专利名称：文昌鱼解偶联蛋白基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及文昌鱼解偶联蛋白(uncouplingprotein，UCP)分子克隆及功能研究。
背景技术：
线粒体的主要功能是参与能量代谢。当线粒体进行呼吸时，呼吸链传递电子的同时，将质子从线粒体基质泵到膜间隙，形成线粒体跨膜电位。质子通过驱动ATP合成酶合成ATP，从而回到线粒体基质，形成氧化与磷酸化的偶联。定位于线粒体内膜的UCP能使线粒体膜间隙的质子回漏到基质中，从而降低线粒体的膜电位，使氧化与磷酸化解偶联。目前共发现5个UCP家族成员，由于UCP4和UCP5与其余3个成员同源性较远，是否为UCP家族成员仍有争论。
氧化磷酸化解偶联是恒温动物产热以维持自身体温的机理之一。UCP1参与恒温动物的非颤栗性产热已得到公认(Enerback S.et.al.Nature 38790-94，1997)。尽管有许多研究表明，UCP2和UCP3可能参与ATP的合成、调节活性氧(reactive oxygen spicies，ROS)的生成、参与脂肪酸的代谢等(Vidal-Puig AJ.et.al.J Biol Chem 27516258-16266，2000.ArsenijevicD.et.al.Nat Genet 26435-439，2000.Joseph JW.et.al.J Biol Chem 27951049-51056，2004.Jaburek M.et.al.J Biol Chem 27953097-53102，2004)。但是，目前它们的功能仍有争论。如果我们能够寻找到UCP进化的祖先，明确其功能，然后沿动物进化路线，脊索动物-圆口纲动物-鱼类-两栖类-爬行类-啮齿类-人，逐一阐明不同进化层次动物UCP的功能，对我们了解变温动物向恒温动物进化过程中，UCP功能的变化，以及这种变化对变温动物向恒温动物进化的影响，无疑是有益的。UCP与多种疾病相关。如，糖尿病、心血管疾病以及肿瘤等(Zhang CY et al Cell 105745-755，2001.Murrav AJ et al Lancet3641786-1788，2004.Mills EM et al J Biol Chem 27727385-27392，2002)。了解文昌鱼UCP的功能有助于我们更深刻理解哺乳类和人的UCP的功能，因此，有助于我们以UCP作为靶点，制备治疗这些疾病的药物。
文昌鱼属于脊索动物，被认为是脊椎动物的祖先，在进化过程中占有重要地位。由于对它的研究不够深入，影响其成为模式动物。弄清文昌鱼是否具有UCP，以及UCP在文昌鱼代谢过程中的作用，将有助于我们理解文昌鱼的代谢特点及生理习性，对文昌鱼早日成为模式动物是有益的。
发明内容
本发明的目的是克隆文昌鱼的UCP并对其功能进行研究。文昌鱼UCP编码区序列atgggcatcg gattcaagcc gctggaccag ccccccacgg tcggggtgcg gttcctgagtgcggggtttg ccgcttgtat agctgacggc atcacgtttc cactggacac ggcgaaagttcgtctgcaga tccagggaga gggtagcgcg gcggccgcaa ccaccgcccc tcgcctgaccaccctctgta ccagcaccat ggcggctcag ttcgacatgg ccgccggccc gttcaacgccaaacaccggg ggctgtccgg tattatcgtc tgcatcgtga agcaggaggg tccgaaggggctgtacagcg gcctggtggc cggactacac agacagatga gcttcgcctc catcagaatcggactgtacg actccgtcaa gggcttctat cagaaacaga ttggcaggga aagagagggtgcctccatgc cgacgagaat cctggcgggc atcacgacag gcgcggtggc ggtgtcctgcgcacagccca cagacgtggt gaaggtgcgc atgcaggcgg agggagctaa cccgttcggcgggaagaagc ggtacagcgg agccctgagt gcctacagga ccatcgccgt ggaggaaggc
gttaaaggct tgtggaaagg tacgggaccg aacattgctc ggaactccat cgttaacgccacggagctgg tgtgttacga catggtgaag gaggagatcc tgaggatgaa cctgatgacagataacctgc cctgtcactt cacgtctgcc ttcatcacag gattcgtcac cacctgtgtcgcctcacctg tagacgtcgt caaaacaaga tttatgaact ccagaccagg acagtacactggtgcactgg actgtgcact gaagatgttc tacgaaggag gaccactggc gttctacaaagggtttactc cttcatttat gcggctggga acgtggaata tcctgatgtt tgtgttctacgagcagttga agcgcggatt cacacatctc aacaaccaga accgtatccg ggaaataaaagcacccatgt ga本发明的技术解决方案1、文昌鱼UCP的分子克隆提取整条文昌鱼的总RNA，逆转录成cDNA。用简并引物扩增UCP片段，测序，经同源性、保守序列等分析，以证实克隆的片段为UCP。然后3’，5’-RACE克隆全长序列，再次同源性、保守序列等分析，以证实克隆的为UCP。
2、解剖文昌鱼，取肌肉、肠道和鳃，提取总RNA，逆转录成cDNA，用PCR检测UCP的表达。
3、将文昌鱼饲养于8℃和10℃，于第3日和第8日取材(每组8例)。另外，饥饿处理文昌鱼，在第3日、第8日和15日取材(每组8例)，提取整条文昌鱼的总RNA，逆转录成cDNA，用real-time PCR检测UCP的变化。
本发明首次从文昌鱼中克隆了UCP基因。它广泛表达于肌肉、肠道和鳃等组织。低温可使UCP表达增高，表明它参与了低温条件下的体温调节，饥饿14日UCP表达明显降低，表明它参与了能量代谢的调节。
UCP与多种疾病相关。如，糖尿病、心血管疾病以及肿瘤等。了解文昌鱼UCP的功能，将有助于我们更深刻理解哺乳类和人类UCP的功能。因此，有助于我们以UCP作为靶点，制备治疗这些疾病的药物。
四
图1RT-PCR检测UCP在文昌鱼肌肉、鳃和肠道组织中的表达1肌肉；2鳃；3肠道。上行为UCP；下行为18S rRNA.。
图2为低温(8℃和10℃)对UCP表达的影响。
图3为饥饿对UCP表达的影响。
五具体实施例方式
提取整条文昌鱼RNA，将其逆转录成cDNA。用简并引物从cDNA扩增UCP片段，经序列同源性比较后确定后，用3’，5’-RACE扩增出UCP全长序列。用RT-PCR方法检测证明，UCP表达于文昌鱼的肌肉、鳃和肠道。低温处理3天可诱导UCP的表达，饥饿处理14天抑制UCP的表达。这些结果表明，UCP参与文昌鱼的体温和代谢调节。
材料与来源试剂，Trizol购自Invitrogen公司；3’，5’-RACE试剂盒(SMARTMRACEcDNA Amplification Kit)购于Clontech公司；逆转录酶、Tag酶和pMD18-Tvector及应用的酶类和试剂盒，除特殊标明外，均购于大连宝生物工程有限公司；引物及序列测定由上海英骏生物技术有限公司(Invitrogen BiotechnologyCo.，Ltd)完成。
手术器械剪刀，弯头小镊等购自江苏思来科技有限公司。
其它器材Heidolph DIAX900匀浆器；ABI Prism 7000 Sequence DetectionSystem PCR仪；文昌鱼由南京大学北海工作站提供。
实施例1、不同条件处理文昌鱼及组织取材实验用文昌鱼由南京大学北海工作站提供。将正常饲养的文昌鱼放于平皿中用剪刀快速剪碎后放于适量的Trizol中，于-80℃保存备用。
将文昌鱼分别饲养于8℃和10℃的培养箱中，于第3日和第8日取材，每组8条，方法同上。
饥饿处理文昌鱼，分别于第3、8、15天取材，每组8条，方法同上。
以正常饲养(23℃，正常喂食)的文昌鱼(8条)，作为两种不同处理的对照组。
解剖6-8条文昌鱼，收集肌肉、鳃和肠道组织，放于适量的Trizol中，于-80℃保存备用。
2、RNA的提取及逆转录将保存于Trizol中的文昌鱼，用Heidolph DIAX900组织匀浆器将其充分匀浆(4档100秒)，将匀浆液转入洁净的1.5ml离心管中，室温放置5分钟后，12000g，4℃离心5分钟，取上清，加入200μl氯仿，强烈震荡混匀，室温放置5分钟，12000g，4℃离心15分钟，小心吸取上清至另一洁净的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟，12000g，4℃离心10分钟，弃上清，75％乙醇洗涤沉淀，室温干燥，适量DEPC水溶解，紫外分光法定量。然后用DNaseI(RNase Free)处理提取的RNA以防止基因组DNA的污染。简言之，于37℃，用10U DNaseI处理20-50μgRNA30分钟，然后用酚、氯仿和异戊醇抽提，醋酸钠和乙醇(pH5.2)沉淀，70％乙醇洗涤，干燥后，用适量DEPC水溶解，紫外分光法定量。
2μg RNA用于逆转录，反应体系为20μl，含2μg RNA，1mM dNTP，1U/μl RNA酶抑制剂，2.5pmol/μl Olig(dT)18引物，0.5U/μl AMV逆转录酶，轻轻混匀，42℃1小时，冰上放置2分钟，所得cDNA可用于PCR或real-timePCR。
3、文昌鱼UCP片段的克隆将人、小鼠、斑马鱼、鲤鱼等UCP2氨基酸序列进行比对，寻找保守序列为TFPLDTA和MFVTYEQ，设计简并引物，上游引物为5’-ACITTYCCICTIGAYACIGC-3’，下游引物为5’-TGYTCRTAIGTIACRAACAT-3’，其中RA-G；YC-T；I与A、T、C、G均可配对。
PCR为20μl反应体系，含1μl cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.025U/μlTag酶，2pmol/μl上、下游引物。上游引物5’-ACITTYCCICTIGAYACIGC-3’，下游引物为5’-TGYTCRTAIGTIACRAACAT-3’，反应条件95℃5分钟后，95℃30秒-50℃2分钟-72℃30秒(30个循环)，72℃延伸10分钟。取第一次PCR产物1μl作为模板行第二次PCR，反应条件同上，电泳分析。
应用宝生物工程(大连)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0试剂盒(按说明书操作)切胶回收目的片段，然后与pMD18-T vector连接(应用Takara DNA Ligation Kit)，反应体系为pMD18-Tvector 1μl，上述PCR产物0.2pmol，加H2O至5μl后，加入等量(5μl)Ligation Mix，混匀，16℃反应30分钟，全量加入100μl Top10大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟，42℃90秒后，冰上放置1分钟，加入890μl LB培养基，37℃250rpm培养1小时，取适量菌液涂布含有X-gal，IPTG和氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。质粒提取应用上海赛百盛基因技术有限公司UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒，按使用说明书操作。用Hand III和Bam HI双酶切和PCR鉴定后，对序列进行测定。对序列进行同源性和保守氨基酸等分析证明，我们克隆的片段属于UCP家族成员。根据此片段序列设计引物，用于3’，5’-RACE，以得到UCP全长序列。
4、3’，5’-RACE(SMARTMRACE cDNA Amplification Kit购于clontech公司)第一链cDNA的合成对于5’-RACE-Ready cDNA的合成，在离心管中配制1μg总RNA，1μl 5’-CDS primer A，1μl SMART II A oligo，加水至体积为5μl；对于3’-RACE-Ready cDNA的合成，在离心管中配制1μg总RNA，1μl 3’-CDSprimer A，加水至体积为5μl；将上述2离心管混匀，70℃处理2分钟后，冰上放置2分钟。然后，向两离心管中分别加入以下试剂，2μl 5×First-StrandBuffer，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl PowerScriptReverseTranscriptase，总体积为10μl，混匀，42℃孵育1.5小时，分别加入100μl Tricine-EDTA Buffer，72℃处理7分钟后，-20℃保存备用。PCR41.5μlMaster Mix的配制5μl 10×Advantage 2 PCR Buffer，1μldNTP(10mM)，1μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix，混匀备用。对于5’-RACE，在PCR管中配制2.5μl 5’RACE-Ready cDNA，5μl UPM(10×)，1μlGSP(10μM)，序列为5’-CCTTCGGACCCTCCTGCTTCACGAT-3’，加入配好的41.5μlMaster Mix，总体积50μl，混匀。对于3’-RACE，在PCR管中配制2.5μl5’RACE-Ready cDNA，5μl UPM(10×)，1μl GSP(10μM)，序列为5’ACGACATGGTGAAGGAGGAGATCC-3’，加入配好的41.5μlMaster Mix，总体积50μl，混匀。PCR反应条件95℃5分钟后，94℃30秒-72℃2分钟5个循环，94℃30秒-70℃30秒-72℃2分钟5个循环，94℃30秒-68℃30秒-72℃2分钟25个循环，然后72℃10分钟，电泳分析。
应用Clontech公司提供的Nucleo Trap Gel Extraction Trial Kit(按说明书操作)切胶回收目的片段，然后与pMD18-T vector连接(应用TaKaRa DNALigation Kit)，反应体系为pMD18-T vector 1μl，上述PCR产物0.2pmol，加H2O至5μl后，加入等量(5μl)Ligation Mix，混匀，16℃反应30分钟，全量加入100μl Top10大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟，42℃90秒后，冰上放置1分钟，加入890μl LB培养基，37℃250rpm培养1小时，取适量菌液涂布含有X-gal，IPTG和氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃过夜培养。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃，250rpm培养过夜。质粒提取应用上海赛百盛基因技术有限公司UltraPureTM质粒DNA小量提取试剂盒，按使用说明书操作。用Hand III和Bam HI双酶切和PCR鉴定后，对序列进行测定。对序列进行同源性和保守氨基酸等分析证明，该基因属于UCP家族成员。
5、PCR检测UCP在不同组织中表达PCR为20μl反应体系，含1μl cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.025U/μlTag酶，各0.2pmol/μl上、下游引物，UCP上游引物5’-GTGAAGCAGGAGGGTCCGAAGG-3’，UCP下游引物5’-GAGTCGTACAGTCCGATTCTGATGG-3’；18S rRNA上游引物5’-GAGAAACGGCTACCACATCCAAG-3’，18S rRNA下游引物5’-TTAAAGTGTACCCATTCCAATTACGG-3’。反应条件95℃5分钟后，95℃30秒-68℃60秒(UCP30个循环，18S rRNA25个循环)72℃延伸10分钟，电泳分析。
6、real-time PCR检测UCP在不同处理条件下的表达PCR为20μl反应体系，含1μl cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.025U/μlTag酶，0.125pmol/μl上、下游引物，同时20μl反应体系中含有1μlEvaGreenTM(购于上海开发科技发展有限公司的美国Biotium公司产品)，UCP上游引物5’-GTGAAGCAGGAGGGTCCGAAGG-3’，下游引物5’-GAGTCGTACAGTCCGATTCTGATGG-3’；18S rRNA上游引物5’-GAGAAACGGCTACCACATCCAAG-3’，18S rRNA下游引物5’-TTAAAGTGTACCCATTCCAATTACGG-3’。反应条件95℃5分钟后，95℃30秒，68℃60秒(40个循环)，72℃延伸10分钟。结果用ABI Prism 7000SDS Software分析。
文昌鱼解偶联蛋白(uncoupling protein，UCP)基因序列<110>南京大学<120>文昌鱼解偶联蛋白基因及其应用<160>1<210>1<211>1032<212>DNA<213>文昌鱼(Branchiostoma belcheri)<400>1atgggcatcg gattcaagcc gctggaccag ccccccacgg tcggggtgcg gttcctgagt 60gcggggtttg ccgcttgtat agctgacggc atcacgtttc cactggacac ggcgaaagtt 120cgtctgcaga tccagggaga gggtagcgcg gcggccgcaa ccaccgcccc tcgcctgacc 180accctctgta ccagcaccat ggcggctcag ttcgacatgg ccgccggccc gttcaacgcc 240aaacaccggg ggctgtccgg tattatcgtc tgcatcgtga agcaggaggg tccgaagggg 300ctgtacagcg gcctggtggc cggactacac agacagatga gcttcgcctc catcagaatc 360ggactgtacg actccgtcaa gggcttctat cagaaacaga ttggcaggga aagagagggt 420gcctccatgc cgacgagaat cctggcgggc atcacgacag gcgcggtggc ggtgtcctgc 480gcacagccca cagacgtggt gaaggtgcgc atgcaggcgg agggagctaa cccgttcggc 540gggaagaagc ggtacagcgg agccctgagt gcctacagga ccatcgccgt ggaggaaggc 600gttaaaggct tgtggaaagg tacgggaccg aacattgctc ggaactccat cgttaacgcc 660acggagctgg tgtgttacga catggtgaag gaggagatcc tgaggatgaa cctgatgaca 720gataacctgc cctgtcactt cacgtctgcc ttcatcacag gattcgtcac cacctgtgtc 780gcctcacctg tagacgtcgt caaaacaaga tttatgaact ccagaccagg acagtacact 840ggtgcactgg actgtgcact gaagatgttc tacgaaggag gaccactggc gttctacaaa 900gggtttactc cttcatttat gcggctggga acgtggaata tcctgatgtt tgtgttctac 960gagcagttga agcgcggatt cacacatctc aacaaccaga accgtatccg ggaaataaaa 1020gcacccatgt ga 103权利要求
1.一种文昌鱼解偶联蛋白基因，其特征在于编码区序列为atgggcatcggattcaagcc gctggaccag ccccccacgg tcggggtgcg gttcctgagt gcggggtttgccgcttgtat agctgacggc atcacgtttc cactggacac ggcgaaagtt cgtctgcagatccagggaga gggtagcgcg gcggccgcaa ccaccgcccc tcgcctgacc accctctgtaccagcaccat ggcggctcag ttcgacatgg ccgccggccc gttcaacgcc aaacaccgggggctgtccgg tattatcgtc tgcatcgtga agcaggaggg tccgaagggg ctgtacagcggcctggtggc cggactacac agacagatga gcttcgcctc catcagaatc ggactgtacgactccgtcaa gggcttctat cagaaacaga ttggcaggga aagagagggt gcctccatgccgacgagaat cctggcgggc atcacgacag gcgcggtggc ggtgtcctgc gcacagcccacagacgtggt gaaggtgcgc atgcaggcgg agggagctaa cccgttcggc gggaagaagcggtacagcgg agccctgagt gcctacagga ccatcgccgt ggaggaaggc gttaaaggcttgtggaaagg tacgggaccg aacattgctc ggaactccat cgttaacgcc acggagctggtgtgttacga catggtgaag gaggagatcc tgaggatgaa cctgatgaca gataacctgccctgtcactt cacgtctgcc ttcatcacag gattcgtcac cacctgtgtc gcctcacctgtagacgtcgt caaaacaaga tttatgaact ccagaccagg acagtacact ggtgcactggactgtgcact gaagatgttc tacgaaggag gaccactggc gttctacaaa gggtttactccttcatttat gcggctggga acgtggaata tcctgatgtt tgtgttctac gagcagttgaagcgcggatt cacacatctc aacaaccaga accgtatccg ggaaataaaa gcacccatgt ga。
2.根据权利要求1所述文昌鱼解偶联蛋白基因的克隆方法，其特征在于提取整条文昌鱼RNA，将其逆转录成cDNA，根据已经克隆的其它物种解偶联蛋白基因的保守序列，设计简并引物，从cDNA扩增解偶联蛋白基因片段，经序列同源性比较，确定其为解偶联蛋白基因片段后，用3’，5’-RACE扩增出解偶联蛋白基因的全长序列。
3.根据权利要求1所述文昌鱼解偶联蛋白基因在制备治疗代谢性疾病和其它疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。具体涉及文昌鱼解偶联蛋白(uncoupling protein，UCP)分子克隆及功能研究。本发明应用简并引物和3’，5’－RACE首次从文昌鱼中克隆了解偶联蛋白(uncoupling protein，UCP)基因。它广泛表达于肌肉、肠道和鳃等组织。低温(8℃和10℃)处理第三日可使UCP表达增高，表明它参与低温条件下的体温调节；饥饿14日UCP表达明显降低，表明它参与能量代谢的调节。UCP与多种疾病相关。如，糖尿病、心血管疾病以及肿瘤等。因此，以UCP作为靶点，可以制备治疗这些疾病的药物。
文档编号A61K31/7088GK101058810SQ20071002160
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日
发明者孙国勋, 王修强, 张辰宇, 项阳, 陈均远, 张俊峰, 张红杰, 徐威, 邹季虹 申请人:南京大学