttggtcttcggcccacggatgttccgccgactgcggctgtg^gttC3tCggagccggcaccgcagcgtgcattgccgacctcatcacgttccctctggacacggctaaagtccgcctgc鄉tccagggcgagtgccagcgcggtggag郷gggcggcgcgctctgctggcgtacaataccgcggtgtgttcggcaccatcgcggccatggtgcgcacggagggcccgcgcagcctctacagcggcctcgtcgccgggctgcagcggcagatgagcttcgcctcggtccgcatcggcctctacgactccgtc犯gaacttctacaccaacggcgctgaacacgcggggattgggtgccgcctactggccggctgcaccaccggcgcgatggccgtgacctttgcgcagcccaccgatgtggtgaaggttcgattccaggcgc郷tga3C3tgCtgggcacctccaagcgctacagcgtgcctacaagaccatcgcacgggaggagggcgtccgtggcgcactggccccaacatcacgcgcaacgccatcgtgaactgcgcggagctcgtgacctatgacatc3tc犯ggacaccatcctcaagtacaaactgctgactgacaacctgccctgccacttcgtgtccgccttcggagcgggcttctgcaccaccgttgtggcgtctcctgtggatgtggtga卿cgcggt3catg^ctctgcccccggccggtatcccagtgccttcaactgtgcctacctcatgctggagccatggctttttacaaagggtttgtgccgtcgttcctgcgcctgggctcctggaacgtggtgatgttcgtcacgtacgagcagctc卿cgcggcatcatgatggcc犯gc3gtcatgggaggtgcccttctagaagg鄉ttgtgtgcggctccccaacggcccgtcgttccgtgcacgtgaccaagcacgtgaacggcggcc^gtggtgcaagacgtgtcgtcggacagaac3acattacgcacagc3a3attttgctcaataattattcttcttcttcatagggctcattgctccagccgttactgcccctgatctatgtttttaagtttttttttgcctgtgttgctcgtcacttgctttg犯actctttaattctcgt犯gtggcc卿tttaagttgacttgcggtggacacgagttaa3CCCC3g3CC鄉tc鄉gtcctattccaccaatgctctgcctttatcgtttacgccttttgccgcatattccaggatgtttcgcaggcaaaaat aa11 atttttcctattttttttttttagtctgtactttgagtttttattattaaattgttgtgcctttgatcgctggtCg3^tttactttttttttattagtggcagttgtaagtagtac犯ctgttctagtacattgattattt3aatgax:ttt鄉aggatgtcttctggtgatatttgcacagctgagg犯tctttgtgcttaaactttgggcatt犯ccatacgaggattttaatttgccttttatcac已tttgcagcagcttcaacctttttaatgaacttac3accatgtgttgaccagcatttttccgggUttUtg3CCttgCg3cagcattgtttaactaaccgcatcacttatgcacaattgtaagtag3ccaa3actgt^gattgctgaatttcggacgctcggtt犯gtgagc犯taattaatgtgtttttcttaaggcgacagctgctggt3caattagsgtggtggacgtctttctcgaatggctgatttatttgcgtgcgcgcgtgtggggggtat￡LCg3Ct8ta3tttaacgtttacatttcaaactagcgcgtgttttctatggatggttcacattaggccccacaaacgacagggttgaaggatatttgaattcc ac at t aat aacttatcgtggtggttctgaatgctgatgtgttttatctcctggtgcatgcctgagttgtgcttctctgtggttcatttctctgcgatggt3cgtga^act犯ctgggtgctttgccacgtttttgaa3ctatgcacccccacgtgcgcgcccatcttcagtttcccaacacagcttgcgggggcgttttgaaaatgttggtttaatta^g犯3Cttgcatgttttaaaaaaaaaaaa本发明的技术解决方案:七鳃鳗UCP的分子克隆提取七鳃鳗的总RNA，逆转录成cDNA。用简并引物 扩增UCP片段，测序，经同源性、保守序列等分析，以证实克隆的片段为UCP。 然后3' ，5' -RACE克隆全长序列，再次同源性、保守序列等分析，以证实克隆的为UCP。将七鳃鳗UCP、小鼠UCP1、人UCP2克隆到酵母表达载体pYES2，在酵母中 分别表达上述3种解偶联蛋白，以空载体作为对照。提取酵母线粒体，测定。结 果表明，七鳃鳗UCP具有解偶联功能(7.4%)。本发明首次从七鳃鳗中克隆了UCP基因。实验证明，七鳃鳗UCP具有解偶联 功能，并与人源UCP2的解偶联功能更为相似。该基因具有解偶联功能。UCP与 机体的代谢相关。七鳃鳗是原口纲动物，在演化中占有重要地位。因此，了解 UCP的功能，对我们认识和了解生物代谢功能的演化规律具有重要意义。四
图l七鳃鳗解偶联蛋白解偶联功能的测定以及与小鼠UCP1、人UCP2解偶 联蛋白功能的比较。control:对照;r-UCP1:小鼠UCP1; h-UCP2:人UCP2; 1-UCP:七鳃鳗UCP; no GDP:没加GDP; ImM GDP:加入ImM GDP。五具体实施方式
提取七鳃鳗总RNA，将其逆转录成cDNA。用简并引物从cDNA扩增UCP片段， 经序列同源性比较后确定后，用3' ，5' -RACE扩增出UCP全长序列。将UCP编 码区序列克隆到酵母表达载体中，在酵母中表达，提取线粒体，测定UCP的解偶 联功能。材料与来源试剂，Trizol购自Invitrogen公司;3， ，5， -RACE试剂盒(SMART RACE cDNA Amplification Kit)购于Clontech公司；逆转录酶、Tag酶和pMD18-T vector及应用的酶类和试剂盒，除特殊标明外，均购于大连宝生物工程有限公 司；引物合成及序列测定由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen Biotechnology Co., Ltd)完成。手术器械剪刀，弯头小镊等购自江苏思来科技有限公司。材料及其它器材野生型七鳃鳗取自于黑龙江。HeidolphDIAX900匀浆器； BIO-RAD公司PCR仪，PowerLab装置，氧电极，恒温循环水浴锅。实施例1、七鳃鳗组织取材实验用野生型七鳃鳗取自于黑龙江。用剪刀快速剪碎后放于适量的Trizol中，于-8(TC保存备用。2、 RNA的提取及逆转录将保存于Trizol中的七鳃鳗，用Heidolph DIAX900组织匀浆器将其充分 匀浆(4档100秒)，将匀浆液转入洁净的1.5ml离心管中，室温放置5分钟后， 12000g， 4t:离心5分钟，取上清，加入200nl氯仿，强烈震荡混匀，室温放置 5分钟，12000g， 4'C离心15分钟，小心吸取上清至另一洁净的L5ml离心管 中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟，12000g， 4"C离心10分钟， 弃上清，75%乙醇洗涤沉淀，室温干燥，适量DEPC水溶解，紫外分光法定量。2 UgRNA用于逆转录，反应体系为20ul，含2ngRNA， lmM dNTP， 1U/ulRNA 酶抑制剂，2.5 pmol/ul 01ig(dT)18引物，0.5 U/ul AMV逆转录酶，轻轻混 匀，42°C 1小时，冰上放置2分钟，所得cDNA可用于PCR。3、 七鳃鳗UCP片段的克隆将人、小鼠、斑马鱼、鲤鱼等UCP2氨基酸序列进行比对，寻找保守序列设 计简并引物，上游引物为5' - GCMAAAGTSCGSCTHCAGRTCCA -3'，下游引物为 5， - TAKCKBGTYTTYACYACATCCAC-3',其中M:A-C; S: G-C; H: A-T-C; R: A-G; Y: C-T; K: G-T; B: G-T-C。PCR为20 u 1反应体系，含1 U 1 cDNA, 2 mM MgCl2， 0. 2 mM dNTP， 0. 025 U/ y 1Tag酶，2 pmol/u 1上、下游引物。上游引物5， — GCMAAAGTSCGSCTHCAGRTCCA -3'， 下游引物为5， -TAKCKBGTYTTYACYACATCCAC-3'，反应条件95°C5分 钟后，95'C30秒-67。C2分钟-72。C30秒(35个循环)，72。C延伸10分钟，电泳 分析。应用宝生物工程(大连)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0试剂盒(按说明书操作)切胶回收目的片段，然后 与pMD18-T vector连接(应用Takara DNA Ligation Kit),反应体系为pMD18-T vector lul，上述PCR产物0. 2 pmol，加H20至5ul后，加入等量(5ul ) Ligation Mix,混匀，16。C反应30分钟，全量加入100 w 1 T叩IO大肠杆菌感受 态细胞中，冰上放置30分钟，42°C90秒后，冰上放置1分钟，加入890P 1 LB 培养基，37°C250rpm培养1小时，取适量菌液涂布含有X-gal, IPTG和氨节青 霉素的LB固体培养基，37°〇过夜培养。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中37°C， 250rpm培养过夜。质粒提取应用上海赛百盛基因技术有 限公司UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒，按使用说明书操作。用Hand III 和Bam HI双酶切和PCR鉴定后，对序列进行测定。对序列进行同源性和保守氨 基酸等分析证明，我们克隆的片段属于UCP家族成员。根据此片段序列设计引物， 用于3' ,5' -RACE,以得到UCP全长序列。4、 3， ，5， -RACE (SMART RACE cDNA Amplification Kit购于clontech 公司)第一链cDNA的合成对于5， -RACE-Ready cDNA的合成，在离心管中配制 1 U g总RNA， 1 u 1 5， -CDS primer A， 1 u 1 SMART II A oligo，加水至体积为 5u 1;对于3， -RACE-Ready cDNA的合成，在离心管中配制1 u g总RNA， 1 u 1 3， -CDS primer A，加水至体积为5ul;将上述2离心管混匀，7CTC处理2分 钟后，冰上放置2分钟。然后，向两离心管中分别加入以下试剂，2yl 5X First-Strand Buffer, lyl DTT(20mM)， lyl dNTP Mix(10mM), lul PowerScript ReverseTranscriptase，总体积为10ul，混匀，42。C孵育1.5小 时，分别加入100u 1 Tricine-EDTA Buffer, 72'C处理7分钟后，-2(TC保存备 用。PCR: 41.5ulMaster Mix的配制5yl 10XAdvantage 2 PCR Buffer, ly ldNTP(10mM)， 1 u 1 50 X Advantage 2 Polymerase Mix,混匀备用。对于 5， -RACE，在PCR管中配制2. 5ul5' -RACE-Ready cDNA， 5ulUPM(10X), lul GSP (10 U M)，序歹!j为5 ， 一CTGGAATCGAACCTTCACCACATC-3 ，，力口入酉己好的 41. 5 u 1Master Mix，总体积50 u 1，混匀。对于3， -RACE,在PCR管中配制2. 5 u 1 5' -RACE-Ready c腿,5ul翻(10X), lul GSP(IO u M)，序列为5，-GTGGTGAAGGTTCGATTCCAGGC-3，，力口入酉己好的41. 5 U IMaster Mix,总体积 50nl，混匀。PCR反应条件95。C5分钟后，94°C30秒-72°C2分钟5个循环， 94°C30秒-70。C30秒-72°C2分钟5个循环，94°C30秒-68。C30秒-72°C2分钟25 个循环，然后72'C10分钟，电泳分析。应用Clontech公司提供的Nucleo Trap Gel Extraction Trial Kit (按i兑 明书操作)切胶回收目的片段，然后与pMD18-T vector连接(应用TaKaRa DNA Ligation Kit),反应体系为pMD18-T vector lul，上述PCR产物0. 2 pmol，力口H20至5ul后，加入等量(5ul ) Ligation Mix，混匀，16。C反应30分钟， 全量加入100 u 1 T叩IO大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟，42°C90秒 后，冰上放置1分钟，加入890ul LB培养基，37。C250rpm培养1小时，取适 量菌液涂布含有X-gal, IPTG和氨苄青霉素的LB固体培养基，37。C过夜培养。 挑取白色菌斑，加入3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中37°C， 250rpm培养过夜。 质粒提取应用上海赛百盛基因技术有限公司UltraPure'M质粒DNA小量提取试剂 盒，按使用说明书操作。用HandIII和BamHI双酶切和PCR鉴定后，对序列进 行测定。对序列进行同源性和保守氨基酸等分析证明，该基因属于UCP家族成员。5、 七鳃鳗UCP编码区序列的克隆及酵母表达载体的构建 设计PCR引物扩增七鳃鳗UCP编码区序列，克隆到T载体中，经PCR、酶切鉴定，测序证明该序列为七鳃鳗UCP编码区序列。双酶切含有七鳃鳗UCP编码区序列的T载体，将其亚克隆至酵母表达载体 pYES2中(方法同上)。将质粒转化酵母，铺固体平板，3(TC培养48小时。挑 取单克隆，接种至SC-U培养基(含3%乳酸)中，3(TC培养。提取质粒，PCR和 双酶切鉴定，证明得到含有七鳃鳗UCP编码区序列的酵母表达载体pYES2-UCP。将含有pYES2-UCP的酵母扩大培养，当OD为0.2时，加入半乳糖(终浓 度为1%)诱导蛋白表达，在3(TC， 280rpm继续培养8-IO小时。6、 酵母线粒体的分离2900g离心酵母液6分钟，30ml去离子水悬浮沉淀，2500g离心5分钟。 用缓冲液I (1 OOmM Tris,20mM DTT,pH:9.3 )悬浮沉淀(按2ml缓冲液1/ g cell)， 30°C， 220转/分钟孵育15分钟，2500g离心5分钟。用30ml缓冲液II(含100mM Tris， 500mMKCl,pH:7.0)悬浮沉淀，2500g离心5分钟，重复缓冲液II处理1 次。用缓冲液III (40mM Citrate, 120mM Na2HP04,1350mM Sorbitol, ImM EGTA， pH:5.8)悬浮沉淀,加入溶壁酶GOO^il/gcell), 30°C， 220转/分钟孵育10分钟， 4°C ， 2500g离心5分钟。30ml冰冷缓冲液IV ( lOmM Tris, 10mM Maleic acid， 750mM Sorbitor， 400mM Mannitol, 2mM EGTA， 0.1%BSA， pH:6.8 )轻轻悬浮沉淀，4°C ， 2500g离 心5分钟。用缓冲液V( lOmM Tris， 10mM Maleic acid,600mM Mannitol,2mM EGTA, ImM EDTA，0.5mMNa2HPO4， 2%BSA, pH:6.8)悬浮沉淀(7ml/g cell,使用时加入终浓 度ImM PMSF, lug/ml pepstatin)，用玻璃匀浆器轻缓匀浆，4°C， 800g离心10分钟。收集上清，沉淀用用缓冲液V悬浮，4°C， 800g离心10分钟，去沉淀， 合并上清，4°C， lOOOg离心10分钟，上清4°C， llOOOg离心10分钟。15ml 缓冲液VI( 10mM Tris， 10mM Maleic acid， 650mM Mannitol， pH:6.8 )轻轻悬浮沉淀，4'C ， 1000g离心10分钟，用缓冲液VI (40(Hil/gce11)轻轻悬浮沉淀。用Biuret方法 进行蛋白定量。7、七鳃鳗UCP解偶联功能的测定用PowerLab装置及氧电极，运行Chart4软件检测线粒体的氧消耗量。由于 线粒体要维持膜电势的动态平衡，故"呼吸即渗漏"，可以通过检测氧消耗量来 看UCP蛋白的解偶联能力。线粒体呼吸控制率的测定向小室中加入电极缓冲液(20mM Tris， 650mM Mannitol， 0.5mM EGTA， 5mM MgCl2, 0.5mM K2HP04, 0.2%BSA， pH:6.8),加入线粒 体(终浓度0.15mg/ml)，每隔1分钟依次加入NADH (终浓度3mM)、 ADP (终 浓度300^iM)、 Oligomycin (终浓度10 pg/ml)、 FCCP (终浓度20jaM)。线粒体呼 吸控制率(状态3/状态4)大于2时，表明线粒体完整。UCP蛋白解偶联功能的测定向小室中加入电极缓冲液(20mMTris，650mM Mannitol, 0.5mM EGTA， 5mM MgCl2, 0.5mM K2HP04, 0.2%BSA, pH:6.8)，加入线粒体 (终浓度0.15mg/ml)， 1分钟后加入Oligomycin (终浓度10 pg/ml)和NADH (终 浓度3mM)，然后每隔1分钟依次加入GDP(终浓度lmM)、FCCP(终浓度20pM)。 加入Oligomycin和NADH后的氧耗为质子渗漏引起，而加入FCCP后使完全解 偶联。2者的比值即为UCP蛋白的解偶联率。结果表明，空载体线粒体自身非特异性渗漏大约占16.8%，小鼠UCP1的 解偶联率达64.2% ，且能被GDP抑制达到原来的37% ，人UCP2解偶联率为2 %，七鳃鳗UCP解偶联率为7.3%。与小鼠UCP1不同，人UCP2和七鳃鳗UCP 的解偶联功能均不能被GDP所抑制。七鳃鳗解偶联蛋白(uncoupling protein， UCP)基因序列 <110>南京大学<120>七鳃鳗解偶联蛋白基因及其应用<160>1<210>1<211>2820<212>DNA<213>七龟哲鳗(Lampetrajaponica) <400>1acgcggggac aggacgaagt cgtcaagcac tcccacactt cccactggca tctcgcttct 60 tccaccacca ccatcacagc agcagcagca gctcgcatag gccgggctgg tctccaggca 120 caagcggcgc cctgctggag gaggacttct cgcccagcaa ctcgagtcgg gggagcggac 180 tggctgtgtt tcgcggactg caacaggatc gtattatgcg cttaaagagt cgcgtcccca 240 ccactcttat ggaagaagcc ctggtccaag aattctgcca aacggtccac tacagtgaaa 300 gggacgcgtt tcgggagtct tgatgagctg agaacccttt tcccatcaag atttcgggca 360 gagtacacct acctgcatct tcatcacatc agtcccgcta ccgccaccac taccacctct 420 accaaccctc cgctcatttc gtgctataaa atacattcag aattaggctt ttttcacgtt 480 tgtggaaaaa aacgttttgg aaatatccgc cgcaagtcaa cataacacgc tcgcacagag 540 gggaaaatgg ttggtcttcg gcccacggat gttccgccga ctgcggctgt gaagttcatc 600 ggagccggca ccgcagcgtg cattgccgac ctcatcacgt tccctctgga cacggctaaa 660 gtccgcctgc aggtccaggg cgagtgccag cgcggtggag agggggcggc gcgctctgct 720 ggcgtacaat accgcggtgt gttcggcacc atcgcggcca tggtgcgcac ggagggcccg 780 cgcagcctct acagcggcct cgtcgccggg ctgcagcggc agatgagctt cgcctcggtc 840 cgcatcggcc tctacgactc cgtcaagaac ttctacacca acggcgctga acacgcgggg 900 attgggtgcc gcctactggc cggctgcacc accggcgcga tggccgtgac ctttgcgcag 960 cccaccgatg tggtgaaggt tcgattccag gcgcaggtga acatgctggg cacctccaag 1020 cgctacagcg gaaccatcaa tgcctacaag accatcgcac gggaggaggg cgtccgtggc 1080 ctctggaaag gcactggccc caacatcacg cgcaacgcca tcgtgaactg cgcggagctc 1140 gtgacctatg acatcatcaa ggacaccatc ctcaagtaca aactgctgac tgacaacctg 1200 ccctgccact tcgtgtccgc cttcggagcg ggcttctgca ccaccgttgt ggcgtctcct 1260 gtggatgtgg tgaagacgcg gtacatgaac tctgcccccg gccggtatcc cagtgccttc 1320 aactgtgcct acctcatgct gactaaagaa ggagccatgg ctttttacaa agggtttgtg 1380 ccgtcgttcc tgcgcctggg ctcctggaac gtggtgatgt tcgtcacgta cgagcagctc 1440 aagcgcggca tcatgatggc caagcagtca tgggaggtgc ccttctagaa ggaggttgtg 1500 tgcggctccc caacggcccg tcgttccgtg cacgtgacca agcacgtgaa cggcggccaa 1560 gtggtgcaag acgtgtcgtc ggacagaaca acattacgca cagcaaaatt ttgctcaata 1620 attattcttc ttcttcatag ggctcattgc tccagccgtt actgcccctg atctatgttt 1680 tccccaaata ttaagttttt ttttgcctgt gttgctcgtc gatgtgaaac acttgctttg 1740 aaactcttta attctcgtaa gtggccaagt ttaagttgac ttgcggtgga aggaagaatt 1800 cacgagttaa accccagacc aggtcagggt cctattccac caatgctctg cctttatcgt 1860 ttacgccttt tgccgcatat tccaggatgt ttcgcaggca aaaataatta tttttcctat 1920 tttttttttt tagtctgtac tttgagtttt tattattaaa ttgttgtgcc tttgatcgct 1980 ggtcgaaatt tacttttttt ttattagtgg cagttgtaag tagtacaact gttctagtac 2040 attgattatt taaatgactt taggaggatg tcttctggtg atatttgcac agctgaggaa 2100tctttgtgct taaactttgg gcattaacca tacgaggatt 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权利要求
1.一种七鳃鳗解偶联蛋白基因，其特征在于序列为acgcggggac aggacgaagtcgtcaagcac tcccacactt cccactggca tctcgcttct tccaccacca ccatcacagcagcagcagca gctcgcatag gccgggctgg tctccaggca caagcggcgc cctgctggaggaggacttct cgcccagcaa ctcgagtcgg gggagcggac tggctgtgtt tcgcggactgcaacaggatc gtattatgcg cttaaagagt cgcgtcccca ccactcttat ggaagaagccctggtccaag aattctgcca aacggtccac tacagtgaaa gggacgcgtt tcgggagtcttgatgagctg agaacccttt tcccatcaag atttcgggca gagtacacct acctgcatcttcatcacatc agtcccgcta ccgccaccac taccacctct accaaccctc cgctcatttcgtgctataaa atacattcag aattaggctt ttttcacgtt tgtggaaaaa aacgttttggaaatatccgc cgcaagtcaa cataacacgc tcgcacagag gggaaaatgg ttggtcttcggcccacggat gttccgccga ctgcggctgt gaagttcatc ggagccggca ccgcagcgtgcattgccgac ctcatcacgt tccctctgga cacggctaaa gtccgcctgc aggtccagggcgagtgccag cgcggtggag agggggcggc gcgctctgct ggcgtacaat accgcggtgtgttcggcacc atcgcggcca tggtgcgcac ggagggcccg cgcagcctct acagcggcctcgtcgccggg ctgcagcggc agatgagctt cgcctcggtc cgcatcggcc tctacgactccgtcaagaac ttctacacca acggcgctga acacgcgggg attgggtgcc gcctactggccggctgcacc accggcgcga tggccgtgac ctttgcgcag cccaccgatg tggtgaaggttcgattccag gcgcaggtga acatgctggg cacctccaag cgctacagcg gaaccatcaatgcctacaag accatcgcac gggaggaggg cgtccgtggc ctctggaaag gcactggccccaacatcacg cgcaacgcca tcgtgaactg cgcggagctc gtgacctatg acatcatcaaggacaccatc ctcaagtaca aactgctgac tgacaacctg ccctgccact tcgtgtccgccttcggagcg ggcttctgca ccaccgttgt ggcgtctcct gtggatgtgg tgaagacgcggtacatgaac tctgcccccg gccggtatcc cagtgccttc aactgtgcct acctcatgctgactaaagaa ggagccatgg ctttttacaa agggtttgtg ccgtcgttcc tgcgcctgggctcctggaac gtggtgatgt tcgtcacgta cgagcagctc aagcgcggca tcatgatggccaagcagtca tgggaggtgc ccttctagaa ggaggttgtg tgcggctccc caacggcccgtcgttccgtg cacgtgacca agcacgtgaa cggcggccaa gtggtgcaag acgtgtcgtcggacagaaca acattacgca cagcaaaatt ttgctcaata attattcttc ttcttcatagggctcattgc tccagccgtt actgcccctg atctatgttt tccccaaata ttaagtttttttttgcctgt gttgctcgtc gatgtgaaac acttgctttg aaactcttta attctcgtaagtggccaagt ttaagttgac ttgcggtgga aggaagaatt cacgagttaa accccagaccaggtcagggt cctattccac caatgctctg cctttatcgt ttacgccttt tgccgcatattccaggatgt ttcgcaggca aaaataatta tttttcctat tttttttttt tagtctgtactttgagtttt tattattaaa ttgttgtgcc tttgatcgct ggtcgaaatt tactttttttttattagtgg cagttgtaag tagtacaact gttctagtac attgattatt taaatgactttaggaggatg tcttctggtg atatttgcac agctgaggaa tctttgtgct taaactttgggcattaacca tacgaggatt ttaatttgcc ttttatcaca tttgcagcag cttcaacctttttaatgaac ttacaaccat gtgttgacca gcatttttcc gggttttttt gaccttgcgacagcattgtt taactaaccg catcacttat gcacaattgt aagtagacca aaactgtaagattgctgaat ttcggacgct cggttaagtg agcaataatt aatgtgtttt tcttaaggcgacagctgctg gtacaattag agtggtggac gtctttctcg aatggctgat ttatttgcgtgcgcgcgtgt ggggggtata cgactataat ttaacgttta catttcaaac tagcgcgtgttttctatgga tggttcacat taggccccac aaacgacagg gttgaaggat atttgaattccacattaata acttatcgtg gtggttctga atgctgatgt gttttatctc ctggtgcatgcctgagttgt gcttctctgt ggttcatttc tctgcgatgg tacgtgaaaa ctaactgggtgctttgccac gtttttgaaa ctatgcaccc ccacgtgcgc gcccatcttc agtttcccaacacagcttgc gggggcgttt tgaaaatgtt ggtttaatta aagaaacttg catgttttaaaatgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa。
2.根据权利要求l所述七鳃鳗解偶联蛋白基因的克隆方法，其特征在于提取整条七鳃鳗RNA，将其逆转录成cDNA，根据已经克隆的其它物种解偶联蛋白基因 的保守序列，设计简并引物，从cDNA扩增解偶联蛋白基因片段，经序列同源性 比较，确定其为解偶联蛋白基因片段后，用3' ,5' -RACE扩增出解偶联蛋白基 因的全长序列。
3.根据权利要求l所述七鳃鳗解偶联蛋白基因在研究代谢、器官发育和免疫功 能演化中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。具体涉及七鳃鳗解偶联蛋白(uncoupling protein，UCP)分子克隆。本发明应用简并引物和3′，5′-RACE首次从七鳃鳗中克隆了UCP基因，该基因具有解偶联功能。UCP与机体的代谢相关。七鳃鳗是原口纲动物，在演化中占有重要地位。因此，了解UCP的功能，对我们认识和了解生物代谢功能的演化规律具有重要意义。
文档编号C12N15/10GK101280308SQ200810108519
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月21日 优先权日2007年5月22日
发明者孙国勋, 张峻峰, 张红杰, 张辰宇, 威 徐, 王修强, 邹季虹, 坤 陈, 陈均远, 阳 项 申请人:南京大学