适用于生产稳定性同位素¹⁵N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺的制作方法

专利名称：适用于生产稳定性同位素¹⁵N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于稳定性同位素标记化合物生产领域，涉及到微生物发酵生产工 艺，尤其涉及适用于生产稳定性同位素"N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺。
背景技术：
15N稳定性同位素标记L-亮氨酸的生产可采用有机合成法、前体发酵法、 酶法及提取法、直接发酵法等。采用合成法工艺繁琐，且需要光学拆分使15N 原料利用率比较低，成本上升。水解法常用于制备复合氨基酸，要分开所有氨 基酸很困难。酶法生产L-亮氨酸-"N需要a—氧代己酸、甲酸铵-"N作为原料， 最终产量不是很高，原料甲酸铵-"N利用率较低。而采用直接发酵法生产，目 标氨基酸大量富集，分离比较简单，但由于种子、发酵配方中有机氮源很难标 记，常常使L-亮氨酸-"N的丰度下降很多达不到产品要求，筛选适用于L-亮氨 酸-"N生产的工艺条件是该技术的关键。而且采用常规发酵方法，15N稳定性 同位素标记L-亮氨酸产量虽然相对较高，但"N丰度下降很大，往往下降3% 以上，很难达到高丰度产品要求。且由于要添加大量'SN无机氮源，成本很高。 采用全合成培养基发酵虽然对15N丰度影响不大，但产酸量太低使得15N原料 利用率不高。目前，在"N稳定性同位素标记L-亮氨酸的生产领域中还不见专 利和文献报道。发明内容本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足之处而提供一种 "N-L-亮氨酸丰度高，"N利用率高的适用于生产稳定性同位素"N标记L-亮氨 酸的发酵生产工艺。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现适用于生产稳定性同位素"N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺，其特征在于， 该工艺包括以下步骤(1) 出发菌株的选取选取适用于L-亮氨酸-"N生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工 艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏 杆菌、谷氨酸棒杆菌；(2) 发酵培养配方以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源，以葡萄糖为碳源，初 始配方中葡萄糖浓度为6 14wt%;以氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等铵盐或尿素 为初始氮源，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节pH来补充氮源，不添加 或添加极微量玉米桨、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解液、菌体水解液等有机氮 源的一种，该有机氮源中氨基氮浓度为5 20g/L;磷酸盐、镁盐、锰盐、亚铁 盐等无机盐根据不同菌种添加一定量；发酵初始配方中生物素大大过量，VB1 添加50 2000ug/L， VB6添加50 1000 ug/L，泛酸添加50 500 ug/L，尼克 酸添加20 600 ug/L;(3) 发酵工艺根据产品需求量分别采用摇瓶发酵或发酵罐发酵工艺得发酵液； 所述的摇瓶发酵是将菌体接种于活化培养基平板上，3(TC下生化培养箱中 培养16 30小时，待菌落长成后，将菌体接种于事先灭菌完的发酵培养液中， 每瓶发酵培养液接一环菌体，发酵培养液的装液量为装液瓶的3wt% 5wt%， 将接种完的发酵培养液置于摇摆式摇床上，发酵温度28 32°C ，摇床转速180 240转/分钟，连续发酵72 96小时；所述的发酵罐发酵是将菌体接种于活化培养基平板上，3(TC下生化培养箱 中培养16 30小时，待菌落长成后，将长好的菌苔接种于已灭菌的装有种子 培养基的摇瓶中，在28 32'C下摇床培养10 24小时，获得种子液；发酵初 始温度28 33。C，初始pH6.8 7.2，采用大接种量2 10wt% 、低糖流加，强 制控制发酵工艺，将种子按体积比2 10%接种于已灭菌的装有发酵培养基的 发酵罐中开始发酵，控制条件温度29 37°C，通气量0.5 1.5VVM，罐压 0.01 0.05MP，溶解氧1 95%， PH7.0 7.5，采用添加液氨方式控制发酵液 PH值，并以消泡剂消泡。(4) 分离提取发酵液中"N稳定性同位素标记L-亮氨酸的分离采用离子交换法提取得到"N稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，通过真空浓縮赶氨并采用乙醇低温结晶、 真空干燥得到产品。所述的步骤(2)中的培养基包括斜面保藏培养基、斜面活化培养基、种 子培养基、发酵培养基。所述的斜面保藏培养基的配方为蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，氯化钠 5g/l，琼脂20g/l。所述的斜面活化培养基的配方为葡萄糖3g/l，蛋白胨10g/l，牛肉膏 10g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l。所述的种子培养基的配方为葡萄糖30g/l，尿素lg/l，硫酸铵5g/l， KH2P04 : 0.5g/l，玉米桨20g/l， MgS04.7H20: 5mg/L。所述的步骤(2)中有机氮源的添加量为0.2wtW以下。所述的步骤(2)中发酵初始配方中生物素大大过量，添加纯生物素 100~1000ug/L。所述的步骤(3)中发酵罐发酵全过程控制pH在微碱性，pH用添加液氨 控制在7.0 7.5，流加50wtX葡萄糖控制发酵液葡萄糖浓度3 6 wt%，发酵 时间32 70小时。与现有技术相比，本发明通过改变发酵配方和控制工艺，获得的"N稳定 性同位素标记L-亮氨酸产酸量比采用全合成培养基发酵产酸量相应提高50% 以上，且"N稳定性同位素标记L-亮氨酸"N丰度下降可以减少到1%以下， 有的甚至几乎不下降，大大提高了 "N原料利用率，减少了生产成本。同时， 在保证产品"N丰度条件下，采用一次接种的方法，简化了发酵和提取工艺， 由于原料得到充分利用，大大节省了原料，降低了成本。本发明可利用低丰度 和高丰度15n无机原料满足不同丰度产品要求。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明作进一步说明。采用同位素专用质谱仪或光谱法分析"N丰度，纯度分析采用凯氏定氮法。 实施例1使用菌种为以黄色短杆菌ATCC39106为出发菌，使用的培养基包括斜面 保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活化 培养基同常规发酵采用相同。使用的斜面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶 发酵培养基配方如下所示斜面保藏培养基蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l;斜面活化培养基葡萄糖3g/l，蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，氯化钠 5g/l，琼脂20g/l;发酵培养基配方葡萄糖100g/l， ("NH4)2S04("N原子丰度10.24%):20g/l ， MgS04.7H20: 6mg/L ， MnS04.H20:4mg/L ， FeS04.7H20: 4mg/L KH2P04:lg/l， VH:600ug/L， VBl:400ug/L，泛酸100ug/l，尼克酸:100ug/1，玉 米桨2g/l用500ml三角瓶以20ml的载液量分装发酵培养基。 以上培养基均用2mol/l氢氧化钠调节PH=7.0，在115'C高压灭菌锅中灭 菌15分钟，待用。取黄色短杆菌ATCC39106 —环菌体接入斜面活化培养基，放入生化培养 箱，3(TC下培养28小时，在无菌操作台上将斜面活化培养基上的菌体接入事 先配好的发酵培养基中，每瓶接一环菌体，接种完用九层纱布封口，置于旋转 式摇床上，在30'C、 160rmp下发酵42小时后将摇床转速提高至220rmp再发 酵42小时。产"N —L-亮氨酸达20g/1。将上述发酵液离心分离(4000rpm， IO分钟)，所得到的上清液用盐酸调 节pH二2，上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0.1mol/l氨水洗脱，将 得到的L-亮氨酸-"N单斑洗脱液浓縮，活性炭脱色，再结晶并过滤得到的晶体 真空干燥得到L-亮氨酸-"N固体4.22克。经质谱分析得到产品丰度10.19%， 丰度下降小于0.5%，丰度几乎不下降，纯度大于99%，可以满足对高丰度产 品的要求。实施例2:使用菌种为以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌，使用的培养基包括斜 面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶发酵培养基。斜面保藏培养基和斜面活 化培养基同常规发酵采用相同。使用的斜面保藏培养基、斜面活化培养基、摇瓶发酵培养基配方如下所示斜面保藏培养基蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l;斜面活化培养基葡萄糖3g/l，蛋白胨10g/l ，牛肉膏10g/l，氯化钠 5g/l，琼脂20g/l:发酵培养基配方葡萄糖120g/l， ("NH4)2S04("N原子丰度99.67%): 20g/l， MgS04.7H2OL: 6mg/L， MnS04.H20: 2mg/L， FeS04.7H20: 2mg/L， KH2P04: lg/l， VH: 600ug/L， VB6: 100ug/L，泛酸300ug/l，尼克酸400ug/l，蛋白胨3g/l。用500ml三角瓶以20ml的载液量分装发酵培养基。以上培养基均用2mol/l氢氧化钠调节PH = 7.0，在115。C高压灭菌锅中灭 菌15分钟，待用。取谷氨酸棒杆菌ATCC13032 —环菌体接入斜面活化培养基，放入生化培 养箱，3(TC下培养24小时，在无菌操作台上将斜面活化培养基上的菌体接入 事先配好的发酵培养基中，每瓶接一环菌体，接种完用九层纱布封口，置于旋 转式摇床上，在3(TC、 220rmp下发酵80小时。产15N —L-亮氨酸达18g/l。将上述发酵液离心分离(4000rpm， 10分钟)，所得到的上清液用盐酸调 节pH二2，上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0.1mol/l氨水洗脱，将 得到的L-亮氨酸-"N单斑洗脱液浓縮，活性炭脱色，再结晶并过滤得到的晶体 真空干燥得到L-亮氨酸-"N固体5.52克。经质谱分析得到产品丰度99.16%， 丰度下降小于0.5%，丰度几乎不下降，纯度大于99%，可以满足对高丰度产 品的要求。实施例3:使用菌种为以黄色短杆菌ATCC39103为出发菌，使用的培养基包括斜面 保藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、发酵培养基。斜面保藏培养基和 斜面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的斜面保藏培养基、斜面活化培养 基、种子培养基、摇瓶发酵培养基配方如下所示斜面保藏培养基蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l; 斜面活化培养基葡萄糖3g/l，蛋白胨10g/l ，牛肉膏10g/l，氯化钠 5g/l，琼脂20g/l;种子培养基葡萄糖30g/l，尿素lg/l，硫酸铵5g/l， KH2P04 :0.5g/1， 玉米桨20g/l， MgS04.7H20: 5mg/L;发酵培养基配方葡萄糖110g/l， ("NH4)2S04("N原子丰度99.91%):20g/l， MgS04.7H20: 6mg/L， MnS04.H20: 2mg/L， FeS04.7H20: 2mg/L， KH2P04: lg/l， VH: 600ug/L， VB1: 2000ug/L，泛酸200ug/l，尼克酸500ug/l， 玉米桨2g/l。以上培养基均用2mol/l氢氧化钠调节PH=7.0，在115。C高压灭菌锅中灭 菌15分钟，待用。将菌体接种于活化培养基平板上，30'C下生化培养箱中培养30小时，待 菌落长成后，将长好的菌苔接种于已灭菌的各装有50ml种子培养基的2个 500ml摇瓶中，在28-C下摇床培养IO小时，获得种子液。将种子按2% (体积比)接种于已灭菌的装有5000ml发酵培养基的发酵罐 中开始发酵，控制条件温度29'C，通气量1.5VVM,罐压0.02MP，溶解氧90 %，以30% (体积比)"NH3H20调节PH-7.2，并以消泡剂消泡。发酵全过程 控制pH在微碱性(PH控制在7.0 7.5，用添加液氨控制)，流加50%葡萄糖 控制发酵液葡萄糖浓度5%，发酵时间70小时。产"N —L-亮氨酸达18g/l。将上述发酵液离心分离(4000rpm， 10分钟)，所得到的上清液用盐酸调 节pH:2，上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0.1mol/l氨水洗脱，将 得到的L-亮氨酸-"N单斑洗脱液浓縮，活性炭脱色，再结晶并过滤得到的晶体 真空干燥得到L-亮氨酸-"N固体30.18克。经质谱分析得到产品丰度99.66%， 丰度下降小于0.5%，丰度几乎不下降，纯度大于99%，可以满足对高丰度产 品的要求。实施例4:使用菌种为以大肠杆菌ATCC21530为出发菌，使用的培养基包括斜面保 藏培养基、斜面活化培养基、种子培养基、发酵培养基。斜面保藏培养基和斜 面活化培养基同常规发酵采用相同。使用的斜面保藏培养基、斜面活化培养基、 种子培养基、摇瓶发酵培养基配方如下所示斜面保藏培养基蛋白胨10g/l，牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l;斜面活化培养基葡萄糖3g/l，蛋白胨10g/l ,牛肉膏10g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l;种子培养基葡萄糖30g/l，尿素lg/l，硫酸铵5g/l， KH2P04 :0.5g/1， 玉米桨20g/l， MgS04.7H20: 5mg/L;发酵培养基配方葡萄糖130g/l， 。NH4)2S04("N原子丰度99.14%): 20g/l， MgS04.7H20: 5mg/L， MnS04.H20: 2mg/L， FeS04.7H20: 2mg/L， KH2P04: lg/l， VH: 1000ug/L， VB1: 200ug/L，泛酸200ug/l，尼克酸300ug/l，玉米 桨- 3g/l。以上培养基均用2mol/l氢氧化钠调节PH=7.0，在115'C高压灭菌锅中灭 菌15分钟，待用。将菌体接种于活化培养基平板上，3(TC下生化培养箱中培养16小时，待 菌落长成后，将长好的菌苔接种于已灭菌的各装有50ml种子培养基的3个 500ml摇瓶中，在28'C下摇床培养30小时，获得种子液。将种子按5% (体积比)接种于已灭菌的装有3000ml发酵培养基的发酵罐 中开始发酵，控制条件温度32'C，通气量0.5VVM,罐压0.05MP，溶解氧80 %，以30。X (体积比)"NH3H20调节PH-7.2，并以消泡剂消泡。发酵全过程 控制pH在微碱性(PH控制在7.0 7.5，用添加液氨控制)，流加50%葡萄糖 控制发酵液葡萄糖浓度3%，发酵时间55小时。产"N —L-亮氨酸达19g/l。将上述发酵液离心分离(4000rpm， 10分钟)，所得到的上清液用盐酸调 节pH-2，上阳离子交换树脂(H+型)吸附，水洗后用0.1mol/l氨水洗脱，将 得到的L-亮氨酸-"N单斑洗脱液浓縮，活性炭脱色，再结晶并过滤得到的晶体 真空干燥得到L-亮氨酸-"N固体22.32克。经质谱分析得到产品丰度99.06%， 丰度下降小于0.5%，丰度几乎不下降，纯度大于99%，可以满足对高丰度产 品的要求。
权利要求
1. 适用于生产稳定性同位素15N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，该工艺包括以下步骤(1)出发菌株的选取选取适用于L-亮氨酸-15N生产的棒杆菌、短杆菌属，并能采用强制控制工艺控制其细胞膜通透性，包括黄色短杆菌、钝齿棒杆菌、大肠杆菌、粘质赛氏杆菌、谷氨酸棒杆菌；(2)发酵培养配方以全合成培养基为基本培养基，添加少量有机氮源，以葡萄糖为碳源，初始配方中葡萄糖浓度为6～14wt％；以氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等铵盐或尿素为初始氮源，发酵中后期添加尿素、氨水或液氨调节pH来补充氮源，不添加或添加极微量玉米浆、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白水解液、菌体水解液等有机氮源的一种，该有机氮源中氨基氮浓度为5～20g/L；磷酸盐、镁盐、锰盐、亚铁盐等无机盐根据不同菌种添加一定量；发酵初始配方中生物素大大过量，VB1添加50～2000ug/L，VB6添加50～1000ug/L，泛酸添加50～500ug/L，尼克酸添加20～600ug/L；(3)发酵工艺根据产品需求量分别采用摇瓶发酵或发酵罐发酵工艺得发酵液；所述的摇瓶发酵是将菌体接种于活化培养基平板上，30℃下生化培养箱中培养16～30小时，待菌落长成后，将菌体接种于事先灭菌完的发酵培养液中，每瓶发酵培养液接一环菌体，发酵培养液的装液量为装液瓶的3wt％～5wt％，将接种完的发酵培养液置于摇摆式摇床上，发酵温度28～32℃，摇床转速180～240转/分钟，连续发酵72～96小时；所述的发酵罐发酵是将菌体接种于活化培养基平板上，30℃下生化培养箱中培养16～30小时，待菌落长成后，将长好的菌苔接种于已灭菌的装有种子培养基的摇瓶中，在28～32℃下摇床培养10～24小时，获得种子液；发酵初始温度28～33℃，初始pH6.8～7.2，采用大接种量2～10wt％、低糖流加，强制控制发酵工艺，将种子按体积比2～10％接种于已灭菌的装有发酵培养基的发酵罐中开始发酵，控制条件温度29～37℃，通气量0.5～1.5VVM，罐压0.01～0.05MP，溶解氧1～95％，PH7.0～7.5，采用添加液氨方式控制发酵液PH值，并以消泡剂消泡。(4)分离提取发酵液中15N稳定性同位素标记L-亮氨酸的分离采用离子交换法提取得到15N稳定性同位素标记L-亮氨酸溶液，通过真空浓缩赶氨并采用乙醇低温结晶、真空干燥得到产品。
2、 根据权利要求1所述的适用于生产稳定性同位素15N标记L-亮氨酸的 发酵生产工艺，其特征在于，所述的步骤(2)中的培养基包括斜面保藏培养 基、斜面活化培养基、种子培养基、发酵培养基。
3、 根据权利要求2所述的适用于生产稳定性同位素15N标记L-亮氨酸的 发酵生产工艺，其特征在于，所述的斜面保藏培养基的配方为蛋白胨10g/l, 牛肉膏3g/l，氯化钠5g/l,琼脂20g/l。
4、 根据权利要求2所述的适用于生产稳定性同位素15N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺，其特征在于，所述的斜面活化培养基的配方为葡萄糖3g/l， 蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，氯化钠5g/l，琼脂20g/l。
5、 根据权利要求2所述的适用于生产稳定性同位素15N标记L-亮氨酸的 发酵生产工艺，其特征在于，所述的种子培养基的配方为葡萄糖30g/l，尿素lg/1,硫酸铵5g/l， KH2P04 : 0.5g/l，玉米桨20g/l， MgS04.7H20: 5mg/L。
6、 根据权利要求1所述的适用于生产稳定性同位素15N标记L-亮氨酸的 发酵生产工艺，其特征在于，所述的步骤(2)中有机氮源的添加量为0.2wt% 以下。
7、 根据权利要求1所述的适用于生产稳定性同位素15N标记L-亮氨酸的 发酵生产工艺，其特征在于，所述的步骤(2)中发酵初始配方中生物素大大 过量，添加纯生物素100~1000ug/L。
8、 根据权利要求1所述的适用于生产稳定性同位素15N标记L-亮氨酸的 发酵生产工艺，其特征在于，所述的步骤(3)中发酵罐发酵全过程控制pH在 微碱性，pH用添加液氨控制在7.0 7.5，流加50wt^葡萄糖控制发酵液葡萄 糖浓度3 6wt^，发酵时间32 70小时。
全文摘要
本发明涉及适用于生产稳定性同位素¹⁵N标记L-亮氨酸的发酵生产工艺，该工艺包括以下步骤(1)出发菌株的选取(2)发酵培养配方(3)发酵工艺(4)分离提取。与现有技术相比，本发明获得的¹⁵N稳定性同位素标记L-亮氨酸产酸量高，¹⁵N稳定性同位素标记L-亮氨酸¹⁵N丰度下降少，有的甚至不下降，简化了发酵和提取工艺，大大节省了原料，降低了成本。
文档编号C12P13/00GK101235402SQ20071003705
公开日2008年8月6日 申请日期2007年2月1日 优先权日2007年2月1日
发明者亮 张, 李良君, 杜晓宁, 诚 赵 申请人:上海化工研究院