山豆根多糖提取物在保护和治疗对乙酰氨基酚所致肝损伤中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及山豆根多糖提取物的新应用，具体是，从山豆根药材中提取分离得到多糖提取物，用于保护和治疗对乙酰氨基酚所致的肝损伤。特征是发现山豆根多糖提取物的保护和治疗对乙酰氨基酚所致肝损伤的效果优于临床用药N-乙酰半胱氨酸，其作用机制是山豆根提取物通过抗氧化、增加线粒体解偶联蛋白2表达等多种作用来联合缓解对乙酰氨基酚导致的急性肝损伤，这有助于临床防治对乙酰氨基酚过量误服产生的肝损伤。
【专利说明】山豆根多糖提取物在保护和治疗对乙酰氨基酚所致肝损伤中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及山豆根多糖提取物的新应用，具体是，从山豆根药材中分离得到多糖提取物，用于保护和治疗对乙酰氨基酚所致的肝损伤。
【背景技术】
[0002]对乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)又称扑热息痛，是常用的解热镇痛药物，在临床上使用广泛，临床剂量使用时有效安全。但过量使用时对乙酰氨基酚是一种肝毒性物质，服用过量会引起肝损伤，其是通过生物转化形成毒性代谢物进而引起一系列肝细胞功能异常而导致肝损伤、肝中毒，严重的会致肝衰竭甚至死亡。APAP体内主要在肝脏代谢，约60%在葡萄糖醛酸转移酶作用下与葡萄糖酸结合，约30%在硫酸转移酶作用下与硫酸结合，二者均成为无毒物质随尿排出。4% -5%的APAP经肝脏的CYP450氧化酶系统代谢为毒性较大的自由基代谢产物N-乙酰苯亚胺醌(NAPQI) (Gunawan BK, Liu ZX, Han D，Hanawa N，Gaarde WA, Kaplowitz N.c_Jun N—terminal kinase plays a major role inmurine acetaminophen hepatotoxicity.Gastroenterology.2006)，NAPQI 可与还原性谷胱甘肽(GSH)结合而解毒，一旦体内GSH消耗殆尽，NAPQI将与细胞内其他重要的生物大分子如蛋白结合形成APAP-蛋白复合物，此复合物可导致氧化应激、线粒体功能障碍和DNA损伤(Saito C，Zwingmann C，Jaeschke H.Novel mechanisms of protect1n againstacetaminophen hepatotoxicity in mice by glutath1ne and N-acetyIcysteine.Hepatology.2010)，从而导致肝细胞损伤、坏死，严重者可致肝肾衰竭、肝性脑病、脑水肿、低血糖、低血压，甚至死亡。目前临床上对于过量对乙酰氨基酚所致急性肝损的治疗方法主要是服用N-乙酰半胱氨酸(NAC)，但治疗效果并不理想，其主要原因是在于对乙酰氨基酚引起肝损伤的机理十分复杂，尚不十分清楚，且NAC治疗效果与中毒时间有密切关系，一般过量使用对乙酰氨基酚8小时内使用NAC有较好疗效，据报道美国每年因误过量服用APAP导致死亡病例可达近100人。最近有报道证明APAP肝中毒若通过药物使过氧化物酶体增殖物激活受体 a (peroxisome proliferator-activated receptor α , PPAR α )上调，进而增加其目标基因表达线粒体解偶联蛋白2(mitochondrial uncoupling protein2, UCP-2)增加，可以达到减轻肝细胞损伤的效果(Andrew DP, Yatrik MS, Tsutomu Μ,et al.PPAR a -dependent Induct1n of Uncoupling Protein 2Protects AgainstAcetaminophen-1nduced Liver Toxicity.Hepatology.2012)。
[0003]传统中草药中有不少对肝脏有保护及修复作用的品种，因此从中草药中提取有护肝作用的活性成分成为研究热点之一。山豆根为豆科槐属植物柔枝槐(越南槐、广豆根)Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根及根莖,主产于广西、贵州，山豆根药材微苦、性寒，具有清热解毒、消肿止痛的功效。山豆根的主要活性成分为生物碱和多糖。其生物碱具有抑瘤、抑菌、消炎、镇痛、抗真菌等生理活性，而其多糖具有免疫调节等药理活性，山豆根中的多糖具有多种药理作用:
[0005]1、免疫调节作用
[0006]近年来，许多以小鼠、SD大鼠以及鸡为动物模型的研究都已经证实山豆根多糖具有免疫调节作用，能够刺激淋巴细胞增殖，增高IgG的产生，并提示山豆根多糖可通过影响免疫细胞内的信号转导而影响机体的免疫功能。
[0007]2、抗氧化作用
[0008]山豆根多糖具有清除轻自由基的作用，保护机体免受活性氧(ROS)的氧化损伤，且呈明显的量效关系(J1ngran Chen, Tingjun Hu, Rongliang Zheng.Ant1xidantactivities of Sophora subprosrate polysaccharide in immunosuppressed mice.1nternat1nal Immunopharmaco1gy,2007)。
[0009]目前尚没有能有效完全阻断肝损伤发生的药物，目前也尚没有关于使用山豆根提取物和/或山豆根多糖对抗对乙酰氨基酚所致肝损伤的报道。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种山豆根多糖提取物的新应用。
[0011]本发明所提供的新应用具体为:以提取分离得到的山豆根多糖提取物保护和治疗对乙酰氨基酚所致的肝损伤。
[0012]山豆根提取物可通过口服或腹腔注射的方式导入体内。
[0013]本发明治疗对乙酰氨基酚所致肝损伤是在于山豆根多糖提取物抗氧化、增加线粒体解偶联蛋白2表达等多种作用来联合缓解对乙酰氨基酚导致的急性肝损伤。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为山豆根多糖提取物的红外图谱
[0015]图2为小鼠给药过程中的体重变化率
[0016]图3正常组的肝脏切片电镜照片
[0017]图4为APAP模型组的肝脏切片电镜照片
[0018]图5为NAC阳性对照组的肝脏切片电镜照片
[0019]图6为山豆根提取物高剂量组的肝脏切片电镜照片
[0020]图7为山豆根提取物中剂量组的肝脏切片电镜照片
[0021]图8为山豆根提取物低剂量组的肝脏切片电镜照片
[0022]图9为血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测结果
[0023]图10为肝组织中丙二醛(MDA)测定结果
[0024]图11为血清中甘油三酯(TG)测定结果
[0025]图12为肝组织中谷胱甘肽(GSH)测定结果
[0026]图13为肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)测定结果
[0027]图14为肝组织中解偶联蛋白2(UCP_2)测定结果
[0028]图15为肝组织中活性氧(ROS)测定结果
【具体实施方式】
[0029]以下通过【具体实施方式】对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0030]实施例山豆根提取物对对乙酰氨基酚所致急性肝损伤的治疗作用
[0031]1、实验方法
[0032](I)山豆根提取物制备方法
[0033]采用经预实验优化改良的水提醇沉法进行提取分离。称取50g干燥的山豆根药材粉末，分多次加入150mL事先预热的蒸馏水于45°C水浴浸泡20min，然后转移至瓷皿中450w间歇微波lminX12次，及时补充散失的水分并注意散热；再将混合物转移至锥形瓶中，补加约50mL蒸懼水,于45°C、120w超声18min ;最后转移至圆底烧瓶中，补加600mL蒸懼水加热回流提取3h，收集提取液后再加入蒸馏水700mL进行第二次水提2.5h。合并两次提取液，反复多次过滤除去药渣，提取液旋转蒸发浓缩至约80mL，将浓缩液滴加入事先量取好的4倍体积无水乙醇中进行沉淀，于4°C静置过夜使其充分沉淀。抽滤，得到醇沉物粗品，力口入10mL蒸馏水于65°C水浴加热使其充分溶解，3500rpm离心15min，收集上清液，再加入4倍体积无水乙醇醇沉，4°C静置过夜。抽滤，得到的二次醇沉物，冷冻干燥，将冻干物溶于约50mL蒸馏水中，65°C水浴加热使其充分溶解，6000rpm离心lOmin，收集上清液，装入已经处理好的透析袋(截留分子量3500)中，于蒸馏水中透析一天，透析液再次冻干得到淡黄色松软絮状物即为本实施例所需的山豆根提取物，计算产率。
[0034]对得到的提取物进行理化性质考察，采用红外光谱测定及Molish反应进行定性鉴定。苯酚-硫酸法测定产物中的多糖含量。
[0035](2)药效实验方法
[0036]在预实验基础上，60只ICR雄性小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、APAP模型组、NAC阳性对照组、提取物高剂量组、提取物中剂量组、提取物低剂量组(即Group A > Group B > Group C > Group H> Group M> Group L),按组分别饲养，自由进食进水。整个试验中注意观察小鼠的进食进水及活动情况。给药前称量所有小鼠体重并记录，计算给药量。第一天第一次给药，除正常对照组给予同体积的生理盐水外，其余5组均给予400mg/kg对乙酰氨基酚(以生理盐水为溶剂配制溶液，现配现用)，均采取腹腔注射的方式给药；4小时之后正常对照组和APAP模型组给生理盐水，NAC阳性对照组给120mg/kgNAC溶液(每次给药前现配)，提取物高、中、低剂量组分别给予200、100、50mg/kg山豆根提取物溶液，各组均为一天给药三次，连续给药两天。同时，在第二天给药前称量小鼠体重，记录并按实际体重给药。约在试验完成前8小时对所有小鼠禁食(不禁水)，完成最后一次给药后约4小时后进行摘眼球取血，处死并解剖解剖分离肝脏。收集到的血液3500rpm离心15min以分离得到血清，用天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒以及甘油三脂(TG)试剂盒分别测定。分离的小鼠肝脏样品，一部分浸泡于10%甲醛溶液中以备进行肝脏病理切片检查，剩余部分按照丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(S0D)、活性氧(ROS)以及解偶联蛋白2(UCP-2)试剂盒要求分装肝组织后进行测定。
[0037]2、实验结果
[0038](I)山豆根提取物的产率及性质考察
[0039]按上述步骤提取分离得到的提取物的主要成分为多糖，红外图谱结果见图1，Molish反应呈现明显的紫环，也证明其中多糖的存在；按上述优化工艺提取得到该提取物的产率为5.04%，明显高于传统水提醇沉法提取的产率；经苯酚-硫酸法测定，提取物含量平均为88.45%。
[0040](2)小鼠的体重及活动、进食情况
[0041]通过记录小鼠每天的体重，计算其体重变化率，进而在宏观上反应出小鼠的中毒和解毒的变化情况。小鼠体重变化率见图2，结果表明，第一天除正常对照组体重增长外，其余5组均为体重减少5%左右，其中APAP模型组减少程度最大；第二天正常对照组小鼠继续平稳增重，APAP模型组继续减重但程度有所减小，其余4组均有不同程度的增重，其中提取物高剂量组增重最多。体重变化率结果间接反应了小鼠在接受毒性剂量的APAP后肝脏损伤，身体状况急转直下的情况，而给予NAC及提取物溶液的4组的结果提示其有改善APAP所致肝损伤的效果。小鼠的活动及进食进水情况与体重变化情况相类似。
[0042](3)肝脏病理切片检查结果
[0043]小鼠肝脏进行常规石蜡包埋、HE染色、光镜检查及拍照，结果见图3?8。结果表明，正常对照组肝脏组织结构完整，肝细胞围绕中央静脉呈索状排列，肝细胞无变性、坏死，肝窦无扩张充血，间质无炎细胞浸润；APAP模型组肝脏组织结构紊乱，肝细胞灶性坏死，主要发生于小叶中心，坏死处炎细胞浸润，肝窦枯否氏细胞增生；NAC阳性对照组肝脏组织结构尚清楚，局部少量肝细胞变性、坏死，门管区和中央静脉周围少量纤维组织增生，伴随少量炎细胞浸润；提取物高剂量组肝脏组织结构尚完整，未见明显变性、坏死，肝脏实质细胞和间质均无明显异常；提取物中剂量组肝脏组织结构尚完整，肝细胞未见明显的变性、坏死，局部少量肝细胞空泡变性，间质无炎症改变，肝窦枯否氏细胞见程度较轻的增生；提取物低剂量组肝脏组织结构尚完整，绝大部分肝细胞未见明显的变性、坏死，局部少量肝细胞变性，肝脏间质少量炎细胞浸润，肝窦枯否氏细胞见程度较轻的增生。肝脏组织病理结果证实400mg/kg APAP可导致小鼠肝脏急性损伤，肝损伤模型成功；NAC及山豆根提取物均发挥出缓解和治疗此种肝损伤的效果，减轻了肝细胞损伤的程度，且随提取物用量增加，肝组织损伤程度减轻。
[0044](4)血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定结果
[0045]采用天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒对收集到的血清样本进行检测，结果见图9(*表示P < 0.05，**表示P < 0.01)。结果表明，正常对照组血清中仅有微量AST表明肝细胞结构完整；APAP模型组血清中含有大量AST，表明肝细胞损伤严重，有大量坏死情况；NAC阳性对照组及3个提取物组血清中含有少量的AST，表明肝细胞有轻微损伤情况，但明显优于模型组，表明NAC及提取物均能缓解APAP所致的肝脏急性损伤，同时可以观察到提取物组效果更佳，且呈现出一定程度上的剂量依赖关系。
[0046](5)肝组织中丙二醛(MDA)及血清中甘油三酯(TG)测定结果
[0047]使用丙二醛(MDA)及甘油三酯(TG)试剂盒分别测定肝组织中MDA及血清中TG含量，测定结果见图10和11(*表示P < 0.05，**表示P < 0.01)。结果表明，与正常对照组相比，APAP模型组肝组织中MDA和血清中TG均明显升高，表明模型组肝细胞中存在脂质过氧化的情况，这与文献报道APAP导致肝损伤的机理之一相吻合；NAC阳性对照组及3个提取物组均明显低于模型组，表明NAC及提取物溶液均能通过减轻肝细胞内脂质过氧化情况从而缓解APAP所致的肝脏急性损伤，与AST类似，可以观察到提取物组效果更佳，且呈现出一定程度上的剂量依赖关系。
[0048](6)肝组织中谷胱甘肽(GSH)测定结果
[0049]采用谷胱甘肽(GSH)试剂盒测定肝组织中的GSH含量，测定结果见图12(*表示P < 0.05，林表示P < 0.01)。结果表明，与正常对照组相比，APAP模型组肝组织中GSH明显减少，这也与文献报道APAP导致肝损伤的过程中产生亲电子代谢物N-乙酰苯亚胺醌(NAPQI)及大量过氧化物进而消耗肝脏中的还原型GSH相一致；与之相反，NAC阳性对照组的GSH含量明显升高，甚至超过了正常对照组的含量，该结果证实了 NAC能够为肝细胞提供大量GSH合成前体，从而对抗APAP导致的肝损伤；3种剂量提取物组肝组织的GSH含量稍低于正常组，但明显优于模型组，也证明山豆根提取物对APAP所致肝损伤有明显的缓解和治疗作用。
[0050](7)肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)测定结果
[0051]采用超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒测定肝组织中SOD含量，测定结果见图13(*表示P < 0.05，林表示P < 0.01)。结果表明，与正常对照组相比，APAP模型组肝组织中SOD明显减少，表明模型组小鼠肝细胞呈现的是氧化应激的情况；NAC阳性对照组及3个提取物组均明显高于模型组，表明NAC及山豆根提取物均在一定程度上缓解了肝细胞内氧化应激的程度，其中提取物高剂量组的治疗效果最优。
[0052](8)肝组织中解偶联蛋白2 (UCP-2)测定结果
[0053]使用小鼠种解偶联蛋白2(UCP_2)的Elisa试剂盒测定肝组织中的UCP-2含量，结果见图14 (*表示P <0.05，**表示P <0.01)。结果表明，与正常对照组相比，APAP模型组肝细胞线粒体中UCP-2含量略有增加，这可能是小鼠在肝中毒之后启动自我修复的结果之一；而嫩0阳性对照组则与正常组含量近似，说明NAC发挥护肝作用的机理并非引起UCP-2和/或PPAR α上调这条通路，而是增加肝细胞内的GSH合成前体来对抗氧化反应；3个提取物组的线粒体UCP-2则是明显升高，表明山豆根提取物缓解APAP所致肝损伤的机理除了前面已述的抗氧化(包括纸质过氧化)、减缓GSH消耗等作用外，可能还通过增加线粒体UCP-2的表达量，甚至以某种方式激活了 PPARa，进而调控相关的脂质氧化过程的多个酶，从而发挥了综合的对抗肝损伤的效果。
[0054](9)肝组织中活性氧(ROS)测定结果
[0055]采用活性氧(ROS)试剂盒测定肝组织中的ROS含量，测定结果见图15(*表示P< 0.05，**表示P < 0.01)。结果表明，与正常对照组相比，APAP模型组小鼠肝组织中的ROS明显升高，再一次表明肝细胞处于氧化应激状态，且肝细胞内的抗氧化物质可能耗竭而无法对抗这样的氧化反应；NAC阳性对照组的ROS含量要明显低于模型组，可能是由于NAC补充了肝细胞内的GSH水平，进而能够在一定程度上对抗氧化应激态，但并不能完全对抗，这可能是因为APAP导致肝中毒的途径众多，而GSH只能阻断其中的一部分通路，这可能也是临床上使用NAC解救患者有时效果不佳的原因之一。同时，3个提取物组的结果显示其ROS水平明显低于模型组，其中高剂量组水平甚至接近于正常组，表明山豆根提取物确实发挥出有效的抗氧化作用，这也可能与表达量增加的线粒体UCP-2有关，有研究证明UCP-2能够有效下调细胞内的ROS水平，因此说明以多糖为主要成分的山豆根提取物能够有效地对抗APAP所致的肝损伤，且通过多种作用通路同时起效。
【权利要求】
1.山豆根多糖提取物在保护和治疗对乙酰氨基酚所致肝损伤中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的山豆根多糖提取物主要成分为山豆根多糖，是从山豆根药材中提取分离得到。
3.根据权利要求1所述的应用，山豆根提取物可通过口服或腹腔注射的方式导入体内。
4.根据权利要求1所述的应用，保护和治疗对乙酰氨基酚所致肝损伤是在于山豆根多糖提取物抗氧化作用和增加线粒体解偶联蛋白2表达作用联合缓解对乙酰氨基酚导致的急性肝损伤。
【文档编号】A61K31/715GK104224822SQ201410524735
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】栾立标, 苏丹 申请人:中国药科大学